Summary
Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerinin kontrollü boyut agregaları üretmek ve daha da kimyasal olarak tanımlanmış ve besleyici içermeyen koşullar altında serebellar organoidlerde farklılaşma uyarmak için dinamik bir kültür sistemi açıklar tek kullanımlık biyoreaktör kullanarak.
Abstract
Beyincik denge ve motor koordinasyonun korunmasında kritik bir rol oynar ve farklı serebellar nöronlarda fonksiyonel bir defekt serebellar disfonksiyonu tetikleyebilir. Hastalığa bağlı nöronal fenotipler hakkındaki mevcut bilginin çoğu postmortem dokular dayanmaktadır, bu da hastalığın ilerlemesini ve gelişimini zorlaştırır. Hayvan modelleri ve ölümsüzleştirilmiş hücre hatları da nörodejeneratif bozukluklar için model olarak kullanılmıştır. Ancak, onlar tam olarak insan hastalığı özetlemek yok. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSCs) hastalık modelleme için büyük bir potansiyele sahip ve rejeneratif yaklaşımlar için değerli bir kaynak sağlar. Son yıllarda, hasta kaynaklı iPSCs gelen serebral organoidlerin nesil nörodejeneratif hastalık modelleme için umutları geliştirdi. Ancak, organoidler çok sayıda ve 3D kültür sistemlerinde olgun nöronların yüksek verim üreten protokoller eksiktir. Sunulan protokol, organoidlerin serebeller kimlik elde ettiği ölçeklenebilir tek kullanımlık biyoreaktörler kullanılarak kimyasal olarak tanımlanmış koşullar altında insan iPSC kaynaklı organoidlerin tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir üretimi için yeni bir yaklaşımdır. Oluşturulan organoidler hem mRNA hem de protein düzeyinde spesifik belirteçlerin ekspresyonu ile karakterizedir. Belirli protein gruplarının analizi, lokalizasyonu organoid yapının değerlendirilmesi nde önemli olan farklı serebellar hücre popülasyonlarının saptanmasına olanak sağlar. Organoid kriyoselve organoid dilimlerin daha fazla immünboyama belirli serebellar hücre popülasyonlarının varlığını ve mekansal organizasyonlarını değerlendirmek için kullanılır.
Introduction
İnsan pluripotent kök hücrelerinin ortaya çıkması (PSCs) rejeneratif tıp ve hastalık modelleme için mükemmel bir araç temsil eder, Bu hücrelerin insan vücudunun en hücre soyları içine ayırt edilebilir çünkü1,2. Onların keşfinden bu yana, PSC farklılaşma farklı yaklaşımlar kullanarak farklı hastalıkların model bildirilmiştir, nörodejeneratif bozukluklar da dahil olmak üzere3,4,5,6.
Son zamanlarda, insan serebral yapıları andıran PSCs türetilen 3D kültürlerin raporlar olmuştur; bu beyin organoidlerdenir 3,7,8. Bu yapıların hem sağlıklı hem de hastaya özel SPK'lardan üretimi, insan gelişimi ve nörogelişimsel bozuklukları modellemek için değerli bir fırsat sağlamaktadır. Ancak, bu iyi organize serebral yapılar oluşturmak için kullanılan yöntemler onların büyük ölçekli üretim için uygulamak zordur. Organoidler içinde nekroz olmadan doku morfogenezini özetleyecek kadar büyük yapılar üretmek için protokoller statik koşullarda ilk nöral bağlılığa dayanır, ardından hidrojellerde kapsülleme ve dinamik sistemlerde sonraki kültür3. Ancak, bu tür yaklaşımlar organoid üretimin potansiyel ölçek-up sınırlayabilir. Kortikal, striatal, orta beyin ve omurilik nöronlar9,10,,11,,1012dahil olmak üzere merkezi sinir sisteminin belirli bölgelerine PSC farklılaşma doğrudan psc farklılaşma için yapılmış olsa da, dinamik koşullarda belirli beyin bölgelerinin üretimi hala bir sorundur. Özellikle, 3D yapılarda olgun serebellar nöronların nesil henüz tarif edilmemiştir. Muguruma ve ark. erken serebellar gelişim13 recapitulate kültür koşullarının nesil öncülük ve son zamanlarda insan embriyonik kök hücrelerin in ilk trimester serebellum anımsatan polarize bir yapı oluşturmak için izin veren bir protokol bildirdi7. Ancak, bildirilen çalışmalarda serebellar nöronların olgunlaşmaorganoidlerin ayrışması gerektirir, serebellar atalarının sıralama, ve tek katmanlı kültür sisteminde besleyici hücreleri ile coculture7,14,15,16. Bu nedenle, tanımlanmış koşullar altında hastalık modelleme için istenilen serebellar organoidlerin tekrarlanabilir nesil hala kültür ve besleyici kaynak değişkenliği ile ilişkili bir sorundur.
