Summary
Vi beskriver protokoll för att bedöma graden av transduktion av cell-penetrerande peptid använder ex vivo bildsystem följt av paraffin inbäddning, snittning och confocal fluorescerande mikroskopi med hjärt inriktning peptid som exempel. I vårt protokoll kan ett enda djur användas för att förvärva båda typerna av bildframställning bedömning av samma organ, vilket minskar antalet djur som behövs för studier med hälften.
Abstract
Sedan den första beskrivningen av proteintransduktionsdomäner, även känd som cellpenetrerande peptider, för över 25 år sedan, har det funnits ett intensivt intresse av att utveckla dessa peptider, särskilt cellspecifika, som nya vektorer för att leverera diagnostiska och terapeutiska material. Vårt tidigare arbete med display identifierat en ny, nonnaturally inträffar, 12 aminosyra-lång peptid som vi heter hjärt inriktning peptid (CTP) på grund av att dess förmåga att transduce normala hjärtvävnad in vivo med topp upptag ses i så lite som 15 min efter en intravenös injektion. Vi har genomfört detaljerade biodistribution studier genom att injicera CTP märkt med fluorofore cyanine5.5, gör det möjligt att cirkulera under olika tidsperioder, och avlivning, fastställande och snittning flera organ följt av fluorescerande mikroskopi imaging. I denna publikation beskriver vi dessa processer samt ex vivo imaging av skördade organ med hjälp av en in vivo bildsystem i detalj. Vi tillhandahåller detaljerade metoder och metoder för att genomföra transduktion samt biodistributionsstudier med CTP som exempel.
Introduction
Cellplasmamembranet är en semipermeabel barriär som är nödvändig för cellintegritet och överlevnad och tjänar till att reglera cellens inre genom att kontrollera förflyttningen av ämnen in i cellen. Även om det är avgörande för överlevnad, utgör det också ett hinder för leverans av last till cellen. I 1988, trans-aktivator av transkription (Tat) protein av humant immunbristvirus visade sig komma in odlade celler och främja viral gen uttryck1,2, med de domäner som ansvarar för denna transduktion begränsas till en arginin och lysin rika 13-aminosyra regionen i den tredje helix3 Dessa var således namngivna cell penetrerande peptider (CPPs). Detta följdes av forskning som visar tatpeptens förmåga att bära funktionell β-galactosidase till flera celltyper4. Sedan den första beskrivningen har antalet cellpenetrerande peptider ökat dramatiskt. Dessa transduktionsdomäner är naturligt förekommande eller syntetiska korta peptider, vanligtvis 6−20 aminosyror långa, som kan bära funktionella laster över cellmembran. Dessa laster kan variera från andra små peptider, fullängdsproteiner, nukleinsyror, nanopartiklar, viruspartiklar, fluorescerande molekyler och radioisotoler5. De ursprungliga CPPs beskrivs var inte cellspecifika, med Tat tas upp av flera celltyper och även passerar blod - hjärnbarriären4, vilket begränsar dess terapeutiska potential. För att identifiera cellspecifika CPP, utredare har genomfört display utnyttja stora, kommersiellt tillgängliga bibliotek6. Vårt eget arbete med hjälp av en kombinatorisk in vitro och in vivo display metod ledde till identifiering av en CPP som heter hjärt inriktning peptid (CTP)7, en 12-aminosyra, nonnaturally förekommande peptid (NH2-APWHLSSQYSRT-COOH) som riktar hjärtat med topp upptag på 15 min efter aven perifer intraös injektion8. Med hjälp av immunofluorescent colocalization med aktin, en intracellulär markör, och uteslutning av laminin, en cellmembran markör, visade vi att CTP internaliseras till mus kardiomyocyter efter en intravenös injektion7. Dessutom inkuberade vi mänskliga inducerad pluripotenta stamceller-härledda slå kardiomyocyter med dubbla märkta CTP, märkt med 6-carboxyfluorescein vid dess C-ändstation och rhodamin vid dess N-ändstation genom en ester länkage som endast kunde klyvas bort av intracellulära esterases. Snabb ansamling av rhodamin till att slå kardiomyocyter observerades inom 15 min på konfokalmikroskopi8.
