Summary
Den nuvarande manuskript Detaljer hur man isolerar Hippocampus arterioler och kapillärer från mus hjärnan och hur man pressar dem för tryck myography, immunofluorescenser, biokemi, och molekylära studier.
Abstract
Från subtila beteendemässiga förändringar till sent stadium demens, vaskulär kognitiv svikt utvecklas typiskt efter cerebral ischit. Stroke och hjärtstillestånd är anmärkningsvärt sexuellt dimorfiska sjukdomar, och båda inducera cerebral ischa. Emellertid, framsteg i förståelsen av vaskulär kognitiv svikt, och sedan utveckla könsspecifika behandlingar, har delvis begränsats av utmaningar i att undersöka hjärnans mikrocirkulation från musmodeller i funktionella studier. Här presenterar vi en metod för att undersöka kapillär-till-arteriole signalering i en ex vivo Hippocampus kapillär-parenkymal arteriole (HiCaPA) beredning från mushjärna. Vi beskriver hur man isolerar, kanylera, och pressa mikrocirkulationen för att mäta arteriolär diameter som svar på kapillärstimulering. Vi visar vilka lämpliga funktionella kontroller kan användas för att validera HiCaPA förberedelse integritet och Visa typiska resultat, inklusive testning av kalium som en neurovaskulär koppling agent och effekten av den nyligen kännetecknas hämmare av Kir2 inåt korrigera kalium kanal familj, ML133. Vidare jämför vi svaren i beredningar erhållna från manliga och kvinnliga möss. Även om dessa data återspeglar funktionella utredningar, kan vår metod också användas inom molekylärbiologi, immunokemi och elektrofysiologiska studier.
Introduction
Den piala cirkulationen på hjärnans yta har varit föremål för mycket studie, delvis på grund av dess experimentella tillgänglighet. Dock skapar topologin för cerebral kärlsystemet distinkta regioner. I motsats till den robusta Arvika nätverk rik på anastomoser med betydande kapacitet för att omdirigera blodflödet, intracerebral parenkymala arterioler (PAS) nuvarande begränsade säkerheter försörjning, var och en av dem parfymera en diskret volym av nervvävnad1,2. Detta skapar en flaskhals effekt på blodflödet som, kombinerat med unika fysiologiska funktioner3,4,5,6,7,8, gör intracerebral arterioler en avgörande plats för cerebralt blodflöde (CBF)regel 9,10. Trots de tekniska utmaningarna i samband med isolering och kanylering av utbetalande organen har det senaste decenniet sett ett ökat intresse för ex vivo funktionella studier med tryckkärl11,12,13,14,15,16,17. En av anledningarna till detta ökade intresse är den avsevärda forskningsinsatser som bedrivs på neurovaskulär koppling (NVC), mekanismen upprätthålla hjärnans funktionella hyperemi18.
Regionalt, CBF kan snabbt öka efter lokala neurala aktiveringen19. Den cellulära mekanismer och signalering egenskaper kontrollera NVC är ofullständigt förstås. Emellertid, vi identifierade en tidigare oväntad roll för hjärnans kapillärer under NVC i avkänning Neural aktivitet och översätta den till en hyperpolariserande elektrisk signal till vidga uppströms arterioler20,21,22. Actionpotentialer23,24 och öppnande av stor-conductance ca2 +-aktiverad K+ (BK) kanaler på astrocytic endfeet25,26 öka interstitiell kalium Jon koncentrationen [k+]o, vilket resulterar i aktivering av stark aktiv likriktare K+ (KIR) kanaler i det vaskulära endotelet i kapillärerna. Denna kanal aktiveras av externa K+ men också av hyperpolarisering själv. Spridning genom gap korsningar, den hyperpolariserande strömmen sedan återskapar i angränsande kapillära endotelceller upp till arteriole, där det orsakar myocyt avslappning och CBF öka20,21. Studiet av denna mekanism ledde oss att utveckla en trycksatt kapillär-parenkymal arteriole (Capa) beredning för att mäta arteriolär diametern under kapillärstimulering med vasoaktiva agenter. Den CaPA preparatet består av en kanylerad intracerebral arteriole segment med en intakt, nedströms kapillär ramification. Kapillärändarna komprimeras mot kammarens glasbotten med en mikropipett, som ockluderar och stabiliserar hela vaskulär bildningen20,21.
