Summary
Vi presenterar ett robust, överförbart och prediktivt in vitro-exponeringssystem för screening och övervakning av luftburna partiklar om deras akuta pulmonell cytotoxicitet genom att exponera odlade mänskliga lungceller vid luftvätskegränssnittet (ALI).
Abstract
Här presenterar vi ett specialdesignat modulärt in vitro-exponeringssystem som möjliggör homogen exponering av odlade mänskliga lungceller vid ALI för gaser, partiklar eller komplexa atmosfärer (t.ex. cigarettrök), vilket ger realistisk fysiologisk exponering av den apikala ytan av den mänskliga alveolarregionen för luft. I motsats till sekventiella exponeringsmodeller med linjär aerosolvägledning uppfyller den modulära utformningen av det radiella flödessystemet alla krav för kontinuerlig generering och transport av testatmosfären till cellerna, en homogen fördelning och deposition av partiklarna och kontinuerligt avlägsnande av atmosfären. Denna exponeringsmetod är främst utformad för exponering av celler för luftburna partiklar, men kan anpassas till exponeringen av flytande aerosoler och mycket giftiga och aggressiva gaser beroende på aerosolgenereringsmetoden och materialet i exponeringsmodulerna .
Inom ramen för en nyligen avslutad valideringsstudie har detta exponeringssystem bevisats som en överförbar, reproducerbar och prediktiv screeningmetod för kvalitativ bedömning av luftburna partiklars akuta pulmonellcytotoxicitet, och därmed potentiellt minska eller ersätta djurförsök som normalt skulle ge denna toxikologiska bedömning.
Introduction
Inandning av giftiga luftburna partiklar är ett folkhälsoproblem, vilket leder till en mängd hälsorisker över hela världen och många miljoner dödsfall årligen1,2. Klimatförändringarna, den pågående industriella utvecklingen och den ökande efterfrågan på energi, jordbruks- och konsumentprodukter har bidragit till ökningen av lungsjukdomar under de senaste åren3,4,5,6. Kunskap och utvärdering av inandningsbara ämnen när det gäller deras akuta inandningstoxicitet utgör grunden för riskbedömning och riskhantering, men denna information saknas fortfarande för ett brett spektrum av dessa ämnen7,8. Sedan 2006 kräver EU:s kemikalielagstiftning Reach (registrering, utvärdering, tillstånd och begränsning av kemikalier) att redan befintliga och nyligen införda produkter genomgår en toxikologisk karakterisering, inklusive inhalationsvägen innan de släpps ut på marknaden. Reach fokuserar därför på alternativa och djurfria metoder, genomförandet av 3R-principen (ersättning, förfining och minskning av djurförsök) och användning av lämpliga in vitro-modeller9. Under de senaste åren har många olika och adekvata icke-djurinande toxicitetstestmodeller (t.ex. in vitro-cellkulturer, lung-on-a-chip-modeller, precisionssnitt lungskivor (PCLS)) utvecklats för att bedöma den akuta inhalationstoxiciteten hos luftburna partiklar5,7,10,11. När det gäller in vitro-cellsodlingsmodeller kan odlade celler exponeras under nedsänkta förhållanden eller vid ALI(figur 1). Giltigheten av studier med nedsänkt exponering är dock begränsad när det gäller utvärderingen av toxiciteten hos luftburna föreningar, särskilt partiklar. Metoder för nedsänkt exponering motsvarar inte den mänskliga in vivo-situationen. Cellodlingsmediet som täcker cellerna kan påverka de fysikalisk-kemiska egenskaperna och därmed de toxiska egenskaperna hos ett testämne12,13. ALI in vitro inhalationsmodeller möjliggör direkt exponering av celler på testämnena utan störningar i cellodlingsmediet med testpartiklar, vilket härmar exponeringen hos människor med högre fysiologiska och biologiska likheter än nedsänktexponering12,14.
För regleringsprocesser som Reach finns dock endast djurmodeller tillgängliga inom området akut inhalationstoxikologi, eftersom inga alternativa in vitro-metoder har validerats tillräckligt och officiellt accepterats hittills14. För detta ändamål måste testmodeller valideras i enlighet med kraven i Europeiska unionens referenslaboratorium för alternativ till djurförsök (EURL-ECVAM) principer om testgiltighet15.
En tidigare prevalideringsstudie och en nyligen avslutad valideringsstudie visade framgångsrikt tillämpningsområdet för CULTEX RFS-exponeringssystemet och dess överlåtbarhet, stabilitet och reproducerbarhet13. Detta exponeringssystem är ett in vitro-cellbaserat exponeringssystem som möjliggör homogen exponering av celler för gaser, partiklar eller komplexa atmosfärer (t.ex. cigarettrök) vid ALI på grund av dess radiella aerosoldistributionskoncept och testaerosolens genomförande i ett kontinuerligt flöde över cellerna16. Grundmodulen i detta radiella flödessystem består av inloppsadaptern, aerosolstyrmodulen med radiell aerosolfördelning, provtagnings- och socketmodulen och en låsmodul med handhjul (figur 2). De genererade partiklarna når cellerna via inloppsadaptern och aerosolledstången och deponeras på cellodlingsskären, som finns i provtagningsmodulens tre radiellt arrangerade exponeringskammare. Aerosolens styrmodul samt provtagningsmodulen kan värmas upp genom att ansluta till ett externt vattenbad17.
Inom ramen för båda studierna användes A549-celler för alla exponeringsexperiment. Cellinjen A549 är en humanförevigad epitelcellinje som är mycket välkarakteriserad och har använts som en in vitro-modell för typ II alveolar epitelceller i många toxikologiska studier. Cellerna kännetecknas av lamellar kroppar, produktion av ytaktiva och ett antal inflammation-relevanta faktorer18. De visar också egenskaper bronkial epitelceller på grund av deras slem produktion19. Dessutom kan de odlas på ALI. Även om denna cellinje är brist på att bygga cell-cell kontakter, är odling av dessa celler mycket bekvämare, billigare dyra och resultat som härrör därav är givaroberoende jämfört med primära celler20.