I den här artikeln presenterar vi två kostnadsfria metoder som kan användas för att spåra biodistribution och bekräfta vävnadsspecifik internalisering av CPP med HJÄLP AV CTP som exempel. För dessa metoder var CTP syntetiseras, fluorescerande märkt vid N-ändstationen med cyanine5.5 (CY5.5), och amid-capped vid C-ändstationen för större peptid stabilitet. De två metoder som används är in vivo fluorescerande optiska bildsystem och fluorescerande mikroskopi av vävnadssektioner. Båda metoderna är mycket användbara för att studera biodistribution, upptag och eliminering av fluorescerande märkta CPP. Fördelen med att bedöma biodistribution med hjälp av dessa metoder framför andra, såsom single-photon emissions tomography (SPECT) eller positron emissions tomography (PET), är att det inte finns något behov av tidsintensiva radiomärkning av CPP jämfört med fluorescerande märkning, vilket är relativt lätt och i rutinmässig användning vid alla peptidsyntesanläggningar. Användningen av in vivo imaging producerar snabbt biodistribution data i samband med ett levande system, medan snittning ger mer djupgående information om peptid upptag och lokalisering inom celler via bevarandet av morfologiska detaljer. Detta protokoll kan tillämpas på en mängd olika organ och vävnader såsom hjärta, lunga, lever, njure, hjärna, mjälte, mage, tjocktarmen, tunntarmen, skelettmuskulaturen, ben, testiklar / äggstockar, och ögon.
Protocol
University of Pittsburgh's Institutional Animal Care and Use Committee godkände alla djurprotokoll som anges i denna publikation innan någon av dessa djurförsök.
OBS: Detta protokoll detaljer hur man utför ex vivo biodistribution studier utnyttja ex vivo optisk fluorescerande imaging följt av in vivo biodistribution studier genom att bädda in organ i paraffin, snittning, och utföra fluorescerande mikroskopi. Även om CTP används som exempel kan den här metoden användas på alla fluorescerande märkta CPP.
1. In vivo-avbildning
- Syntetisera CTP med hjälp av solida fassyntestekniker9,10 från en peptidsyntes anläggning med L-aminosyror med en N-ändstation märkt med Cy5.5 och C-ändstation amid-capped för ökad stabilitet.
OBS: Alla syntetiserade CPP bör karakteriseras med hjälp av högpresterande vätskekromatografi (HPLC) och/eller matrisassisterad laserdesorption/jonisering (MALDI) före användning11. - Gör en 1 mM eller 10 mM stamlösning av CTP i dimetylsulfaoxid (DMSO), alikvot och förvara på -80 °C, ljusskyddad.
OBS: Peptider levereras som frystorkat pulver. Lyofiliat pulver kan lagras långsiktigt (6 månader-2 år) i -20 °C, ljusskyddad och under hygroskopiska förhållanden. När aliciteras i DMSO och förvaras bör frys-töcykler undvikas. - Väga och bedöva 6 veckor gamla CD1 honmöss med 2 μL/g vävnadsvikt av en ketamin/xyazinlösning (100 mg/kg ketamin och 20 mg/kg xyazin) administreras intramuskulärt (bakben) eller intraperitoneally (nedre vänstra kvadranten).
OBS: Ketamin/xyazinlösningar bör göras färska på användningsdagen. Oanvänd ketamin/xyazin ska kasseras på lämpligt sätt och volymer som används jämfört med de volymer som kasseras registreras i en stock, eftersom ketamin är ett kontrollerat ämne. Tillräcklig anestesinivå kommer att uppnås i 5−7 min, som bedöms av bristande svar på en tå nypa. - Beräkna en dos på 10 mg/kg cy5,5-CTP, späd med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) till högst 200 μL och injicera antingen retro-orbitally eller genom svans veninjektion med en insulinspruta (figur 1A).