Vi har tidigare gjort instrumentella innovationer genom Imaging Capa preparat från mus barken20,21 och arterioler från råtta amygdala13 och Hippocampus16,17. Som Hippocampus kärlsystemet får mer uppmärksamhet på grund av dess mottaglighet för patologiska tillstånd, här ger vi en steg-för-steg-metod för Capa beredning från musen Hippocampus (hicapa) som inte bara kan användas i funktionella NVC studier men också i molekylärbiologi, immunokemi, och elektrofysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) vid University of Colorado, Anschutz Medical campus och utfördes enligt riktlinjerna från National Institutes of Health.
1. lösningar
- Använd MOPS-buffrad saltlösning för dissektion och för att hålla proverna vid 4 ° c före användning. Gasa inte lösningen. Förbered MOPS buffrad saltlösning med följande sammansättning: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2Po4, 1 mm mgso4, 2,5 mm CaCl2,5mm glukos, 3 mm moppar, 0,02 mm EDTA, 2 mm pyruvat, 10 mg/mL bovint serum albumin, pH 7,3 vid 4 ° c.
- Använd konstgjord cerebrospinalvätska (aCSF) som bad lösning och pipettlösning. Gas både aCSF och ca2 +-Free acsf med 5% Co2, 20% O2, och N2 Balance. Förbered lösningen med följande sammansättning: 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mm NaH2Po4, 1 mM mgcl2, 4 mm glukos, 2 mm CaCl2, pH 7,3 (med luftning med 5% Co2, 20% O2, och N2 balans).
- Få maximal dilatation i nominellt ca2 +-fritt acsf (0 mm [ca2 +]o, 5 mm EGTA).
2. beredning av organ kammare
- För in borosilikatglas kapillärer (ytterdiameter = 1,2 mm; innerdiameter = 0,69 mm; längd = 10 cm) i ett glas avdragare. Dra kapillär för att göra en lång, tunn spets i ena änden.
- På ena sidan av kammaren, tillsätt en kanyl som kan anslutas till en miniatyr Peristaltisk pump till luminally tryck på fartyget. Under en dissektion Mikroskop, bryta spetsen av kanyl så att den är tillräckligt liten för att passa fartyget av intresse, men tillräckligt stor för att tillåta lösningar för att flöda genom spetsen. Se till att spetsen är ungefär 10-15 μm i diameter.
- Fyll kanyl med hjälp av en spruta med ett monterat 0,22 μm filter med syresatt aCSF. Se till att det inte finns några luftbubblor eller skräp i kanyl.
- Lägg till ytterligare två kanylar på motsatt sida av kammaren. Bryt inte deras tips.
3. Hippocampus dissektion och isolering
- Euthanize och halshugga en mus. För detta experiment, Använd en 8-veckors gammal C57BL6/J mus för att jämföra skillnader mellan män och kvinnor. Injicera musen med pentobarbital och halshugga med kirurgisk sax.
- Med hjälp av små dissektion sax, klippa huden längs mittlinjen på toppen av huvudet. Flytta huden från sidorna.
- Med början vid den kaudala sidan av skallen, skär skallen längs mittlinjen tills lukt lökar nås. Ta bort delar av skallen tills storhjärnan exponeras.
- Sakta bort hjärnan, börjar nära näsan av musen. Separera hjärnan från lukt lökar, kranialnerver och ryggmärg genom att skära genom strukturerna med den lilla dissekera saxen.
- Placera hjärnan i en dissektion tallrik med tillräckligt MOPS lösning för att helt dränera den. Med hjälp av en dissektion Mikroskop, placera hjärnan i mitten av dissektion plattan med den ventrala sidan vänd nedåt.
- Med hjälp av ett rakblad, skär hjärnan på mitten längs den längsgående spricka. Håll bladet så att den skarpa kanten är parallell med nederdelen av dissektion plattan. Tryck på bladet genom hjärnan i ett slag. Flytta en halvklot till sidan av plattan.