A549 celler var seedade i 6-brunn cell odling skär (PET membran, 4,67 cm2,por storlek 0,4 mm) med en densitet på 3,0 x 105 celler per skär och odlas för 24 h under nedsänkta förhållanden. Celler exponerades sedan i tre oberoende laboratorier för ren luft och tre olika exponeringsdoser (25, 50 och 100 μg/cm2)av 20 testämnen vid ALI. Exponeringsdosen är korrelerad till deponeringstiden, vilket resulterar i en konstant partikelhastighet på 25 μg/cm2,50 μg/cm2 och 100 μg/cm2 på cellerna efter 15, 30 respektive 60 min. De deponerade partiklarna tvättades dock inte av efter nedfall, utan förblev på cellerna i 24 timmar. Partiklarnas nedfall var därför 15, 30 och 60 min, men cellernas exponering varade i totalt 24 timmar. Testämnenas nedfall spåddes i preliminära experiment enligt tidigare metoder17.
Celllönsamhet som en indikator på toxicitet bedömdes 24 timmar efter partikelnedfall med hjälp av en celllönsamhetsanalys. Särskild vikt lades på kvaliteten på ren luft kontroller, optimering och förfining av exponeringsprotokollet, intra- och inter-laboratory reproducerbarhet och inrättandet av en förutsägelse modell (PM). Ämnen som ledde till en minskning av celllönsamheten under 50 % (PM 50%) eller 75% (PM 75%) vid någon av de tre exponeringsdoserna ansågs utöva en akut inandningsrisk. Resultaten jämfördes sedan med befintliga in vivo-data (baserat på minst en tillförlitlig studie enligt OECD:s testriktlinje (TG) 403 eller TG 43621,22), vilket ledde till en övergripande överensstämmelse på 85 %, med en specificitet på 83 % och en känslighet på 88 %23.
Förutom mätning av celllivskraft kan andra effektmått som cytokinfrisättning, undersökning av celllysat eller membranintegritet via LDH-analys bedömas men inte krävdes för valideringsstudien. Exponeringssystemet (t.ex. CULTEX RFS) har således bevisats som ett prediktivt screeningsystem för kvalitativ bedömning av den akuta inhalationstoxiciteten hos de testade luftburna partiklarna, vilket motsvarar en lovande alternativ metod för djurförsök. Följande protokoll rekommenderas för exponeringsexperiment för luftburna partiklar som använder detta exponeringssystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
PROTOKOLLET för ett exponeringsexperiment omfattar en period på tre dagar.
Dag 1
1. Allmänna beredningar och odling av celler
OBS: Den mänskliga lungadenokarcinomepitelcellinjen A549 användes för exponeringsexperiment. Cellerna måste hanteras under sterila förhållanden. Andra cellinjer som är lämpliga för odling vid ALI kan användas.
- Förbered tillväxtmediet (Dulbeccos minsta essentiella medium (DMEM), kompletterat med 10% fetalt bovinserum (FBS) och 5 μg/mL gentamycin) och exponeringsmediet (DMEM, kompletterat med 5 μg/mL gentamycin och en slutlig HEPES-koncentration på 100 mM).
- Kultur A549 celler i tillväxtmedium vid 37 °C i en fuktad atmosfär som innehåller 5% CO2.
- Odla celler i cellodlingskolv en 75 cm2 (T-75) i 14 ml tillväxtmedium tills ett sammanflöde på 80-90 % innan delning (var 2-3 dagar) och en passage på 35.
- Beräkna fjädringsvolymen och det erforderliga antalet cellodlingsskär (tre cellodlingsskär som inkubatorkontroller och cellodlingsskär för ren luft- och partikelexponering) och cellodlingsplattor.
- Innan trypsinization och sådd av celler, tillsätt 2,5 ml härdat tillväxtmedium till varje brunn av en 6-brunn tallrik. Placera cellodlingsskären utan celler försiktigt inuti brunnarna och lägg till 1 ml tillväxtmedium till varje cellodlingsskär. Inkubera 6-brunnsplattorna i minst 30 min i inkubatorn (37 °C, 5 % CO2).
2. Trypsinization av celler
- Temper fosfat buffrad saltlösning (PBS) och tillväxtmedium vid 37 °C och trypsin/EDTA (0,05%/ 0.02%) lösning i rumstemperatur.
- Aspirera cellodlingsmediet från cellodlingskolven och tvätta cellerna försiktigt med 8 ml förvärmd pbs.
- Ta bort PBS, lägg till 2 ml av trypsin/EDTA (0,05%/ 0.02%) lösning på cellerna och inkubera för maximal 6 min. i inkubatorn vid 37 °C. Kontrollera avlossningsprocessen under mikroskopet.
- Neutralisera trypsinaktiviteten genom att lägga till 8 ml förvärmt tillväxtmedium, lossa cellerna genom att försiktigt knacka i sidled på kolven och återsuspendera cellerna genom upprepade rörledningar upp och ner.
- Överför cellfjädringen till ett 50 ml-rör. Bestäm cellnumret för ytterligare procedur (t.ex. sådd av celler, cellpassage).
3. Bestämning av cellnummer
Cellkoncentration fastställdes med hjälp av en cellräknare eller räknekammare.
- Späd 100 μL av cellodlingsfjädring i en kopp fylld med 10 ml isotonisk lösning. Luta koppen långsamt utan att skaka.
- Bestäm antalet livskraftiga celler/ml och celllivskraft baserat på cellspecifika mätparametrar för A549-celler.