- Låt peptiden cirkulera under den för angivna tiden, från 15 min-6 h.
- Avliva musen med den höga COB2-inhalationsmetoden enligt definitionen i kommittén för institutionsdjursvård och användning och öppna brösthålan med sax (figur 1B ).2
- Använd sax för att placera ett litet hack i den laterala, fria väggen i höger atrium och injicera 3 ml 10% buffrad formalinfosfat med en 26 G nål för det dubbla syftet att perfusion fixera musens organ och spola ut röda blodkroppar (figur 1C).
- Dissekera ut hjärta, lunga, lever, njurar, mjälte, tjocktarmar, tunntarmen, urinblåsan, äggstockarna/testiklar, och hjärnan och placera i enskilda brunnar av en 12 brunnsplatta för ex vivo optisk avbildning (figur 1D).
- Starta bildinsamlingsprogrammet och klicka på knappen Initiera för att förbereda systemet för bildhanteringsexempel. Öppna bildbehandlingsguiden, välj fluorescens, filtrera sedan ihop, välj sedan Cy5.5-färgen från listan över färgämnen för att tillämpa 580 nm excitering och 620 nm utsläppsfilter. Välj manuella inställningar för exponeringsparametrar och ställ sedan in scenpositionen på B, ställ in exponeringstiden på 1 sekund, ställ in F/stop till 8 och ställ in binningen på små.
EXC: Excitationsemissionsfiltren varierar beroende på vilken etikett som används. Excitering och utsläpp av den använda etiketten kan anges manuellt för programvaran för att tilldela excitering och utsläppsfilter. Se till att antalet är mellan 600-60.000 för att undvika mättnad. Beroende på vilket system som används kan automatisk anskaffningsoptimering vara tillgänglig. Om systemet har kompensation för att jämföra bilder som förvärvats med olika inställningar kan de automatiska inställningarna användas. Om ingen kompensation är tillgänglig måste inställningarna bestämmas, sparas och användas konsekvent mellan exempel. - När systemet är helt initierat, ordna de organ av intresse i en 12 väl platta och placera den inne i den optiska bildbehandlingskammaren, se till att proverna är ordnade som önskas för bilderna. Välj hämta och välj sedan en spara plats för bilderna. Information om musen kan skrivas in i popup-fönstret redigera bildetiketter.
- Efter avbildning, ta bort proverna från kammaren och förvara i 10% buffrad formalinfosfat i en volym som är minst 20 gånger vävnadens volym i scintillationsflaska med ljusskydd vid rumstemperatur (RT).
- Kvantifiera bilderna genom att ställa in enheter till Radiant Efficiency och välj sedan 4x3 ROI och justera för att passa varje brunn i en kvadrat av AVKASTNINGEN jämnt, följt av att klicka på måttet. Öppna fliken ROI-mått för rutnät, välj exportera och spara måtten som en CVS-fil.
2. Histologi
Obs: Följ steg 1.1−1.8 för att få olika organ. Alternativt kan samma organ som avbildas placeras i formalin omedelbart och användas för snittning enligt beskrivningen nedan.
- Förvara varje organ individuellt i 10% buffrad formalinfosfat i minst 48 timmar före bearbetning för histologi.
- När organen är tillräckligt fixerade efter 48 timmar, överför organen till vävnadsbehandling och inbäddningskassetter och placerar sig i en vävnadsbehandlingsmaskin (figur 1E).
- Ställ in bearbetningsmaskinen för att torka av vävnaden i 70% etanol i 30 min, följt av 80% etanol i 30 min, 95% etanol för 30 min, 100% etanol för 15 min, 100% etanol för 20 min, och slutligen 100% etanol för 20 min.
- Rensa vävnaden i xylen 2x, med 30 min för varje xylenbehandling.
- Infiltrera den rensade vävnaden med paraffinvax 4x vid 60 °C i 30 min vid varje behandling.