- Utför följande steg för varje halvklot separat eller parallellt.
- Placera en halvklot i mitten av plattan så mittlinjen är vänd nedåt. Använd sedan rakbladet för att skära längs den tvärgående spricka för att ta bort lillhjärnan och hjärnstammen. Skjut bladet rakt igenom vävnaden.
- Rotera halvklotet så att den mediala sidan är vänd uppåt (figur 1A). Använd en spatel för att hålla hjärnan på plats. Med hjälp av en andra spatel, infoga spetsen under corpus callosum och skopa under för att ta bort Thalamus, septum, och hypothalamus, som täcker Hippocampus (figur 1B).
- Se till att Hippocampus är nu synlig som en böjd struktur nära den bakre sidan av Cerebrum. Använda en spatel för att hålla storhjärnan på plats, Använd den andra spateln för att ösa Hippocampus ur storhjärnan (figur 1C).
- Överför hippocampi till en ny dissektion tallrik fylld ungefär halvvägs med MOPS lösning. Kassera resten av hjärnan.
4. hippocampal arteriole isolering
- Utför följande steg för varje hippocampus.
- PIN ner en av hippocampi med små stift i vardera änden av avsnittet. Den Hippocampus artären är vänd uppåt.
- Med mycket vassa pinpett, försiktigt sträcka små delar av hippocampus. Detta kommer att lossa vävnaden som omger arterioler, vilket gör det lättare att dissekera dem.
- Sök igenom den dorsala Hippocampus vävnad att identifiera den yttre tvärgående artär (figur 1C)16,27.
- Ta försiktigt den yttre tvärgående artären och sakta dra den bort från vävnaden för att samla arterioler och kapillärer parfymera den CA3 regionen i hippocampus.
- När det inte finns några fler fartyg som skall avlägsnas från vävnaden, kassera hippocampi. Förvara kärlen på is på tallrikar när de inte används.
5. hippocampal kapillär-parenkymal arteriole kanylering
- Hitta en arteriole med en gren som slutar med kapillärer. Överför den till orgel kammaren. Se till att arteriole är ca 15-30 μm när den är helt dilaterad (figur 1D).
- Montera försiktigt blodkärlet genom att trycka kanylspetsen genom arteriole-väggen under målområdet. Skjut försiktigt kärlet på kanylen tills det finns tillräckligt med vävnad för att placera slipsen på.
- Gör en lös knut med 12-0 nylon suturer så att den passar över blodkärlet och kanyl. Använd en halv-Hitch Knut för att säkra slipsar. Dra sedan ändarna för att dra åt knuten och säkra arteriole till kanyl. Ta bort eventuella yttre kärl grenar under slipsen genom att försiktigt dra dem med tång.
- Gör en annan slips och säkra den på andra änden av arteriole att täta den.
- Sänk kanylet med det bifogade kärlet tills det är plant mot täckglan på kammarens botten. Var noga med att inte sänka kanyl för mycket eller det kommer att bryta.
- Med hjälp av en kanyl på motsatt sida av kammaren, Sänk den så att poängen med det stift ner slips på slutet av arteriole.
- Använd den tredje kanyl att fästa ner kapillärgrenen till täckslip. Placera spetsen nära slutet av grenen medan du lämnar ändarna av kapillärerna exponeras (inte under kanyl).
6. tryckmyografi
- Flytta kammaren från dissektionens räckvidd till mikroskopet med inspelningsprogrammet.
- Anslut inflödes-och utflödes slangen till kammaren för perfusion. Starta perfusion med uppvärmd aCSF (37 ° c) med en flödeshastighet på 4 mL/min.
- Anslut den tryckande kanyl till en Peristaltisk pump ihopkopplad med en tryckgivare och föra det inre trycket till 20 mm Hg.
- Starta inspelningsprogrammet. Justera mikroskopet och bildinställningarna för att uppnå den tydligaste bilden som möjligt. Börja inspelningen när inställningarna är optimerade för detekterings programvaran.