4. Sådd av celler på mikroporösa membran i cellodlingsskär
EXPONERINGSsystemet är utrustat med speciella adaptrar för att möjliggöra användning av kommersiella skär från olika leverantörer och av olika storlekar. För dessa exponeringsexperiment användes 6-brunnsplattor och motsvarande cellodlingsskär. Alla arbetssteg måste göras under sterila förhållanden.
- Ge förvärmt tillväxtmedium under sterila cellodlingsförhållanden (laminflöde).
- Förbered en tillräckligt hög volym av cellsuspensionen med en cellkoncentration på 3,0 x 105 celler/ml.
- Efter att ha mildrat plattorna i 30 min, aspirera mediet i cellodlingen skär och utsäde 1 ml A549 celler med en densitet på 3,0 x 105 celler/ml i varje cellodlingsinsats. Fördela cellfjädringen genom mild gungning.
- Inkubera cellkulturen skär med cellsuspensionen för 24 h (37 °C och 5% CO2).
5. Pressning av testämnen
OBS: Testämnen pressades in i pulverkakor med hjälp av en fullt kontrollerbar hydraulisk press. Presspaketet kan applicera en maximal kraft på 18 kN, som visas som tryckpaketets nuvarande oljetryck (i baren). Tryckförhållanden (presstryck, presstid) av okända testämnen måste fastställas och karakteriseras i preliminära tester. Beroende på pressegenskaperna hos ett ämne kan olika pressparametrar och typer av presskolv användas.
VARNING: Använd skyddsutrustning vid pressning av giftiga eller farliga ämnen.
- Ställ in presstiden via tidskontrollen på framsidan av pressen.
- Öppna tryckluftstillförseln vid tryckluftsventilen. Ställ in tryckluftstrycket på ca 2 bar (indikerat av en tryckmätare på framsidan) med tryckregulatorn på framsidan av pressen eller på tryckluftsventilen på trycklufttillförseln. Dra ut lådan, tryck på tryckknappen och läs presstrycket på den digitala tryckbrytaren.
- Läs bara trycket vid tryckregulatorn om trycket är för högt eller för lågt.
- Montera ämnesbehållaren och se till att glascylindern är korrekt centrerad (Kompletterande figur 1). Fyll ämnesbehållaren med en liten mängd av testämnet. För in kolven i ämnesbehållaren och vrid den något fram och tillbaka för att jämnt fördela pulvret i behållaren.
- Placera ämnesbehållaren med kolven i lådan och tryck på tryckknappen. Tryckpå kolven på trycket rör sig på kolven och utövar ett tryck på testämnet för den inställda presstiden. Öppna lådan och ta bort kolven.
- Upprepa steg 5.3 och 5.4 tills ämnesbehållaren är minst halvfull.
- Efter avslutad pressning, ta bort ämnesbehållaren från lådan och vrid den upp och ner för att ta bort lösa och deponerade partiklar.
- Om ämnesbehållaren inte behövs samma dag, stäng ämnesbehållaren med parafilm för att förhindra att testämnet torkar ut eller absorberar fukt.
Dag 2
6. Montering av exponeringssystemet och anslutning av kringutrustning
ANMÄRKNING: En mer detaljerad vy finns i figur 3, kompletterande figur 2 och kompletterande figur 3. Montera både moduler och aerosolgeneratorn enligt tillverkarens anvisningar.
- Placera exponeringssystemet på en fast och jämn yta, med vattentillförseln vänd framåt. Anslut massflödesstyrenheterna med aerosolgeneratorn och en trehalsad flaska ansluten till modulen för ren luftexponering.
- Anslut flödesregulatorn och vakuumpumpen. Anslut rören från flödesstyrenheterna med rörkontakten på aerosolstyrmodulens bilagor. Anslut rören på andra sidan flödesregulatorerna med vakuumpumpen. Se till att flödet går från modulen genom flödesstyrenheterna till vakuumpumpen.
- Anslut vattenbadet med värmevattentillförseln. Vattenförsörjningen går från vattenbadet till vatteninloppet på aerosolens styrmodul. Anslut vattenutloppet för aerosolstyrmodulen med provtagningsmodulens vatteninlopp. Stäng cirkeln med en anslutning från provtagningsmodulens vattenutlopp till vattenbadet.
- Placera aerosolgeneratorn inklusive elutriator nära exponeringsmodulen och anslut elutriatorns överskottslinjer och exponerings- och renluftsmodulen med stora mikrofilter och sugavexponeringskamrarna med små mikrofilter (t.ex. engångsfilter). Elutriator fungerar som en reservoar för den genererade partikelatmosfären och behåller partiklar som är större än ca 7 μm, medan mindre partiklar transporteras till exponeringsmodulen.
- Anslut den dator som används för att styra aerosolgenereringen till usb-porten på aerosolgeneratorns topp via en USB-kabel och strömförsörjningen till strömförsörjningsporten. Anslut nätkontakten på nätaggregatet till ett uttag (220-240 V).
- Anslut rören för medium leverans och borttagning med två pumpar. Istället för att använda en pump för medelhög tillförsel, kan mediet också fyllas manuellt.
7. Förberedelse för ren luft- och partikelexponering
- Slå på vakuumpumpen, flödesregulatorerna och vattenbadet (37 °C) under en uppvärmningsperiod på minst 30 minuter.
- Öppna tryckluftstillförseln. Ställ in massflödesstyrenheterna till 8 L/min för matarledningen till aerosolgeneratorn och till 3 L/min för matarledningen till den trehalsade flaskan. Stäng flikarna för massflödesstyrenheterna.
OBS: Dessa värden kan variera beroende på testämnets egenskaper. - Justera flödesregulatorerna via datorn för att reglera modulflödet (1,5 L/min) och kammarsugningen (30 ml/min).