- Bädda in i paraffin med metallformar. Fyll formen med smält paraffin (hålls vid 65 °C) och överför till en kall tallrik. När paraffinet längst ner i formen börjar stelna, placera organet i paraffinet (figur 1F).
- Placera en märkt kassett ovanpå formen som en baksida och överfyll med smält paraffin. Låt svalna tills den är fast. Förvara sedan blocket i en -20 °C frys över natten, så att vaxet att krympa ytterligare för enkel borttagning från formar.
OBS: Blocken kan nu förvaras på RT med ljusskydd. - Förbered ett vattenbad på 38 °C med destillerat vatten. Ställ in mikrotomen med en bladvinkel på 6° och en snitttjocklek på 10 μm.
- Montera vävnadsblocken i mikrotomen och börja skära tills sektioner som innehåller vävnad erhålls. Placera sedan blocken nedåt i vattnet i 5 min eller tills vävnaden har absorberat en del fukt (t.ex. när en tunn vit kontur av vävnaden visas i blocket [Figur 1G]).
OBS: Bladet bör bytas ut ofta för att säkerställa kvaliteten på sektionerna. - Placera vävnaden på ett platt isblock i 10 min och lämna sedan tillbaka den till mikrotomen i samma riktning som i steg 2.9. Börja ta sektioner och låt trunkerade avsnitt bilda långa band med 6−10 sektioner vardera. Kassera suboptimala paraffinband tills ett band av hög kvalitet med tillräcklig längd för att täcka en bild produceras. Optimera snittning genom att justera skärhastigheter, vävnadsfuktning och vattenbadtemperatur för att undvika klippning eller skrynkling av vävnadssektionerna.
OBS: Sektioner som har hål där vävnaden föll ut, sliter i vävnaden eller snäva rynkor och veck i vävnaden ska kasseras. - Välj försiktigt kvalitetsbandet med trubbiga kantt pincett och flyta på ytan av 38 °C vattenbad. Låt sektionerna sitta på ytan tills de slätar ut, var noga med att inte lämna dem för länge för att förhindra att paraffinet sönderfaller och sliter isär sektionen.
- Flyta de tillplattade sektionerna på ytan av rena glasrutschbanor. Placera rutschbanorna i en 65 °C ugn i 30 min för att smälta vaxet.
OBS: Dessa bilder kan förvaras på RT med ljusskydd. - Deparaffinisera bilderna i xylen 3x, 10 min för varje behandling.
- Rehydrera vävnaden i 100% etanol i 5 min, följt av 95% etanol för 5 min, 70% etanol för 5 min, 50% etanol för 5 min, och slutligen 1x tris-buffrad saltlösning (TBS) i 5 min (figur 1H). Låt bilderna torka över natten.
Obs: Dessa bilder kan lagras på lång sikt på RT så länge de är ljusskyddade. - Montera bilderna med täckben med 125 μL monteringsmedia som innehåller 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI), en kärnlysrörssond (figur 1I). Torra rutschkanor över natten på RT, ljusskyddade.
OBS: Torkade diabilder kan förvaras på lång sikt vid 4 °C, ljusskyddade. - Bildbilder med fluorescerande mikroskopi.
Mättade bilder bör undvikas, eftersom de inte är kvantitativt användbara. Justering av exponerings- och förstärkningsinställningarna kan sänkas för att undvika mättnad. Var noga med att använda samma inställningar över de exempel som jämförs. Undvik blekning av vävnaden genom att begränsa exponeringstiderna.