Bu protokol, tek kullanımlık dikey tekerlek biyoreaktörleri kullanarak 3D genişleme ve insan PsC'lerinin serebellar nöronlara etkin bir şekilde farklılaşması için en uygun kültür koşullarını sunar (spesifikasyonlar için Malzeme Tablosuna bakınız), bundan böyle biyoreaktörler olarak adlandırılır. Biyoreaktörler büyük bir dikey çark ile donatılmıştır, Hangi U-şekilli alt ile birlikte, damar içinde daha homojen bir kesme dağılımı sağlamak, azaltılmış ajitasyon hızları ile nazik sağlayan, düzgün karıştırma ve parçacık süspansiyon17. Bu sistem le daha homojen ve verimli bir farklılaşma için önemli olan şekil ve boyut kontrollü hücre agregaları elde edilebilir. Ayrıca, daha az zahmetli bir şekilde iPSC kaynaklı organoidler daha fazla sayıda oluşturulabilir.
Genellikle kök hücrelerden oluşan 3D çok hücreli yapılar olan organoidlerin ana özelliği, insan morfogenezinde görülenlere benzer şekiller oluşturan farklı hücre tiplerinin kendi kendini organizasyonudur18,19,20. Bu nedenle organoid morfolojisi farklılaşma sürecinde değerlendirilmek üzere önemli bir kriterdir. Organoidlerin kriyoseksiyonu ve organoid dilimlerinin belirli bir antikor seti ile daha fazla immünboyizasyonu, hücre çoğalması, farklılaşma, hücre popülasyon uyruk kimliği ve apoptozu analiz etmek için moleküler belirteçlerin mekansal görselleştirmesine olanak sağlar. Bu protokol ile organoid kriyokesilerin immünboyboya ilefarklılaşmanın 7. Farklılaşma sırasında serebellar kimliğe sahip çeşitli hücre popülasyonları gözlenir. Bu dinamik sistemde 35 gün sonra, serebellar nöroepitel bir apikobazal eksen boyunca organize, çoğalan atalar bir apikal tabaka ve bazal bulunan postmitotik nöronlar. Olgunlaşma sürecinde, gün 35-90 farklılaşma, serebellar nöronların farklı türleri görülebilir, Purkinje hücreleri de dahil olmak üzere (Calbindin+), granül hücreleri (PAX6+/ MAP2+), Golgi hücreleri (Nörogranin+), unipolar fırça hücreleri (TBR2+), ve derin serebellar çekirdekleri projeksiyon nöronlar (TBR1+ ). Ayrıca kültürde 90 gün sonra oluşturulan serebellar organoidlerde önemli miktarda hücre ölümü gözlenmektedir.
Bu sistemde, insan iPSC kaynaklı organoidler farklı serebellar nöronlar içine olgun ve dissociation ve besleyici coculture gerek kalmadan 3 aya kadar hayatta, hastalık modelleme için insan serebellar nöronkaynağı sağlayan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tek katmanlı kültürde insan iPSC'lerinin geçişi ve bakımı
- Plakaların hazırlanması
- 4 °C'de temel membran matrisini (Bkz. Malzeme Tablosu)eritin ve 60°L aliquots hazırlayın. -20 °C'de aliquotları dondurun.