8. Läckageprovning av det radiella flödessystemet
OBS: Läckagekontrollen måste utföras under vakuum och för båda modulerna (exponering och ren luftmodul) för att säkerställa att modulen har monterats på rätt sätt.
- Ta bort inloppsadaptern och kondensareflektorn från aerosolledningsmodulen. Stäng de tre aerosolmatningsborren i aerosolstyrmodulen med pluggar och de medeltunga anslutningsanslutningarna vid provtagningsmodulen med dummyklaffar.
- Anslut vakuumlinjerna utan filtret med rörkontakten på aerosolstyrmodulen. Stäng modulen med hjälp av handhjulet och mät värdet på flödesstyrenheterna. Värdena ska minska några minuter efter stängning under 5 ml/min.
- Efter ogenomtränglighetskontrollen, ta bort alla pluggar och dummyklaffar, sätt in inloppsadaptern och kondensareflektorn i aerosolstyrmodulen och anslut rören för medelhög tillförsel och borttagning.
9. Aerosol generation
- Starta datorn och programvaran(kompletterande bild 4). Starta aerosolgeneratorn genom att dubbelklicka på aerosolgeneratorstartknappen på datorns skrivbord. Ett meddelandefönster visas och frågar om inställningarna ska återställas eller inte. Klicka på Ja om programvaran startas för första gången den dagen. Ange värdena för bildposition och skrapplats till standardvärdena. Klicka på Nej om du vill behålla värdena för bildposition och skrapplats eller så är bilden inte i utgångsläget.
- Skruva in en ämnesskrapa i röret, som sitter i den centrala öppningen av aerosolgeneratorns topp.
OBS: Beroende på pressegenskaperna kan olika typer av ämnesskrapa användas. - Använd knappen Homing Mode om ämnesskrapan inte är i det lägsta läget.
- Placera ämnesbehållaren med det pressade testmaterialet upp och ner över ämnesskrapan. Se till att glasbehållaren vänd mot framsidan. Se till att de två hålen i ämnesbehållaren passar in på aerosolgeneratorns två stift. Placera låsplattan i facket över ämnesbehållaren och dra åt den svarta skruven.
- Ändra värdena för Matning (0,24 till 20 mm/h) och Rotation (1 till 800 varv/h) till önskade inställningar. Partikelkoncentrationen kan ändras genom att öka eller minska matningsvärdet eller transportgasflödet.
- Använd de nedåtriktade pilarna för att trycka ner glidningen med ämnesbehållaren tills ämnesskrapan är nära det pressade ämnet.
- Öppna tryckluftstillförseln till aerosolgeneratorn med en kran av massflödesregulatorn och starta aerosolgenereringen genom att klicka på Start-knappen. Ställ in matningshastigheten till 15-20 mm/h för att undvika långa väntetider.
- Styr rätt partikelgenerering genom att observera det fina dammmolnet med en liten ficklampa (placerad underifrån bakom elutriatorns glasrör). Ändra värdet för Feed tillbaka till önskade inställningar när den första aerosolångan kontinuerligt når Elutriator och klicka på stoppknappen.
10. Exponeringsexperiment
- Starta mellantillförseln med förvärmd exponeringsmedium och fyll provtagningsmodulerna tills nedrören är täckta medan modulen är öppen. Använd medelpumpen eller fyll mediet manuellt (25 ml per enskild exponeringskammare).
- Infoga infogad cellkultur (skär utan celler) i exponeringsmodulen. Pumpa exponeringsmediet nedåt tills rören är täckta med medium och skärens nedre sida är i kontakt med mediet.
- Starta aerosolgeneratorn, stäng exponeringsmodulen och anslut exponeringsmodulen till aerosolgeneratorns exponeringsmodulutlopp. Ge aerosolgeneratorn en ledtid på minst 20-30 min innan exponeringarna påbörjas för att möjliggöra en stabil generering av partiklar.
- Förbered postinkubationsplattorna för inkubatorns kontroller och de exponerade cellodlingsskärna under ledtiden. Tillsätt 1,5 ml tillväxtmedium per brunn och inkubera plattorna i inkubatorn (37 °C, 5% CO2).
- Efter ledtiden, försegla exponeringsmodulen utlopp elutriator med en gummiplugg och ta bort blinda skär. Fyll på exponeringsmediet (med hjälp av pumpen eller manuellt) tills nedrörarna är täckta med medium. Nu öppnar även tryckluftstillförseln till den rena luftmodulen med kranen av massflödesstyrenheten (3 L/min)
- Ta bort cellodlingsskären från 6-brunnsplattorna med hjälp av en pincett. Häll tillväxtmediet försiktigt från cellodlingen skär av genom att störta skären och aspirera och kassera den återstående vätskan med hjälp av en pipett. Placera skären i exponeringskamrarna i båda modulerna, exponeringen och den rena luftmodulen.
- Stäng modulerna och starta exponeringsexperimenten genom att ansluta exponeringsmodulen till aerosolgeneratorns exponeringsmodul utlopp och den rena luftmodulen till transportörens gasförsörjning samtidigt.
OBS: Partikelkoncentrationen kan ändras genom att öka/minska matningsvärdet, transportföretagets gasflöde eller exponeringstiden. - Koppla bort exponerings- och rena luftmoduler efter att experimentet har slutförts och försegla exponeringsmodulstället.
- Stoppa tryckluftstillförseln och aerosolgeneratorn genom att klicka på stoppknappen.
- Öppna exponerings- och ren luftmodulen och överför cellodlingsskären till de förberedda postinkubationsplattorna med hjälp av en pincett. Inkubera 6-brunnsplattorna för 24 h (37 °C, 5% CO2) vid ALI.
