本文介绍了一种改良的一细胞胚胎冷冻保存方法，以及一种将冻融胚胎与电穿孔技术相结合的方案，用于高效制备基因修饰小鼠。
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本文内容
摘要
摘要
转基因小鼠的应用对于理解基因功能和解析人类疾病潜在机制至关重要。CRISPR/Cas9 系统使研究人员能够以前所未有的效率、准确性和简便性对基因组进行修饰。利用该技术，研究人员正致力于建立一种快速、高效且操作简便的转基因小鼠制备方案。本文介绍了一种改进的一细胞胚胎冷冻保存方法，可显著提高冻融后胚胎的发育率。结合优化的电穿孔条件，该方案可在短时间内高效地获得低嵌合率的基因敲除和基因敲入小鼠。此外，我们逐步详细阐述了优化后的实验流程，涵盖 CRISPR 试剂制备、体外受精、一细胞胚胎的冷冻保存与复苏、CRISPR 试剂的电穿孔、小鼠品系建立以及 founder 小鼠的基因型鉴定。采用本方案，研究人员将能够以前所未有的便捷性、速度和效率制备转基因小鼠。
引言
成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR 相关蛋白 9（Cas9）系统是一项科学突破，可在基因组中实现前所未有的靶向修饰1。CRISPR/Cas9 系统由 Cas9 蛋白和向导 RNA（gRNA）组成，其中 gRNA 包含两个分子组分：靶点特异性的 CRISPR RNA（crRNA）和反式激活的 CRISPR RNA（tracrRNA）2。gRNA 将 Cas9 蛋白引导至基因组中的特定位点，该位点包含与 crRNA 互补的 20 个核苷酸序列，并紧邻原间隔序列邻近基序（PAM）。Cas9 蛋白结合靶序列后，诱导产生双链断裂（DSBs），这些断裂可通过易错的非同源末端连接（NHEJ）或高保真的同源定向修复（HDR）进行修复3,4,5。NHEJ 会导致插入和/或缺失（indels），当编码序列被靶向时，从而引起基因功能丧失。HDR 则在存在包含同源序列的修复模板时，实现精确的基因组编辑3,4,5。NHEJ 和 HDR 已分别被用于构建基因敲除和基因敲入小....
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方案
本研究中所有动物护理和操作均按照《实验动物护理和使用指南》的规定和要求进行。实验方案已获得富山大学、东京大学、慈惠医科大学和马克斯·普朗克佛罗里达神经科学研究所实验动物护理委员会的批准。所有试剂的相关信息见材料表。
1. CRISPR 试剂设计
- crRNA 设计
- 访问 CRISPR direct19（https://crispr.dbcls.jp/）以设计特异性高且脱靶位点较少的 crRNA。
注意：还有许多其他有用的工具可用于设计 crRNA20（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/wereview/crisprtools/）。 - 输入目标核苷酸序列，并进行以下设置：
PAM 序列要求 = NGG
特异性检查 = 小鼠（Mus musculus）基因组，GRCm38/mm10（2011 年 12 月）
注意：例如，为构建酪氨酸酶（Tyr）基因敲除小鼠，选择外显子 2（核苷酸序列 9476–9692）作为靶向区域。 - 点击 Design，为获得高度特异性的结果，勾选 Show Highly Specific Tar....
- 访问 CRISPR direct19（https://crispr.dbcls.jp/）以设计特异性高且脱靶位点较少的 crRNA。
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结果
我们改进的一细胞胚胎冷冻保存方法，包括在含20% FBS的HTF中孵育10分钟，随后在1 M DMSO和DAP213溶液中进行冷冻保存，显著提高了冻融胚胎发育至二细胞阶段的发育率（图1，p = 0.009，Student t检验）。冻融后的胚胎用于转基因小鼠的制备，并对电穿孔条件进行了优化：使用电穿孔仪，以25 V电压进行5次重复脉冲，每次脉冲持续3 ms，间隔97 ms，具体操作详见“实验方案”部分。通过制备白化病酪氨酸酶基因（Tyr）敲除小鼠验证了该方法的适用性（图2）。为此，设计了靶向外显子2的gRNA（图2A），CRISPR试剂的制备方法如“实验方案”部分所述。在胚胎解冻后1小时内进行电穿孔，以确保基因组编辑发生在基因组首次复制之前，从而避免创始人动物出现嵌合体（图2B）。所有获得的小鼠均为白化表型，仅一只小鼠为嵌合体，其毛色呈现白色与黑色斑块相间（图.......