- 6 kuyu plakasının kuyularını kaplamak için, bodrum membran matrisinin bir aliquot'unu buz üzerinde eritin. Çözüldükten sonra 6mL'den 6 mL'ye 60°L DMEM-F12 ekleyin. Yavaşça yukarı ve aşağı borular tarafından askıya.
- 6 kuyuplakasının her kuyusuna 1 mL seyreltilmiş bazal membran matris çözeltisi ekleyin ve 4 °C'de 1 haftaya kadar saklamadan önce RT'de en az 1 saat kuluçkaya yatırın.
- EDTA ile iPSC kolonilerinin geçişi
- 37 °C, %95 nem ve %5 CO 2'de kuvözde 6 kuyu plakasında tek katmanlı kültürde iPSC'lerikoruyun.
NOT: Bu protokolde, üç farklı insan iPSC hattı kullanılmıştır: F002.1A.1321, insan epizomal iPSC hattı (iPSC6.2)22ve ticari olarak elde edilen iPS-DF6-9-9T.B (Bkz. Malzeme Tablosu). - Geçişten önce, depolanan tabakları (adım 1.1) oda sıcaklığında (RT) 15 dakika kuluçkaya yatırın ve mTesR1 ortamını hazırlayın(Tablo 1).
- Serolojik bir pipet kullanarak plakadan çözeltiyi aspire edin ve hemen her kuyuya 0,5 mL mTeSR1 orta ekleyin.
- Harcanan ortamı kuyuiçeren iPSC'lerden aspire edin ve kuyu başına 0,5 mM EDTA'nın 1 mL'sini kullanarak yıkayın.
- Her kuyuya 1 mL 0,5 mM EDTA ekleyin ve 5 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
- EDTA'yı aspire edin ve hücreleri mTeSR1 ortamını hafifçe ekleyerek ve kolonileri P1000 mikropipet kullanarak borulandırarak kuyulardan çıkarın. Konik bir tüp içinde hücreleri toplamak.
NOT: Pipet hücrelerini 3x'ten fazla yukarı ve aşağı yapmayın. - Her kuyuya 1 mL hücre süspansiyonu (seyreltilmiş 1:4) ekleyin, böylece her kuyu hücre süspansiyonu eklendikten sonra 1,5 mL orta madde içerir. Hücreleri %5 CO2, 37 °C'de kuvöze geri döndürün.
- %75-80'lik biraraya geldiğinde her 3 günde bir harcanan orta ve geçişi değiştirin.
- 37 °C, %95 nem ve %5 CO 2'de kuvözde 6 kuyu plakasında tek katmanlı kültürde iPSC'lerikoruyun.
2. Biyoreaktörde insan iPSC'lerinin tohumlanması
- MTeSR1'de monolayers olarak yetiştirilen ve 10 μM ROCK inhibitörü Y-27632 (ROCKi) ile desteklenen inkübatif iPSC'ler. 6 kuyudoku kültür plakasından her kuyuya 1 mL takviyeli ortam ekleyin ve 37 °C'de 1 saat kuluçka, %95 nem ve %5 CO2 ekleyin.
NOT: ROCKi, ayrık iPSC'leri apoptosoz23'ten korumak için kullanılır.23 - Kuluçka dan sonra, her kuyudan harcanan ortamı aspire edin ve 1 mL 1× PBS ile iyi yıkayın.
- Hücre ayırma ortamının 1 mL'sini (Bkz. Malzeme Tablosu)6 kuyuluk tabakasının her kuyusuna ekleyin ve hücreler hafif sallayarak kuyulardan kolayca ayrışana kadar 37 °C'de 7 dakika kuluçkaya yatırın.
- Pipet hücreler ayrıştırıp tek hücrelere ayrışana kadar hücre ayırma orta yukarı ve aşağı bir P1000 mikropipet ile. Enzimatik sindirimi inaktive etmek için her kuyuya 2 mL tam hücre kültürü ortamı ekleyin ve hücreleri steril konik bir tüpe hafifçe pipetlendirin.