Obs: Upprepa steg 10,5 -10,10 om ytterligare exponeringsexperiment planeras. - Lyft cellodlingsskären, som används som inkubatorkontroller till ALI under samma förhållanden som de exponerade cellodlingsskärna och inkubera dem för 24 h (37 °C, 5 % CO2) vid ALI.
- Använd knappen Homing Mode för att ta bort ämnesbehållaren. Stäng aerosolgeneratorns programvara genom att klicka på X i det övre högra hörnet och stäng av datorn.
- Efter avslutad exponeringsexperiment rengör du aerosolgeneratorn och båda exponeringsmodulerna. Stäng ämnesbehållaren med parafilm om testämnet kommer att användas ytterligare inom de närmaste dagarna.
Dag 3
11. Celllivskraft
OBS: Celllönsamheten fastställdes 24 h efter partikelnedfall genom att mäta mitokondriell aktivitet med hjälp av WST-1-analysen. Analysen utfördes enligt tillverkarens protokoll. Celllönsamhetkan också bestämmas med hjälp av andra celllönsamhetstester (t.ex. XTT).
- Temper tillväxt medium vid 37 °C och tina WST-1-lösningen skyddad från ljus. Förbered ett lämpligt antal nya 6-brunnsplattor med 2,5 ml tillväxtmedium per brunn och inkubera plattorna i inkubatorn.
- Förbered WST-1-utspädningen genom att späda ut en tillräcklig mängd WST-1 1:7 i tillväxtmedium
- Sätt in cellkulturen sätter in 24 h efter exponering i de nya beredda 6-brunnsplattorna. Lägg till 1 ml av den nyberedda WST-1-lösningen till varje cellodlingsins. Häll plattorna noggrant för att fördela lösningen homogent på cellerna. Inkubera 6-brunnsplattorna med cellodlingsskärför 1 h (37 °C, 5% CO2).
- Överför 100 μL av supernatanterna i triplicater från varje 6-brunn till en 96-brunnsplatta. Mät absorbansen vid 450 nm med en referensvåglängd på 650 nm med hjälp av en mikroplattaläsare.
12. Statistik
- Normalisera celllönsamheten hos de enskilda inkubatorns kontroller till 100%.
- Uttryck de exponerade cellernas livskraft i förhållande till de enskilda inkubatorns kontroller. Cytotoxicitet av testämnen jämfördes med respektive inkubatorkontroller och användes som en indikator på toxicitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CULTEX RFS är ett specialdesignat modulärt in vitro-exponeringssystem som möjliggör direkt och homogen exponering av celler vid ALI. Inom en tidigare undersökning före validering visades den allmänna tillämpligheten av detta exponeringssystem och dess överförbarhet, stabilitet och reproducerbarhet. I ett nyligen genomfört forskningsprojekt finansierat av det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning, var exponeringssystemet framgångsrikt valideras och etablerades som en förutsägelse modell (PM) för akut inhalationsrisker av de testade föreningarna. Eftersom kvaliteten på kontrollerna för ren luft visade sig vara en kritisk parameter under förvalideringsstudien genomfördes flera protokoll- och metodoptimeringar (t.ex. byte av cellodlingsskär, stabilisering av exponeringsmediets pH genom att öka HEPES-koncentrationen till 100 mM) i början av valideringsstudien, vilket ledde till mycket stabila och reproducerbara resultat och en betydande förbättring av data för ren luftlivskraft i alla tre laboratorierna (figur 4). A549 celler exponerades sedan vid ALI för tre olika exponeringsdoser (25, 50 och 100 μg/cm2)av 20 förvalda och kodade testämnen i de tre oberoende laboratorierna och cytotoxicitet (används som en indikator på toxicitet) jämfördes med respektive inkubatorkontroller. Tretton kodade ämnen testades därmed i triplicater, sju kodade ämnen som enstaka experiment. Testämnen ansågs utöva en akut inhalationsrisk när celllönsamheten minskade under 50 % (PM 50%) eller 75% (PM 75%).
Som visas exemplariskt i figur 5,exponering av A549 celler till olika testämnen uppvisade nej, medium eller en stark toxicitet. Eftersom alla experiment utfördes självständigt i tre laboratorier analyserades data om reproducerbarheten inom och mellan laboratorierna och exponeringssystemets prediktivitet. Beroende på den tillämpade PM (PM 50% eller PM 75), inom laboratoriet och mellan laboratoriet reproducerbarhet varierade från 90-100%, vilket visar robusthet och överförbarhet av denna metod. Eftersom alla testade ämnen hade relevanta tillgängliga referensdata för in vivo (baserat på minst en tillförlitlig studie enligt OECD TG 403 eller TG 436 med hjälp av ett traditionellt LC50-protokoll och ett koncentrationx-time (C x t)-protokoll), jämförelse av vivo- och in vitro-data visade en övergripande konkoriering på 85 % (17/20) med en specificitet på 83 % (10/12) och en känslighet på 85 % (7/8)(tabell 1). Endast två ämnen klassificerades som falskt positiva och ett som falskt negativt.
Sammanfattningsvis presenterar våra resultat av valideringsstudien en överförbar, reproducerbar och prediktiv screeningmetod för kvalitativ bedömning av den akuta lungcytotoxiciteten hos de utvalda luftburna partiklarna.