Representative Results
Med hjälp av detta protokoll behandlade vi tre möss med en dos på 10 mg/kg cy5,5-CTP genom en retro-orbital injektion (figur 1A). Efter att peptiden att cirkulera i 15 min avlivades mössen med hjälp av en CO2-kammare, bröstet öppnades genom ett median-sternotomy snitt, rätt atrium var hack, och möss perfusion fast med 3 ml 10% fosfat-buffrad formalin (Figur 1B,C). Efter fixering, hjärtat, lungorna, lever, njure, mjälte och hjärna dissekerades ut och ordnas i en 12 väl platta för ex vivo optisk fluorescerande avbildning (figur 1D och figur 2A). Tre kontrollmöss utan injektioner var också perfunderade, dissekerade och avbildade (figur 1B−D och figur 2B). Fluorescensdata som förvärvats för varje uppsättning organ kan jämföras på grund av de antal som omvandlas till strålningseffektivitet, den relativa fluorescensenheten i bildprogramvaran. Dessa data kan kvantifieras för att ge både kvalitativa bilder och kvantitativa data för varje organ i fråga (figur 2C) över olika tidpunkter för biodistributionsstudier. Autofluorescensen av olika organ som svar på olika excitation våglängder visas i figur 3A−E. Kortare excitation våglängder, såsom förbättrad grön fluorescerande protein (EGFP), är förknippade med högre autofluorescens, särskilt i lever och hjärna, än långt röda (Cy5.5) eller nära infraröd (Cy7) excitation våglängder (figur 3). De avbildade organen fixerades i 10 % fosfatbuffrat formalin vid RT i minst 48 timmar, följt av en överföring till vävnadsbearbetning och inbäddningskassetter (figur 1E). Organen bearbetades och paraffinerades i en vävnadsbehandlingsmaskin, placerade i formar fyllda med paraffin, frystes på ett -20 °C-stadium och förvarades över natten vid -20 °C (figur 1F). Proverna var sektionerade (figur 1G) och behandlades med lösningsutbyten för att rehydrera vävnaden (figur 1H). De preparerade rutschbanorna monterades sedan med DAPI-lysrörsmonteringsmedel (figur 1I). När torr, vanligtvis över natten, bilderna avbildas med fluorescerande mikroskopi. Representativa bilder av varje organ från en mus visas i figur 4A. Bilderna från olika organ förvärvades med identiska inställningar för att möjliggöra jämförelser mellan möss och för att möjliggöra kvantifiering (figur 4B).
Figur 1: Skörd av musorgan för ex vivo optisk fluorescerande avbildning och snittning. (A)Vild typ mus injiceras retro-orbitally med CTP-Cy5.5. (B) Mus dissekeras med bröstet öppnas, höger atrium klippt, för perfusion fixering. (C)Hjärtat injiceras med 3 ml 10% buffrad formalinfosfat för perfusionfixering av djuret. D)Intressanta organ som skördats och arrangerats i en 12-brunnsplatta för fluorescerande optisk avbildning. (E) Hjärtat lastas i en kassett och bearbetas med hjälp av en vävnadsprocessor. (F) Hjärta inbäddad i paraffin. (G) Hjärta uppdelade på en mikrotom. H)Diabilder deparaffineras genom en rad lösningsutbyten. I)Sektioner monterade med täckslipar med DAPI. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa bilder från behandlade organ och kontrollorgan. (A) Organ från en mus som behandlats med 10 mg/kg CTP-Cy5.5. (B)Organ från en obehandlad kontrollmus. CCKvantifiering av fluorescens för varje organuppsättning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Obehandlade muse organ avbildas vid olika excitation utsläpp våglängder för att visa hur längre våglängder producerar mindre autofluorescens. A) Cy7: 740−790. B) Cy5.5: 660−710. C) Cy5: 620−670.C D) Cy3: 520−570. E) EGFP: 480−520. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Transduktion av hjärta, lunga, lever och njure efter intravenös injektion hos möss. Möss av vild typ injicerades med 10 mg/kg Cy5,5-CTP, eller en slumpmässig peptid (RAN-Cy5.5), och avlivades vid de angivna tidpunkterna. (A)Topptransduktion av hjärtvävnad sågs vid 15 min med stadig minskning av fluorescens över tiden. Vissa kapillärupptag noterades i lungorna med robust transduktion i levern samt vid njure glomerular kapillärer, den senare innebär en njurmekanism av utsöndring. (B)Kvantifiering av fluorescerande intensitet visar signifikant ökat hjärtupptag av CTP-Cy5.5 över RAN-Cy5.5. Skalstång = 500 μm. Denna siffra har ändrats från Zahid et al.8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Djurmodeller är nödvändiga för preklinisk läkemedelsutveckling i varje skede av processen från identifiering av nya CPP, biodistributionsstudier, mekanism för transduktion, till testning för effekten av den levererade lasten med hjälp av dessa nya CPP som vektorer. Det finns många vanliga metoder för att bedöma biodistribution såsom histologi, nukleärmedicin imaging (SPECT och PET), och in vivo optisk avbildning12. Nukleära avbildningsmetoder kan vara besvärliga på grund av den begränsade tillgången på små djur SPECT och PET-system, liksom förmågan att producera radiolabel-drog konjugat, som kräver expertis av en radiokemist. Däremot är fluorescerande etiketter mycket enklare och kan vara kostnadseffektiva att arbeta med. Det protokoll som beskrivs i detta dokument möjliggör snabb analys av biodistribution med hjälp av flera metoder. Ex vivo hela organ fluorescerande optisk avbildning möjliggör omedelbar jämförelse av fluorescens över olika vävnader och behandlingsgrupper och kan identifiera organupptag och tid till topp upptag i organ av intresse på ett semikvantitativt sätt. Kvantitativ vävnad histologi kräver mer omfattande bearbetning för att behandla, avsnitt, bild, och analysera vävnader, men det ger mer data på mikroskopisk nivå och är en aktuell standardteknik. Det är värt att notera att direkt, kvantitativ jämförelse över de två teknikerna inte är möjligt, eftersom autofluorescensen sett med varje teknik för olika organ och excitation våglängder varierar avsevärt.
En viktig del av detta protokoll är att välja rätt fluorofore för att märka kandidat CPP för experiment. En potentiell fråga är spektra överlappning, vilket kan vara problematiskt när flera fluorofores behövs. DAPI-lysrörsmonteringsmaterialet och Cy5.5 har inte överlappande spektra. För vissa tillämpningar där flera fluoroforeer behövs måste dock risken för spektralöverlappning övervägas noggrant. Beroende på vilket system som används kan valet av fluorofore begränsas. Därför är kunskap om systemets kapacitet nyckeln. Fluorescerande optiska system används bäst med långröda eller nära infraröda fluorofores på grund av den höga vävnadsabsorptionen av kortare våglängder13. Fluorofores i intervallet förbättrade gröna fluorescerande protein har en stor begränsning, eftersom det finns betydande organ autofluorescens sett vid dess excitation våglängd, särskilt i hjärnan och levervävnad. Beroende på villkoren för ett experiment undviks vissa fluorofores bäst. Vissa vattenlösliga organiska fluorofores har en stark interaktion med lipid bilayers, vilket kan orsaka falska positiva. Därför, vidta åtgärder för att avgöra om en fluorofore har stark affinitet till vävnad av intresse är lämpligt14. En annan faktor att tänka på är att välja lämplig metod för fluoroforekonjugering, vilket kan vara en viktig parameter som påverkar resultaten. CpPs kan märkas fluorescerande vid N- eller C-ändstationen genom en kovalent bindning mellan N-ändstationen i peptiden och karboxylgruppen av färgen såsom Cy5.5-NHS. Försiktighet bör iakttas, eftersom mekanismen för transduktion av de flesta CPPs inte förstås i detalj och konjugation i ena änden kan påverka upptag mekanismen mer än i andra änden. En annan möjlighet för märkning av cpps är genom att biotinylera N-ändelsen för konjugering till fluorescerande märkt streptavidin. Med hjälp av denna strategi har bekvämligheten med att tillåta olika fluorescerande streptavidin konjugat som skall utnyttjas. En möjlig begränsning av denna strategi är dock att ett biotin-streptavidin komplex är en stor konstruktion, som potentiellt skulle kunna störa transduktion.