- Santrifüj 210 × g 3 dk ve supernatant kaldırın.
- Kültür ortamındaki hücre peletini yeniden askıya alın (yani, mTeSR1 10 μM ROCKi ile desteklenir) ve trypan mavi boya kullanarak iPSC'leri hemositometre ile sayın.
- Tohum 15 × 1010 6 tek hücre biyoreaktör (maksimum hacim 100 mL) ile 60 mL mTeSR1 250.000 hücre/mL son hücre yoğunluğunda 10 μM ROCKi ile desteklenmiştir.
- IPSC'leri içeren kabı 37 °C, %95 nem ve %5 CO 2'de kuvöze yerleştirilen evrensel taban ünitesineyerleştirin.
NOT: Biyoreaktör karıştırma 24 saat boyunca iPSC toplama teşvik etmek için 27 rpm evrensel temel birim kontrolü ayarlayarak korunur.
3. Serebellar organoidlerde insan iPSC kaynaklı agregaların farklılaşması ve olgunlaşması
- Tek hücre tohumlama gününü 0 gün olarak tanımlayın.
- 1. günde, serolojik pipet kullanarak iPSC agrega örneğinin 1 mL'sini toplayın. Numuneyi toplamadan önce agregaları içeren biyoreaktöre evrensel baz ünitesini yerleştirerek biyoreaktörü ajitasyon altında koruyun. Hücre süspansiyonuna ultra düşük eki 24 iyi bir plaka yla plaka koyun. iPSC kaynaklı agregaların oluşmuş olduğundan denetleyin.
- Toplam çapı ölçmek için toplam 40x veya 100x büyütme kullanarak optik mikroskopla görüntüler elde edin.
- FIJI yazılımını kullanarak her görüntüdeki agregaların alanını ölçün.
- Seçin "Analiz | Ölçümlerimenü çubuğundanayarlayın ve "Alan" ve "Tamam" düğmesine tıklayın.
- "Dosyayı Seçin | Depolanmış bir resim dosyasını açmak için menü çubuğundan "açın. Araç çubuğunda sunulan çizgi seçim aracını seçin ve resimde sunulan ölçek çubuğunun üzerinde düz bir çizgi oluşturun. Seçin "Analiz | Menü çubuğundan ölçek " ayarlayın.
- "Bilinen uzaklıkta"olarak görüntünün ölçek çubuğunun genişliğini μm'de ekleyin. "Uzunluk birimi" μm olarak tanımlayın. Ayarları korumak için "Global" ve "Ok" düğmesine tıklayın. Araç çubuğunda Oval Seçim'i seçin.
- Her agrega için oval araç ile alanı çizgi. Seçin "Analiz | Ölçü ". Agregaların yaklaşık küresel
agrega alanı olarak A ile.
- Agregaların ortalama çapı 100 μm olduğunda, harcanan ortamın %80'ini ROCKi olmadan taze mTeSR1 ile değiştirin. Agregalar çapı 200-250 μm ulaştığında, tüm harcanan ortamı gfCDM(Tablo 1)ile değiştirin ve organoidlerin biyoreaktörün altına yerleşmelerine izin olun.
NOT: Ortalama toplam çapı 350 μm'yi aşarsa, farklılaşma protokolünü başlatmayın. Tek hücrelerin tohumlama tekrarlayın. Genellikle, toplam ın ortalama çapı100 μm'ye ulaşması yaklaşık 1 gün sürer. - Kuvöze yerleştirilen evrensel baz ünitesinde agregaları içeren biyoreaktörü 37 °C, %95 nem ve %5 CO2'yeyerleştirin.
- Biyoreaktör ajitasyonını 25 rpm'ye düşürün.