Figur 1: Exponering av celler vid ALI eller under nedsänkta förhållanden. A549 celler kan antingen exponeras med ett testämne (blå pilar och prickar) vid ALI (vänster) genom ett inlopp av exponeringssystemet eller med testämnet utspädd i exponeringsmedium (blå prickar) som skapar submerseförhållanden (höger). Röda prickade linjer representerar fyllningsnivåerna för exponeringsmedium (klarrött) i respektive experimentell inställning. Denna siffra har ändrats från Tsoutsoulopoulos m.fl. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Exponeringsmodulen. Schematisk översikt över grundmodulen i det radiella flödessystemet bestående av inloppsadaptern, aerosolledlmodulen, provtagnings- och socketmodulen och en låsmodul med ett handhjul. Denna siffra har ändrats från Aufderheide et al.17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Översikt över exponeringssystemet. Komponenterna är de två exponeringsmodulerna för ren luft- och partikelexponering, aerosolgeneratorn inklusive elutriator och motsvarande styrenhet samt medelpumpar. Denna siffra har ändrats från Aufderheide et al.17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Rengöringsdata efter optimering av testmetoden. Exponering av celler för ren luft ledde till någon minskning av celllönsamheten över tiden, vilket ledde till en betydande förbättring av data om ren luftskraft jämfört med studien före valideringen. Alla rena luftreglage har poolats för varje laboratorium (Lab 1-3) och exponeringstid (n = 46 per laboratorium och tidpunkt). Data visas som boxplots med en medianlinje och det intervall som anges av morrhår. Denna siffra har ändrats från Tsoutsoulopoulos m.fl.23. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Exponering av A549-celler för olika testämnen. (A)Exponering av A549-celler för volfram(IV) karbid visade ingen minskning av celllönsamheten för de tre olika exponeringsdoserna och verkade vara giftfri (n = 3 per laboratorie- och exponeringsdos). (B)Exponering av celler till tetrabromophthalic anhydrid resulterade för alla laboratorier i måttlig toxicitet som uppvisar en bra dosresponskurva (n = 1 per laboratorie- och exponeringsdos). (C)Zinkdimmetyldithiocarbamat uppvisade en stark toxicitet, vilket ledde till minskad celllönsamhet redan efter en deponerad dos på 25 μg/cm2 (n = 3 per laboratorie- och exponeringsdos). Felstaplar representerar standardavvikelser. Denna siffra har ändrats från Tsoutsoulopoulos m.fl.23. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Referensresultat in vivo | Resultat in vitro | |||||
| Ämne | OECD TG | CLP-reglering | Toxicitet | PM50% | PM75% | Enlighet in vivo / in vitro |
| Volfram(IV) karbid | 403 | n. c. | 0 | 0 | 0 | Ja |
| Volfram (IV) hårdmetall nano | - | n. c. | 0 | 0 | 0 | Ja |
| N,N'-etylenbis(N-acetylacetamide) | EPA OPPTS 870.1300 | n. c. | 0 | 0 | 0 | Ja |
| Kiseldioxid | 403 | n. c. | 0 | 0 | 0 | Ja |
| Diammonium hydrogenortho-fosfat | 403 | n. c. | 0 | 0 | 0 | Ja |
| Disnatriumfluoratosfat | 403 | n. c. | 0 | 0 | 0 | Ja |
| Neodymoxidoxid | 436 | n. c. | 0 | 0 | 0 | Ja |
| Monopersulfat för kaliumväte | 403 | n. c. | 0 | 0 | 0 | Ja |
| Cyclohepta-pentylos | 403 | n. c. | 0 | 0 | 0(2x) / 1(1x) | - Jag vet inte vad du ska göra. |
| Vanadin(III) oxid | 403 | n. c. | 0 | 0 | 0(2x) / 1(1x) | - Jag vet inte vad du ska göra. |
| Tetrakaliumpyrofosfat | 403 | n. c. | 0 | 1 | 1 | Nej |
| Tetra-bromophthalic anhydrid | 403 (liknande) | n. c. | 0 | 1 | 1 | Nej |
| Cetylpyridinklorid | 403 | Akut Tox. 2 | 1 | 1 | 1 | Ja |
| N-Lauroylsarcosinnatriumsalt | 403 | Akut Tox. 2 | 1 | 1 | 1 | Ja |
| Zink dimetyldithio-karbinat | 403 | Akut Tox. 2 | 1 | 1 | 1 | Ja |
| Koppar(II) hydroxid | 403 | Akut Tox. 2 | 1 | 1 | 1 | Ja |
| Zinkselenit | 436 | Akut Tox. 3 | 1 | 1 | 1 | Ja |
| Natriummetavanadate | 403 | Akut Tox. 4 | 1 | 1 | 1 | Ja |
| Divanadiumpentaoxid | 403 | Akut Tox. 4 | 1 | 1 | 1 | Ja |
| Kadmiumtelluride | 403 | Akut Tox. 4 (n. c.) | 1 | 0 | 0 | Nej |
| n. c. = ej klassificerad; 0 = giftfri; 1 = giftig; CLP = klassificering, märkning och förpackning | ||||||
Tabell 1: Överensstämmelse mellan in vivo och in vitro-resultat. Av 20 ämnen klassificerades 10 ämnen som korrekt negativa och sju ämnen korrekt som positiva, vilket ledde till en överensstämmelse på 85 % (17/20). Detta bord har ändrats från Tsoutsoulopoulos m.fl.23. (Test nr 403: Akut inandning toxicitet, test nr 436: Akut inandning toxicitet - akut toxisk klass metod; Akut Tox. 2 = dödlig, akut Tox. 3 = giftig, akut tox. 4 = skadligt).
Kompletterande figur 1: Montering av ämnesbehållaren. Bild tagen från CULTEX DG (Dust Generator) Bruksanvisning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 2: Aerosols styrmodul i exponeringssystemet. A) Ovanbild och B) nedre vyn av aerosolstyrmodulen. Bild tagen från CULTEX RFS (Radial Flow System) Bruksanvisning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 3: Aerosolgeneratorn. A) Schematisk översikt över aerosolgeneratorn, bestående av aerosolgeneratorns topp och Elutriator. Detaljerad vy över B) aerosolgeneratorn stoppen och C) Elutriator. Bild tagen från CULTEX DG (Dust Generator) Bruksanvisning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 4: Aerosolgeneratorns styrprogram. Bild tagen från CULTEX DG (Dust Generator) Bruksanvisning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Många icke-djurinande toxicitettestmodeller har utvecklats under de senaste åren för att få information om den akuta inhalationsrisken för inandningsbara partiklar och för att minska och ersätta djurförsök enligt 3R-principen25.