Fluorescerande optiska bildsystem är en effektiv strategi för att generera jämförelse av fluorescens mellan olika organ och behandlingar effektivt men är oförmögna att producera ett kvantitativt mått på absoluta koncentrationer i vävnad. Detta beror på ljusspridning effekter i vävnaden, som ytterligare förvärras av naturligt förekommande sort i vävnad storlekar och tätheter, och skillnader i vaskularitet, med variabel fluorescens spridning. Vävnad autofluorescens kan vara en faktor också, på grund av naturligt förekommande biokemiska källor såsom kollagen, eller kostkällor som klorofyll i livsmedel13.
Histologi är den vanligaste metoden för att mäta biodistribution och kan potentiellt användas för att noggrant mäta och jämföra upptag över olika vävnader över tiden. Ljusspridningsproblem undviks med denna metod eftersom alla vävnader är sektionerade med samma tjocklek15. En stor fördel med denna metod är förmågan att inkludera ytterligare fluorescerande etiketter postsectioning för immunohistochemistry. Även om tillägg av en annan fluorofore kan göra imaging mer utmanande, kan användningen av fluorescerande etiketter vara användbart för lokalisering av en CPP till särskilda intracellulära fack, som lysosomer eller mitokondrierna. En antikropp kan användas i en confocal mikroskopi experiment för att avgöra om en transduced kandidat CPP colocalizes med en struktur av intresse, som kan visa potentialen hos en CPP som en leverans agent. En begränsning av denna metod är att beredning av bilder från organprover kan vara tidskrävande, arbetsintensiva och benägna att mänskliga fel12,15. När bildbilder tas, var försiktig så att du inte avbildar samma plats för länge för att undvika fotoblekning. Vissa fotobleaching kommer att vara oundvikligt, beroende på känsligheten hos fluorofore. Försiktighet bör iakttas vid varje steg i detta protokoll för att skydda proverna från omgivande ljus och förvara dem ordentligt16. Vi rekommenderar att diabilder förvaras vid 4 °C, ljusskyddade, för framtida bildbehandling.
Det finns en mängd olika metoder för att mäta biodistribution av en kandidat CPP som kräver specialiserad utrustning och kan ge jämförbara resultat, även om de kan kräva mer komplexa CPP märkning. Det protokoll som beskrivs i detta dokument använder två kompatibla metoder för att effektivt producera biodistributionsdata inom ramen för ett levande system samtidigt som det möjliggör förvärv av mer djupgående information om peptid internalisering inom celler från samma prov, vilket minskar antalet djur som behövs för en studie med hälften. Dessa metoder användes för att generera ovanstående data, som visar att båda metoderna kan användas sekventiellt i samma djur, och kvaliteten på de data som genereras av varje. Våra resultat belyser också oförmågan att direkt korrelera resultaten mellan de två teknikerna på ett kvantitativt sätt.
Disclosures
M.Z. och Paul D. Robbins (University of Minnesota, Minnesota, MN, USA) innehar ett patent på användning av hjärt inriktning peptid som en hjärt vektor (Hjärt-specifika protein inriktning domän, US Patent Serial Nr 9.249.184). M.Z. fungerar också som Chief Scientific Officer och sitter i styrelsen för startupen Vivasc Therapeutics Inc. och har betydande framtida eget kapital i den.