- Öka trycket på fartyget upp till 40 mm Hg medan du registrerar den arteriella diametern med en kant detekterings programvara.
- Låt ~ 15-20 min att tvätta moppar lösning ur kammaren med acsf, och att låta hicapa beredning att jämvikt och utveckla Myogenic ton.
- För att testa ett fartygs livskraft, applicera 1 μM NS309 lösning på badet perfusion (se figur 2a, B och avsnittet representativa resultat). Den arteriolär segmentet måste vidga, visar om 30-40% Myogenic ton som tidigare beskrivits3,14,20.
7. fokal stimulering av kapillärändar
- När baslinjen tonen för arteriole har fastställts och endotelfunktion bedömas, testa svaret av kapillärstimulering.
- Med hjälp av ett glas avdragare, göra kanylar så att det finns en fin punkt i ena änden. Bryt spetsen av en kanyl så att drogen testas kan flöda genom spetsen smidigt vid 5 psi.
- Fyll kanyl med drogen lösning av intresse och lägga till en 3-axlig micromanipulator bifogas mikroskopet. Anslut slangen från tryck matarsystemet till kanyl.
- Sakta sänka kanyl i badet nära kapillärerna, vara noga med att inte träffa någon del av fartyget eller hårdvara i kammaren. Manövrera spetsen på kanyl bredvid ändarna av kapillärerna utan att röra dem. Håll spetsen på kanyl precis utanför täckslip för att förhindra att kärlet stimuleras om kanyl läcker.
- När du är redo att stimulera kapillärerna, sänk kanylen till täckslip och precis bredvid kapillärerna. Aktivera tryckejektionssystemet med önskad ejektionstid (här 20 s). När stimulering är klar, höja kanyl något för att undvika ytterligare stimulering.
- Upprepa stimulering vid behov. Ändra trycket ejektionssystem kanyl att testa olika läkemedels föreningar.
- För att bekräfta att endast kapillärerna stimuleras, Fyll kanyl med 1 μM NS309 lösning och upprepa ovanstående steg.
Obs: Kapillärendotelceller inte Express K+ kanaler aktiveras av NS309, så arteriole får inte svara på stimulering. Om arteriole dilates, då kanyl måste flyttas eller diametern på hålet kommer att behöva vara mindre (se figur 2A, B och representativa resultat avsnitt).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Endotelial Small-conductance (SK) och Intermediate-conductance (IK) ca2 +-känsliga K+ kanaler utövar en dilaterande inverkan på diametern på Pas. Bad applicering av 1 μM NS309, en syntetisk IK och SK-kanalagonist, orsakad nära maximal dilatation (figur 2a, B). Emellertid, kapillärendotelceller saknar IK och SK kanaler och inte hyperpolarize som svar på NS30920. Som ett resultat, stimulerande kapillär slutar med 1 μm NS309 av Focal tryck ejektion (20 s, 5 PSI) inte orsaka uppströms arteriolär dilatation (figur 2a, B). Detta resultat indikerar att NS309 inte nådde arteriole i HiCaPA preparat och kunde användas som en kontroll för att bedöma den rumsliga begränsningen av föreningen appliceras på kapillärer genom tryck utmatning.
Denna beredning var fundamentalt utformad för mätning av Inside-Out elektriska signalering från kapillärer till PAs. Med hjälp av hicapa beredning, applicerade vi acsf innehållande 10 mm K+ på kapillärändarna och mätt en uppströms arteriolär dilatation (figur 2A, C) som vi tidigare gjorde i Capa preparat från kortikala kärlsystemet20. Vi undersökte sedan, för första gången till vår kännedom, kapillär-till-arteriole elektrisk signalering i honmöss med hjälp av HiCaPA preparat. Arteriolar dilatation framkallat av kapillärstimulering med 10 mM K+ skilde sig inte mellan preparat från manliga och kvinnliga möss (figur 2A, C).