När det gäller cellodlingsmodeller kan exponering av celler göras under nedsänkta förhållanden eller vid ALI. Att exponera celler under nedsänkta förhållanden kan påverka de fysikalisk-kemiska egenskaperna och därmed de toxiska egenskaperna hos ett testämne12. In vitro ALI inhalationsmodeller, dock efterlikna den mänskliga exponeringen situationen med högre biologisk och fysiologisk likhet än nedsänkt exponering och är därför bättre lämpade för att analysera den akuta inandning toxicitet luftburna partiklar. Betydelsen av CULTEX RFS med avseende på andra befintliga exponeringsmoduler är inte bara exponeringen av celler under ALI-förhållanden utan också den mycket homogena fördelningen och nedfallet av partiklar. I motsats till sekventiella exponeringsmodeller med linjär aerosolvägledning möjliggör den modulära utformningen av denna exponeringsmetod en radiell matarledning som leder till ett mycket homogent nedfall av partiklar på cellerna17.
Den viktigaste punkten för framgångsrika exponeringsexperiment är den stabila och kongruenta kvaliteten på de rena luftkontrollerna. Särskild uppmärksamhet måste ägnas åt att de rena luftkontrollernas livskraft inte påverkas över tiden och så nära som möjligt till 100 procent jämfört med motsvarande inkubatorkontroller. Faktorer som spelar en viktig roll när det gäller ren luftlivskraft är valet av lämpliga cellodlingsskär, exponeringsmediets pH-värde och den rena luftens sammansättning. När det gäller cellodlingskär måste en god kvalitet och en hög täthet av porer garanteras. Detta säkerställer en bättre medelhög tillförsel och en högre relativ luftfuktighet inuti cellodlingsskären, vilket skyddar cellerna från torkring26. Genom att använda cellodlingsskär med sidoväggöppningar måste speciella skärärmar användas för att undvika läckage av testpartiklar genom sidoväggöppningarna vilket kan leda till en eventuellt kontaminering av exponeringsmediet. En förskjutning av pH-värdet högre än 8 kan redan ha en toxisk effekt på cellerna och därmed leda till en försämring avcelllönsamheten 27. Detta sker särskilt i förlängda partikelnedfalltider (t.ex. 60 min) om den rena luften innehåller mindre än 5 % CO2 eller HEPES-koncentrationen av exponeringsmediet är för låg som måste undvikas.
En kritisk fråga i protokollet är att trycka på testämnena. Testämnena måste komprimeras tillräckligt till en pulverkaka i ämnesbehållaren för att möjliggöra en stabil partikelexponering. Således måste ämnena karakteriseras i preliminära experiment om deras pressegenskaper och för att få information om vilken presskolv, typ av skrapblad eller foderhastigheter måste användas.
Det maximala presstrycket för den hydrauliska pressen är dock 10 kN, vilket samtidigt representerar belastningsgränsen för glascylindern och därmed en begränsning av pressprocessen. Ämnesbehållaren tål inte högre presskrafter än 10 kN. En högre presskraft kan erbjuda pressning av kristallina ämnen och därmed förlänga tillämpligheten av denna press, men skulle kräva mer robusta ämnesbehållare.
Dessutom kan detta exponeringssystem som i första hand är utformat för undersökning av luftburna partikelexponeringar anpassas till exponeringen av flytande aerosoler och mycket giftiga och aggressiva gaser beroende på aerosolgenereringsmetoden och materialet i exponeringsmodulerna. Utbyte av aerosolgeneratorn med membrannebulator och med hjälp av en exponeringsmodul i rostfritt stål gjorde det möjligt att exponera cellerna för mycket giftiga flytande aerosoler24.
En annan kritisk fråga är överbelastningseffekten. Celllönsamhet kan påverkas inte bara av toxikologiska egenskaper hos ett testämne utan också av mängden av ett ämne som deponeras på cellerna. Detta exponeringssystem visar faktiskt betydande likheter med de fysiologiska förhållandena i den mänskliga alveolarregionen, men innehåller inga utrymmeförsmekanismer för att avlägsna partiklar. Det är därför mycket viktigt att celllönsamheten inte försämras på grund av ett alltför stort antal partiklar.
Protokollet beskriver häri den homogena exponeringen av odlade mänskliga lungceller vid ALI för luftburna partiklar. Reproducerbarheten, dess robusthet och överförbarhet gör det nuvarande exponeringssystemet tillämpligt som en in vitro-screeningmetod för kvalitativ bedömning av inandningsbara partiklar avseende deras akuta inandningstoxicitet. Eftersom inga alternativa in vitro-metoder hittills har validerats tillräckligt bedöms akut lungtoxicitet fortfarande genom att utsätta djur (t.ex. helkroppskammare, näsa eller mun-bara-metoder). Alla allmänt accepterade OECD:s testriktlinjer för akut inandningtoxicitet (t.ex. TG 403, TG 433 och TG 436) baseras på djurmodeller för närvarande21,22,28,29. En framtida inriktning kommer därför att vara att gälla vid Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD) för godkännande som in vitro-testriktlinje för akut inandningstoxicitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna AT, KG, AB, SH, HM, TG, HT och DS har inget att avslöja. Företaget Cultex Technology GmbH (tidigare Cultex Laboratories GmbH) producerar instrument (t.ex. NM var anställd vid Cultex Laboratories GmbH under denna studie. OK är anställd vid Cultex Technology GmbH (tidigare Cultex Laboratories GmbH). PatentET PCT/EP2009/007054 för enheten innehas av grundaren av Cultex Technology GmbH Prof. Dr. Ulrich Mohr (tidigare Cultex Laboratories GmbH).