- 2. günde, toplam çapı değerlendirmek için 3.2, 3.3 ve 3.4 adımlarını tekrarlayın. 30 μL FGF2 (son konsantrasyon, 50 ng/mL) ve 60 μL SB431542 (son konsantrasyon, 10 μM) ila 60 mL gfCDM farklılaştırma ortamı(Tablo 1). Biyoreaktörden harcanan tüm ortamı eklenmiş gfCDM ile değiştirin. Adımı 3.6'yı tekrarlayın.
NOT: SB431542 mezendodermal farklılaşmayı inhibe etmek için çok önemlidir, nöral farklılaşma indükleyen24. FGF2 nöroepitelyal doku25kaudalizasyon teşvik etmek için kullanılır. - 5. günde, 3.2, 3.3, 3.4 ve 3.8 adımlarını tekrarlayın.
NOT: Ayırım protokolü sırasında toplam boyutu artmalıdır. Ancak, bu parametre farklılaşmanın etkinliğini etkileyebileceğinden, çap yalnızca farklılaşma başladığında önemlidir. - 7. günde, 3.2, 3.3 ve 3.4 adımlarını tekrarlayın. Seyreltik FGF2 ve SB431542 ila 2/3: 20 μL FGF2 ve 40 μL SB431542 ila 60 mL gfCDM farklılaşma ortamı ekleyin. Biyoreaktörden harcanan tüm ortamı takviye gfCDM ile değiştirin. Adımı 3.6 tekrarlayın ve biyoreaktör ajitasyonunu 30 rpm'e yükseltin.
- 14. günde, 3.2, 3.3 ve 3.4 adımlarını tekrarlayın. 60 mL gfCDM farklılaştırma ortamına 60 μL FGF19 (son konsantrasyon, 100 ng/mL) ekleyin. Biyoreaktörden harcanan tüm ortamı FGF19 ile desteklenen gfCDM ile değiştirin. Adımı 3.6'yı tekrarlayın.
NOT: FGF19 orta-arka beyin yapılarının polarizasyon teşvik etmek için kullanılır26. - 18. günde, 3.2, 3.3, 3.4 ve 3.11 adımlarını tekrarlayın.
- 21. günde, 3.2, 3.3 ve 3.4 adımlarını tekrarlayın. Biyoreaktörden harcanan tüm ortamı komple nörobazal ortamla değiştirin(Tablo 1). Adımı 3.6'yı tekrarlayın.
NOT: Nörobazal orta organoid içinde nöronal hücre popülasyonunu korumak için kullanılan bir bazal orta7. - 28. günde, 3.2, 3.3 ve 3.4 adımlarını tekrarlayın. 60 mL tam nörobazal ortama 180 μL SDF1 (son konsantrasyon, 300 ng/mL) ekleyin. Biyoreaktörden harcanan tüm ortamı SDF1 ile desteklenen komple nörobazal ortamla değiştirin. Adımı 3.6'yı tekrarlayın.
NOT: SDF1 farklı hücre katmanları27organizasyonu kolaylaştırmak için kullanılır. - 35. günde, 3.2, 3.3 ve 3.4 adımlarını tekrarlayın. Biyoreaktörden harcanan tüm ortamı tam BrainPhys ortamıyla değiştirin(Tablo 1). Adımı 3.6'yı tekrarlayın.
NOT: BrainPhys sinaptically aktif nöronlar destekleyen bir nöronal orta28. - Her 3 günde bir toplam hacmin 1/3'unu tam BrainPhys ortamı ile 90 güne kadar değiştirin.
4. Kriyoding ve immünohistokimya için organoidlerin hazırlanması
- İmmünoboyama için organoidlerin toplanması
- Biyoreaktörden 15 mL konik tüpe serolojik pipet li organoidlerden 1 mL numune alın.
NOT: 7, 14, 21, 35, 56, 70, 80 ve 90 gün lerini de içeren farklılaşmanın etkinliğini değerlendirmek için organoidler farklı zaman noktalarında toplanmalıdır. - Supernatant çıkarın ve 1 × PBS 1 mL ile bir kez yıkayın.