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讨论
本方案可高效、低嵌合率地制备转基因小鼠（表1）。该方法利用了生殖工程与基因组编辑技术领域的最新且最具实用价值的进展——CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物与冻融胚胎的电穿孔技术，使不具备高级胚胎操作技能的研究人员也能便捷地构建突变小鼠。这些技术进步显著简化并加速了转基因小鼠的制备过程。如图3所示，制备转基因小鼠约需4周时间。与其他采用类似策略的方案相比26，本方法在效率、出生率和嵌合率方面均具有优势。
在冷冻保存前，将单细胞胚胎在胎牛血清（FBS）中孵育，对于提高胚胎的发育率至关重要。方案中所述的冷冻保存胚胎的电穿孔条件，能够在CRISPR试剂的编辑效率与胚胎存活率之间取得平衡。事实上，过于剧烈或过于温和的电穿孔条件可能分别影响胚胎的发育率和编辑效率16。电穿孔的时机（图2B）至关重要，可克服 founder 个体中的嵌合现.......
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披露
作者没有相关的财务披露。
致谢
我们感谢佐田仁美和伊丽莎白·加西亚在动物护理方面提供的帮助。本研究由KAKENHI（15K20134、17K11222、16H06276和16K01946）以及北海道医学研究基金（资助H.N.）和Jichi医科大学青年研究者奖（资助H.U.）提供支持。 大塚利志美奖学金基金会为M.D.提供了资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25 M 蔗糖 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, 日本) | SUCROSE | |
| 1 M DMSO | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, 日本) | 1M DMSO | |
| 布托啡诺 | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. (东京, 日本) | Vetorphale 5mg | |
| Cas9 蛋白：Alt-R® S.p. HiFi Cas9 核酸酶 3NLS | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1081060 | |
| C57BL/6J 小鼠 | Japan SLC (滨松, 日本) | N/A | |
| DAP213 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, 日本) | DAP213 | |
| FBS | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | ES-009-C | |
| hCG | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (东京, 日本) | HCG Mochida 3000 | |
| HTF | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, 日本) | HTF | |
| ICR 小鼠 | Japan SLC (滨松, 日本) | N/A | |
| 异氟烷 | Petterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO) | 07-893-1389 | |
| KSOM | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, 日本) | KSOM | |
| 液氮罐 | Chart Industries (Ball Ground, GA) | XC 34/18 | |
| M2 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, 日本) | M2 | |
| 美托咪定 | Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (郡山, 日本) | 1124401A1060 | |
| 显微镜 | Nikon Co. (东京, 日本) | SMZ745T | |
| 咪达唑仑 | Sandoz K.K. (东京, 日本) | 1124401A1060 | |
| 无核酸酶缓冲液 | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1072570 | |
| Nucleospin DNA 提取试剂盒 | Takara Bio Inc (草津, 日本) | 740952 .5 | |
| 单孔载玻片 | Matsunami Glass Ind., Ltd. (岸和田, 日本) | S339929 | |
| 一步法电穿孔仪 | BEX Co., Ltd. (东京, 日本) | CUY21EDIT II | |
| 石蜡油 | NACALAI TESQUE Inc. (京都, 日本) | SP 26137-85 | |
| 铂金板电极 | BEX Co., Ltd. (东京, 日本) | LF501PT1-10, GE-101 | |
| PMSG | ASKA Animal Health Co., Ltd (东京, 日本) | SEROTROPIN 1000 | |
| 聚维酮碘 | Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY) | C12400 | |
| 减血清最低必需培养基：OptiMEM I | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | 22600134 | |
| 两步法电穿孔仪 | Nepa Gene Co., Ltd. (市川, 日本) | NEPA21 |
参考文献
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA - guided DNA endonuclease ....
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重印与许可