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF, Tyskland (Grant 031A581, delprojekt A-D)) och av Den tyska forskningsstiftelsen (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Forskargrupp EN GRK 2338).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Cell culture medium and supplies | |||
| DMEM | Biochrom, Berlin, Germany | FG 0415 | used as growth medium |
| DMEM | Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany | 22320 | used as exposure medium |
| FBS superior | Biochrom, Berlin, Germany | S 0615 | |
| Gentamycin (10mg/mL) | Biochrom, Berlin, Germany | A 2710 | |
| HEPES 1M | Th. Geyer, Renningen, Germany | L 0180 | |
| PBS | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) | Biochrom, Berlin, Germany | L 2143 | |
| Cell culture material | |||
| CASY Cups | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651794 | |
| Cell culture plates | Corning, Wiesbaden, Germany | 3516 | 6-well plates |
| Corning Transwell cell culture inserts | Corning, Wiesbaden, Germany | 3450 | 24mm inserts; 6-well plates; 0.4 µm |
| Chemicals | |||
| CASYton | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651808001 | |
| Compressed Air (DIN EN 12021) | Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany | 2290152 | |
| WST-1 | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab155902 | |
| Instruments + equipment | |||
| CASY Cell Counter | Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany | ||
| Circulation thermostat | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline RE 100 | |
| CULTEX HyP - Hydraulic Press | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX insert sleeve | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX supply | |||
| Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Filters (large) | Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany | LP-050 | Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999% |
| Filters (small) | Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany | 9933-05-DQ | Balston disposable filter |
| Medium pump | Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser | digital peristaltic pump |
| Microplate Reader Infinite M200 Pro | Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany | ||
| Vakuum pump | KNF, Freiburg, Germany | N86 KT.18 | |
| Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min | TrigasFI GmbH | Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20 | |
| Water Bath | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline Staredition RE 104 |
References
- Faber, S. C., McCullough, S. D. Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).
- Ambient air pollution: a global assessment of exposure and burden of disease. , World Health Organization. http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/250141/9789241511353-eng.pdf?sequence=1 (2018).
- De Matteis, S., et al. Current and new challenges in occupational lung diseases. European Respiratory Review. 26 (146), 1-15 (2017).
- LANUV Nordrhein-Westfalen. Gesundheitliche Risiken von Nanomaterialien nach inhalativer Aufnahme. , (2009).
- Bérubé, K., et al. In vitro Models of Inhalation Toxicity and Disease. The report of a FRAME workshop. Alternatives To Laboratory Animals. 37 (1), 89-141 (2009).
- Lopez, A. D., Murray, C. C. The global burden of disease, 1990-2020. Nature Medicine. 4 (11), 1241-1243 (1998).
- Clippinger, A. J., et al. Alternative approaches for acute inhalation toxicity testing to address global regulatory and non-regulatory data requirements: An international workshop report. Toxicology In vitro. 48, 53-70 (2018).
- Agrawal, M. R., Winder, C. Frequency and Occurrence of LD50 Values for Materials in the Workplace. Journal Of Applied Toxicology. 16 (5), 407-422 (1996).
- Amtsblatt der Europäischen Union. Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen Parlaments und des Rates. Europäische Union. 860, (2006).
- Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Fisher, R. L., et al. The Use of Human Lung Slices in Toxicology. Human and Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).
- Lenz, A. G., et al. Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 12, (2013).
- Steinritz, D., et al. Use of the CULTEX Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).
- Lacroix, G., et al. Air-Liquid Interface In vitro Models for Respiratory Toxicology Research. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).
- Eskes, C., Whelan, M. Validation of Alternative Methods for Toxicity Testing. 418, Springer International Publishing. (2016).
- Rach, J., Budde, J., Möhle, N., Aufderheide, M. Direct exposure at the air-liquid interface: Evaluation of an in vitro approach for simulating inhalation of airborne substances. Journal Of Applied Toxicology. 34 (5), 506-515 (2014).
- Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive Technical Approach for the In vitro Exposure of Airway Epithelial Cells to the Particulate Matter at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 15, (2013).
- Lieber, M., Todaro, G., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International Journal Of Cancer. 17 (1), 62-70 (1976).
- Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: Alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection And Immunity. 73 (2), 1129-1140 (2005).
- Kim, K. J., Borok, Z., Crandall, E. D. A useful in vitro model for transport studies of alveolar epithelial barrier. Pharmaceutical Research. 18 (3), 253-255 (2001).
- OECD. Test No. 403: Acute Inhalation Toxicity. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2009).
- OECD. Test No. 436: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2009).
- Tsoutsoulopoulos, A., et al. Validation of the CULTEX Radial Flow System for the assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles. Toxicology In vitro. 58, 245-255 (2019).
- Tsoutsoulopoulos, A., et al. A novel exposure system generating nebulized aerosol of sulfur mustard in comparison to the standard submerse exposure. Chemico-Biological Interactions. 298, 121-128 (2019).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , Johns Hopkins School of Public Health. http://altweb.jhsph.edu/pubs/books/humane_exp/het-toc (1959).
- Tsoutsoulopoulos, A., et al. Optimization of the CULTEX radial flow system for in vitro investigation of lung damaging agents. Toxicology Letters. 244, 28-34 (2016).
- Osman, J. J., Birch, J., Varley, J. The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations. Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).
- OECD. Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2018).
- OECD. Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies. , OECD Publishing. Paris. (2018).