Acknowledgments
M.Z. och K.S.F. stöds av American Heart Association Scientist Development Award 17SDG3341180, och av ett bidrag som beviljas under Pitt Innovation Challenge (PInCh®), genom Clinical and Translational Science Institute vid University of Pittsburgh.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | ThermoFisher | SF100-4 | |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | ThermoFisher | BP2471-1 | |
| 12-well Cell Culture Plate | ThermoFisher | 353043 | |
| 1x TBS Solution | 10x TBS is diluted 1:10 with deionized water. This solution can be stored at room temperature. | ||
| 20 mL Scintillation Vials | Wheaton | 334173 | |
| 26G Needles | Becton Dickinson | 305110 | |
| 28G 0.5ml Insulin syringes | Becton Dickinson | 329461 | |
| 3mL Syringe | Becton Dickinson | 309657 | |
| CD1 Mice | Charles River | 022 | 6 to 12 week old albino, female mice |
| Cover Glass | ThermoFisher | 12-544-14 | |
| Cy5.5-CTP-amide | Prepared by peptide synthesis, conjugated with Cy5.5 fluorophore, and purified using HPLC. Lyophilized powder is reconstituted in DMSO at 10mM concentration. After reconstituting, store at -80 °C. | ||
| Dapi Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 99150-20 | |
| Ethanol | |||
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Ketamine HCl 100mg/mL | KetaVed | NDC 50989-161-06 | |
| Ketamine/Xylazine Solution | Ketamine HCl is mixed with Xylazine 1:1 to produce a stock solution containing 50mg/mL ketamine and 10mg/mL Xylazine. This solution is made fresh before each use. | ||
| Leica RM2235 Rotary Microtome | Leica | RM2235 | |
| Microscope Slides | ThermoFisher | B9992000TN | |
| Paraplast X-TRA | Sigma | P3808-1KG | |
| Perkin Elmer Lumina S5 IVIS | Perkin Elmer | CLS148588 | |
| Sparkle Optical Lens Cleaner | ThermoFisher | NC0090079 | |
| Tissue-Tek Processing/Embedding Cassettes | ThermoFisher | NC9499605 | |
| Tissue-Tek VIP Processing machine | Tissue-Tek | VIP 5A-F1 | |
| Xylazine 20 mg/mL | AnaSed | NDC 59399-110-20 | |
| Xylenes | ThermoFisher | X5-4 |
References
- Green, M., Loewenstein, P. M. Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein. Cell. 55 (6), 1179-1188 (1988).
- Frankel, A. D., Pabo, C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55 (6), 1189-1193 (1988).
- Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Zahid, M., Robbins, P. D. Cell-type specific penetrating peptides: therapeutic promises and challenges. Molecules. 20 (7), 13055-13070 (2015).
- Zahid, M., Robbins, P. D. Identification and characterization of tissue-specific protein transduction domains using peptide phage display. Methods in Molecular Biology. 683, 277-289 (2011).
- Zahid, M., et al. Identification of a cardiac specific protein transduction domain by in vivo biopanning using a M13 phage peptide display library in mice. PLoS One. 5 (8), e12252 (2010).
- Zahid, M., et al. Cardiac Targeting Peptide, a Novel Cardiac Vector: Studies in Bio-Distribution, Imaging Application, and Mechanism of Transduction. Biomolecules. 8 (4), E147 (2018).
- Amblard, M., Fehrentz, J. A., Martinez, J., Subra, G. Methods and protocols of modern solid phase Peptide synthesis. Molecular Biotechnology. 33 (3), 239-254 (2006).
- Katritzky, A. R., Yoshioka, M., Narindoshvili, T., Chung, A., Johnson, J. V. Fluorescent labeling of peptides on solid phase. Organic and Biomolecular Chemistry. 6 (24), 4582-4586 (2008).
- Prabhala, B. K., Mirza, O., Hojrup, P., Hansen, P. R. Characterization of Synthetic Peptides by Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1348, 77-82 (2015).
- Arms, L., et al. Advantages and Limitations of Current Techniques for Analyzing the Biodistribution of Nanoparticles. Frontiers in Pharmacology. 9, 802 (2018).
- Leblond, F., Davis, S. C., Valdes, P. A., Pogue, B. W. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. Journal of Photochemistry and Photobiology. 98 (1), 77-94 (2010).
- Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose your label wisely: water-soluble fluorophores often interact with lipid bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).
- McGowan, J. W., Bidwell, G. L. 3rd The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987 (2016).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).