Slutligen, en annan grundläggande fördel med detta tillvägagångssätt är möjligheten att tillämpa farmakologiska verktyg i badet innan kapillärstimulering. Här testade vi effekten av ML133, en nyligen utvecklad Kir2-hämmare28. Tillsats av 10 μm ML133 till badet perfusion praktiskt taget avskaffade kapillärinducerad arteriolär dilatation som svar på 10 mm K+ i hicapa preparat från både manliga och kvinnliga möss (figur 2A, C). Detta sista resultat tyder på att Kir 2.1-kanalen förmedlar elektrisk signalering i kvinnlig cerebral kärlsystemet som vi tidigare beskrivits i den kortikala mikrocirkulationen av den manliga hjärnan.
Figur 1: metod för isolering och trycksättning av hippocampus kapillärparenkymala arterioler (HiCaPA) beredning från mus. (A) nyligen isolerade hjärnan skärs i hälften i sagittal planet efter interhemisfäriska spricka och placeras med den mediala sidan vänd uppåt. (B) Thalamus, septum, och hypotalamus avlägsnas försiktigt för att avslöja hippocampus. (C) Hippocampus avlägsnas omsorgsfullt. (D) arterioler med kapillärträd är isolerade från hippocampus och ena änden av arteriolär segmentet är kanylerade med en micropipett ansluten till ett tryck system, och den andra änden är ockluderad. Kapillärändarna förseglas och underhålls mot täckglaset med spetsen på en glaspipett. Innerdiametern övervakas med ett kant detekteringssystem i en eller flera regioner i arteriole. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: fokal stimulering av kapillärer med 1 μm NS309 har ingen effekt på uppströms arteriolär diameter, till skillnad från stimulering med acsf som innehåller 10 mm K+. A) representativ registrering av den uppströms arteriolära diametern som visar effekten av bad applicering på 1 μm NS309 följt av successiva kapillärändar stimulering (20 s, 5 PSI) med 1 μm NS309 och med acsf innehållande 10 mm K+ i avsaknad eller förekomst av Kir2-kanalhämmaren ML133. Applicering av 10 mm K+ på kapillärer producerade en snabb uppströms arteriolär dilatation som blockerades av 10 μm ML133. NS309 inte orsaka dilatation. Avsaknaden av uppströms arteriolär dilatation som svar på kapillär stimulering med NS309 illustrerar att tryck-Ejected föreningar inte når arteriole. B) sammanfattande data som visar ändringar av diametern som induceras av 1 μm NS309 som appliceras i badet eller på kapillärändarna (n = 14; * * * *p < 0,0001, parat t-test). C) sammanfattande data som visar arteriolära diameter förändringar som inducerats av 10 mm K+ som appliceras direkt på kapillärerna i hicapa-preparat från manliga (n = 6) eller kvinnliga (n = 8) möss före och efter 10 μm ML133 applicerades i badet (* * *p < 0,0005, ns = icke-signifikanta, ej parade t-test). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den trycksatta hicapa (Hippocampus kapillär-parenkymal arteriole) beredning beskrivs i det nuvarande manuskriptet är en förlängning av vår väletablerade förfarande för att isolera, tryck, och studera parenkymal arterioler29. Vi rapporterade nyligen att Kir 2,1 kanaler i hjärnan kapillära endotelceller känsla ökar i [K+]o i samband med neurala aktivering, och generera en stigande hyperpolariserande signal som Vidar uppströms arterioler20. Avslöjar denna tidigare oförutsedda roll för kapillärerna har varit möjligt delvis genom att utveckla Capa preparatet från kortikal mikrocirkulation20,21. Detta manuskript presenterar en liknande experimentell metod, men från en djupare och mer begränsad struktur mushjärna att beskriva en enkel och reproducerbar metod för att undersöka kapillär-till-arteriole signalering under neurovaskulär koppling.
