Burada membrana bağlı pirofosfataz (Thermotoga maritimadan) inhibitörleri için 96 kuyu plaka biçiminde mobibdenum mavi reaksiyonu dayalı bir tarama yöntemi salıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Thermotoga maritima Membran Bağlı Pirofosfataz Inhibitörleri için tarama
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Membrana bağlı pirofosfatazlar (mPPases) bakterilerde, arkelerde, bitkilerde ve protist parazitlerde oluşan dimerik enzimlerdir. Bu proteinler pirofosfatı iki ortofosfat molekülüne ayırırlar, bu moleküller proton ve/veya sodyum iyonile birleştiğinde membran boyunca pompalanırlar. Hayvanlarda ve insanlarda homolog protein oluşmadığından, mPPP'ler potansiyel ilaç hedeflerinin tasarımında iyi adaylardır. Burada 96 kuyu plaka sisteminde mobibdenmavi reaksiyon kullanan mPPase inhibitörleri için ayrıntılı bir protokol sayılmaktadır. Termofilik bakteri Thermotoga maritima (TmPPase) mPPase'yi model enzim olarak kullanıyoruz. Bu protokol basit ve ucuzdur ve tutarlı ve sağlam bir sonuç verir. Testin başlangıcından emici ölçüme kadar etkinlik test protokolünü tamamlamak sadece bir saat sürer. Bu çıktıda üretilen mavi renk uzun bir süre için kararlı olduğundan, sonraki tsay(lar) önceki toplu işlemden hemen sonra gerçekleştirilebilir ve emicilik daha sonra tüm gruplar için aynı anda ölçülebilir. Bu protokolün dezavantajı, elle yapılır ve böylece yorucu yanı sıra pipetting ve zaman tutma iyi beceriler gerektirir olabilir. Ayrıca, bu istihda kullanılan arsenit-sitrat çözeltisi sodyum arsenit içerir, toksik ve gerekli önlemler ile ele alınmalıdır.
Giriş
Toplam hücresel proteinlerin yaklaşık %25'i membran proteinleridir ve bunların yaklaşık %60'ı ilaç hedefleri1,2'dir. Potansiyel ilaç hedeflerinden biri3, membrana bağlı pirofosfatlar (mPPases), iki ortofosfat içine pirofosfat hidrolizi ile membran boyunca proton ve / veya sodyum iyon pompa dimerik enzimlervardır 4. mPPases çeşitli organizmalarda bulunabilir5 bakteri gibi, arke, bitkiler, ve protist parazitler, insanlar ve hayvanlar hariç4. Protist parazitlerde, örneğin Plasmodium falciparum, Toxoplasma ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Protein hazırlama
NOT: TmPPase'nin ifadesi ve arınması başka bir yerde13olarak tanımlanmıştır.
- 20 mM 2-(N-morfolino)etanesulfonik asit (MES) pH 6.5, %3.5 (v/v) gliserol, 2 mM dithiothreitol (DTT) ve %0.05 dodecyl maltoside (DDM) içeren reaktivasyon tampon çözeltisinin 10 mL'sini hazırlayın.
- 200 mM Tris-Cl pH 8.0, 8.0 mM MgCl2,333 mM KCl ve 67 mM NaCl içeren reaksiyon karışımının 10 mL'sini hazırlayın.
NOT: Mg2+ mPPPAz substrat olarak pirofosfat chelate gereklidir, K+ TmPPase potasyum bağımlı mPPase olduğu gibi enzim aktivitesini artırmak için gerekli....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokolde, pirofosfatazların ortak inhibitörü olan IDP ile birlikte sekiz bileşik (Şekil2A)pozitif kontrol olarak test edildi. Her bileşik üç farklı konsantrasyonda (1 μM, 5 μM ve 20 μM) trilikat olarak test edildi. Taramanın iş akışı Şekil 1'degösterilmiştir , numune ve reaktif hazırlığından başlayarak 860 nm'de emici ölçüme kadar.
Bu protokolün sonunda, Çözelti A + B ve arsenit-sitrat eklendikten sonra, çözeltiler gözlemlenebili.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada Vidilaseris ve ark14dayalı bir 96 iyi plaka formatında T. maritima membran bağlı pirofosfatse için inhibitörleri basit tarama için ayrıntılı bir protokol rapor . Bu protokol ucuz dur ve asidik koşullarda ortofosfat ve molybdate oluşan ve farklı bir mavi renk 12 ile fosfathomolybdenum türlerine indirgenmiş12fosfathomolybdic asit, dayanmaktadır. Bu yöntem diğer protokoller üzerinde tercih edilir, daha hassas malakit yeşil test16gibi , B.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma Jane ve Aatos Erkko Vakfı ve BBSRC (BB/M021610) adrian Goldman hibe tarafından desteklenmiştir, Finlandiya Akademisi (No. 308105) Keni Vidilaseris, (No. 310297) Henri Xhaard ve (No. 265481) Jari Yli-Kauhaluoma ve Helsinki Üniversitesi Araştırma Fonları Gustav Boije af Gennäs için. Yazarlar bernadette Gehl'e proje sırasında ki teknik yardımları için teşekkür eder.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Yapışkanlı sızdırmazlık levhası | Thermo Scientific | AB0558 | |
| Amonyum heptamolibdat tetrahidrat | Merck | F1412481 636 | |
| Askorbik asit | Sigma-Aldrich | 95212-250G | |
| BioLite 96Well Çok Çanaklı | Thermo Scientific | 130188 | |
| Dimetil sülfoksit (DMSO) | Merck | 1167431000 | |
| 8 oyuklu PCR Tüp Şeritleri 0.2 ml kapaksız (120) | Nippon genetiği | FG-028 | |
| Dodesil maltozit (DDM) | Melford | B2010-100G | |
| Etanol | Merck | 1009901001 | |
| Buzlu asetik asit | Merck | 1000631011 | |
| Hidroklorik asit | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | |
| İmidoidifosfat sodyum tuz | Sigma-Aldrich | I0631-1G | |
| L-&alfa;-Soya fasulyesi lesitininden fosfatidil kolin | Sigma | 429415-100GM | |
| Magnezyum klorür | Sigma-Aldrich | 8147330500 | |
| Çok Plakalı 96 Kuyulu PCR Plakaları | Bio-Rad | MLL9651 | |
| MultiSkan Go | Thermo Scientific | 10680879 | |
| Nepheloskan Tırmanış (Tip 750) | Labsystems | ||
| Polistiren Petri kabı (boyut 150 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5981-100EA | |
| Potasyum klorür | Merck | 104936 | |
| Prism 6 yazılımı | GraphPad | ||
| QBT2 Isıtma bloğu | Hibe Aletleri | ||
| Sodyum meta-arsenit | Fisher Chemical | ||
| Sodyum fosfat dibazik (Pi) | Sigma | S0876-1KG | |
| Sodyum pirofosfat dibazik | Fluka | 71501-100G | |
| Trisodyum sitrat dihidrat | Fluka | 71404-1KG |
Kaynaklar
- Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).
- Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8),....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