NOT: Organoidleri santrifüj etmeyin. Organoidler yer çekimi ile tüpün dibinde yerleşmek sağlar. - Supernatant çıkarın ve% 4 paraformaldehit (PFA) 1 mL ekleyin. 30 dk için 4 °C'de kuluçka. Harcanan PFA'yı çıkarın ve 1 × PBS'nin 1 mL'sini ekleyin.
- Organoidleri 1 mL × PBS'de 4 °C'de kriyozeksiyon için yapılana kadar saklayın.
NOT: Fiksasyondan sonra organoidleri en fazla 1 hafta boyunca 1x PBS'de saklayın.
- Biyoreaktörden 15 mL konik tüpe serolojik pipet li organoidlerden 1 mL numune alın.
- Kriyoding için organoidlerin hazırlanması
- Depolanan organoidlerden süpernatantçıkarın. 1 mL% 15 sakaroz (w / v, 1× PBS seyreltilmiş), nazik girdap tarafından iyice karıştırın ve 4 ° C gecede kuluçka.
- %15 sakaroz/%7,5 jelatin(Tablo 2)çözeltisi hazırlayın ve jelatinin katılaşmasını önlemek için hazırlık sırasında 37 °C'de muhafaza edin.
- %15 sakaroz çözeltisini çıkarın, organoidlere %15 sakaroz/%7,5 jelatin 1 mL ekleyin ve hafif girdapile hızlı bir şekilde karıştırın. 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
- Hacminin yarısına kadar plastik bir kap için% 15 sakaroz /% 7.5 jelatin çözeltisi ekleyin. RT'de katılaşmayı bekleyin.
- 1 saat kuluçkadan sonra, pasteur pipetli katılaşmış jelatinin üzerine organoidleri içeren bir sakaroz/jelatin damlasını dikkatlice yerleştirin. Yaklaşık 15 dakika RT katılaşmak için bırakın. Kabarcık oluşumunu önlemek için emin olun.
- Konteyner dolana kadar organoidlerin üzerine %15 sakaroz/%7.5 jelatin yerleştirin. RT'de tam bir katılaşma bekleyin.
- Katılaşmadan sonra 4 °C'de 20 dk kuluçkaya yatırın.
- Jelatini merkezdeki organoidleri içeren bir küp şeklinde kesin ve o.C.T. bileşik bir damla ile karton bir parça üzerinde jelatin küp düzeltmek.
- 500 mL'lik bir kapta 250 mL isopentane yerleştirin ve uygun bir kabı sıvı nitrojenle doldurun. Forceps ve kalın eldivenler kullanarak, sıvı nitrojen yüzeyine isopentane içeren kabı dikkatlice yerleştirin ve isopentane'yi -80 °C'ye kadar soğutun.
- -80 °C'ye ulaşıldığında jelatin küpü donana kadar isopentane içeren bardağa yerleştirin ve sıcaklığı -80 °C'de tutarak. Küpün boyutuna bağlı olarak 1-2 dakika sürebilir.
NOT: -80 °C'nin altındaki sıcaklıklardan veya aşırı donma süresinden kaçının, çünkü küpün çatlamasını önleyebilir. - Dondurulduğunda jelatin küpü hızla -80 °C'de saklayın ve kriyokesit e kadar saklayın.
- Organoidlerin kriyoseksiyonu
- Kriyostat'ı açın ve -25 °C'de hem numune (OT) hem de kriyooda (CT) sıcaklıklarını tanımlayın.
- Her iki sıcaklık da dengelendiğinde, o.C.T. bileşiği kullanarak numuneüzerindeki organoidleri içeren jelatin küpü düzeltin.
- Kesit kalınlığını 12 μm olarak tanımlayın.
- Küpü kesin ve yapışma mikroskobu slaytlarında 3-4 dilim toplayın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Kullanıma kadar -20 °C'de saklayın.
- Organoid dilimlerinin immünolemi
- Organoid kesitler içeren mikroskop slaytlarını, arka arkaya 10 slayt tutarak, 50 mL önceden ısıtılmış 1x PBS içeren bir başa çıkma kavanozuna yerleştirin.
