Generación escalable de organoides cerebelosos maduros a partir de células madre pluripotentes humanas y caracterización por inmunosuización

Teresa  P. Silva; Tiago G. Fernandes; Diogo  E. S. Nogueira; Carlos  A. V. Rodrigues; Evguenia  P. Bekman; Yas Hashimura; Sunghoon Jung; Brian Lee; Maria Carmo-Fonseca; Joaquim  M. S. Cabral

doi:10.3791/61143

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Generación escalable de organoides cerebelosos maduros a partir de células madre pluripotentes humanas y caracterización por inmunosuización

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DOI:

10.3791/61143

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13 de junio de 2020

Teresa P. Silva¹^,² , Tiago G. Fernandes¹ , Diogo E. S. Nogueira¹ , Carlos A. V. Rodrigues¹ , Evguenia P. Bekman¹^,²^,³ , Yas Hashimura⁴ , Sunghoon Jung⁴ , Brian Lee⁴ , Maria Carmo-Fonseca² , Joaquim M. S. Cabral¹

¹iBB - Institute for Bioengineering and Biosciences and Department of Bioengineering, Instituto Superior Técnico, Universidade de Lisboa, ²Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, ³The Discoveries Centre for Regenerative and Precision Medicine, Lisbon Campus, Universidade de Lisboa, ⁴PBS Biotech, Inc, Camarillo, CA, USA

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un sistema de cultivo dinámico para producir agregados de tamaño controlado de células madre pluripotentes humanas y estimular aún más la diferenciación en organoides cerebelosos en condiciones definidas químicamente y libres de alimentadores utilizando un biorreactor de un solo uso.

Resumen

El cerebelo desempeña un papel crítico en el mantenimiento del equilibrio y la coordinación motora, y un defecto funcional en diferentes neuronas cerebelosas puede desencadenar disfunción cerebelosa. La mayor parte del conocimiento actual sobre los fenotipos neuronales relacionados con la enfermedad se basa en los tejidos postmortem, lo que dificulta la comprensión de la progresión y el desarrollo de la enfermedad. Modelos animales y líneas celulares inmortalizadas también se han utilizado como modelos para trastornos neurodegenerativos. Sin embargo, no recapitulan completamente la enfermedad humana. Las células madre pluripotentes inducidas por el ser humano (iPSC) tienen un gran potencial para el modelado de enfermedades y proporcionan una valiosa fuente para enfoques regenerativos. En los últimos años, la generación de organoides cerebrales a partir de iPSC derivados del paciente mejoró las perspectivas de modelado de enfermedades neurodegenerativas. Sin embargo, faltan protocolos que producen un gran número de organoides y un alto rendimiento de neuronas maduras en sistemas de cultivo 3D. El protocolo presentado es un nuevo enfoque para la generación reproducible y escalable de organoides humanos derivados de iPSC en condiciones definidas químicamente utilizando biorreactores escalables de un solo uso, en los que los organoides adquieren identidad cerebelosa. Los organoides generados se caracterizan por la expresión de marcadores específicos tanto a nivel de ARNm como de proteínas. El análisis de grupos específicos de proteínas permite la detección de diferentes poblaciones de células cerebelosas, cuya localización es importante para la evaluación de la estructura organoide. La criocisión organoidea y la inmunostaining de las rodajas organoides se utilizan para evaluar la presencia de poblaciones específicas de células cerebelosas y su organización espacial.

Introducción

La aparición de células madre pluripotentes humanas (PSC) representa una excelente herramienta para la medicina regenerativa y el modelado de enfermedades, ya que estas células se pueden diferenciar en la mayoría de los linajes celulares del cuerpo humano^1,^,². Desde su descubrimiento, la diferenciación de PSC utilizando diversos enfoques se ha informado para modelar diferentes enfermedades, incluyendo trastornos neurodegenerativos^3,^,⁴^,⁵^,⁶.

Recientemente, h....