Hjärnans mikrocirkulation är utsökt bräcklig och vissa metoder, särskilt minimera stretching och hantering av fartygen, måste användas för att säkerställa överlevnaden av arterioler och kapillärer. Den spontana utvecklingen av den myogena tonen är den första indikatorn på en berednings livskraft30. Endotelfunktionen kan sedan bedömas genom att man lägger till SK-och IK-kanalernas agonist NS309 till bad lösningen, vilket bör orsaka nära maximal dilatation. I händelse av ett misslyckande att utveckla tonen eller svar på badet tillämpningen av NS309, preparatet bör ersättas med en annan. NS309 används också för att testa spridningen av den fokala kapillärstimulering. Eftersom kapillärendotelceller saknar sk och IK-kanaler20, lokal leverans av NS309 på kapillärer genom tryck ejektion bör ha någon effekt på uppströms arteriolär diameter som visas i figur 2, illustrerar att föreningar inte oavsiktligt stimulera arteriole. När dessa steg har validerats, kapillär-till-arteriole signalering kan testas.
Här undersökte vi elektrisk signalering genom att stimulera kapillärer med aCSF innehållande 10 mM K+. Emellertid, olika signalering modaliteter kan utforskas med hjälp av den nuvarande metoden genom att stimulera kapillärer med olika kända vasoaktiva agenter eller signalsubstanser. En annan fördel med denna beredning är möjligheten att undersöka och så småningom jämföra NVC mellan olika djur och mellan olika hjärnregioner. Detta är särskilt intressant eftersom hjärnan inte är jämnt riktad av cerebrovaskulära patologier31,32. En allmän begränsning av den metod som presenteras här är att genom att isolera mikrocirkulationen, är viktiga komponenter i neurovaskulär enhet, såsom nervceller och astrocyter, förlorade. Andra preparat, såsom kraniala fönster för in vivo CBF Imaging, bibehålla strukturen i intakt neurovaskulär enhet och är mer lämpade att studera NVC i ett intakt system. Men i kraniala fönster beredning, parenkymal arterioler är svåra att bilden utan särskild utrustning, som en multiphoton Mikroskop, och djupare regioner, såsom Hippocampus, förbli svårt att bilden. I detta avseende, den strategi som utvecklats i Filosa laboratorium med hjälp av luminala flöde för att inducera myogen ton i hjärnan skivor representerar en elegant länk mellan hjärnan slice och in vivo närmar sig33. Men den omgivande nervvävnad kan begränsa penetrationen av ett läkemedel som appliceras lokalt, öka dess off-Target potential och göra tolkningar svårt, eftersom flera celltyper utsätts för droger. Vi utvecklade främst vår ex vivo -strategi för att ta itu med dessa potentiella problem. Sammanfattningsvis bör flera metoder användas tillsammans för att fullt ut studera NVC.
Sammanfattnings, den nuvarande rapporten beskriver en ex vivo intakt beredning av trycksatta Hippocampus arterioler och kapillärer som gör att effekterna av farmakologiska och biologiska agens testas på funktionella parametrar vid diskreta positioner längs kapillär-arteriole kontinuum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna skulle vilja tacka Jules Morin för insiktsfulla kommentarer på manuskriptet. Denna forskning finansierades av utmärkelser från CADASIL tillsammans har vi hopp ideell organisation, centrum för kvinnors hälsa och forskning, och NHLBI R01HL136636 (FD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22µm Syringe Filters | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
| 12-0 Nylon (12cm) Black | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Dissection Scope | Olympus | SZ11 | |
| ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head | Ismatec | ISM 1090 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Inline Water Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| Integra™ Miltex™Tissue Forceps | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| ML 133 hydrochloride | Tocris | 4549 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NS309 | Tocris | 3895 | |
| Picospritzer III - Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P3662 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Vertical Micropipette Puller | Narishige | PP-83 |
References
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).
- Shih, A. Y., et al. Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
- Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
- De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
- Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).
- Koide, M., et al. The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).
- Girouard, H., et al. Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).
- Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).
- Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).
- Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).
- Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).
- Johnson, A. C., Cipolla, M. J. Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).
- Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. , (2019).
- Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
- Roy, C. S., Sherrington, C. S. On the Regulation of the Blood-supply of the Brain. The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).
- Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells. eLife. 7, 351 (2018).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
- Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion. The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).
- Filosa, J. A., et al. Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain. Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).
- Attwell, D., et al. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
- Coyle, P. Vascular patterns of the rat hippocampal formation. Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).
- Wang, H. R., et al. Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133. ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).
- Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles. Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).
- Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).
- Montagne, A., et al. Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus. Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).
- Zhang, X., et al. Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).