NOT: Tüm organoid kesitler sıvı ile batırılmalıdır. - Slaytları dejelatinize etmek için 37 °C'de 45 dakika kuluçka.
- 1x'i 50 mL 1× PBS ile 5 dakika boyunca RT'de yıkayın: Slaytları taze 1× PBS içeren bir copling kavanozuna aktarın.
- Slaytları 50 mL taze hazırlanmış glisin içeren bir kavanoza aktarın(Tablo 2) ve 10 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
- Slaytları %0,1 triton(Tablo 2)50 mL içeren bir copling kavanozuna aktarın ve RT'de 10 dakika permeabilize edin.
- 5 dk 2x için 1× PBS ile yıkayın.
- 1× PBS'de ıslatılmış 3 mm kağıt ile immünboyama kabını hazırlayın. Dilimlerin her yerine bir doku ile kuru slaytlar ve 3 mm kağıt üzerine yerleştirin. Pasteur pipetiyle, slayt başına ~0,5 mL ile bloklama çözeltisi(Tablo 2)ile slaytların tüm yüzeyini kaplayın. RT'de 30 dakika kuluçka.
- Fazla engelleme çözeltisini çıkarın ve slaytları dilimlerin her yerinde bir doku yla kurulayın. Ana antikordan 50 μL(Tablo 3)kesitler üzerinde bloklama çözeltisi içinde seyreltilmiş ve kapaklı dudaklarla kaplayın. Daha önce hazırlanmış bir immunostaining çanak dilimleri yerleştirin. Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Slaytları 50 mL TBST(Tablo 2)içeren bir copling kavanozuna aktarın, kapaklar düşer ve 5 dk 3x tbst ile yıkayın.
- Bloklama çözeltisinde seyreltilmiş ikincil antikordan 50 μL'lik kısmı bölümlerin üzerine yerleştirin ve kapaklı dudaklarla kaplayın. Dilimleri önceden hazırlanmış immün boyama kabına yerleştirin. RT'de 30 dakika boyunca ışıktan korunan kuluçka.
- Slaytları tekrar bir copling kavanozuna aktarın ve 5 dk 3x için 50 mL TBST ile yıkayın.
- Dilimlerin her yerine bir doku ile slaytlar kuruve daha önce hazırlanmış bir immunostaining çanak dilimleri yerleştirin. Pasteur pipeti ile slaytların tüm yüzeyine 0,5 mL DAPI çözeltisi ekleyin. RT 5 dakika kuluçka.
- Adımı 4.4.9'u tekrarlayın.
- Slaytları bir doku ile dikkatlice kurulayın. Slayt boyunca damla damla 50 μL montaj orta damla ekleyin ve sonra dikkatlice kabarcıklar önlemek için hafifçe bükerek, her slayt üzerine bir coverslip indirin.
- Organoid kesitler içeren mikroskop slaytlarını, arka arkaya 10 slayt tutarak, 50 mL önceden ısıtılmış 1x PBS içeren bir başa çıkma kavanozuna yerleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokol, 0.1 L biyoreaktörler(Şekil 1A)kullanılarak hücre agregasyonu teşvik edilerek başlatılmıştır. 250.000 hücre/mL ile 60 mL orta alanda 27 rpm ajitasyon hızıile tek hücreli aşılama yapıldı. Bu gün 0 olarak tanımlanmıştır. 24 saat sonra hücreler spheroid şekilli agregaları (gün 1, Şekil 1B)verimli bir şekilde oluşturdular ve morfoloji 5. (Şekil 1B). Mikroskopi ile yapılan bir kantitatif analizde, agrega boyutlarının 1. güne göre normal dağılımı saptandır(Şekil 1C). Toplam boyutu, hücrelerin farklı soylara doğru ayırt etmesini isteyen önemli bir fiziksel parametredir29,30. Bu nedenle, önceki çalışmalarda bildirilen toplam büyüklüğüne göre etkin bir nöral31,32 ve serebellar bağlılık21,oluşturulan agregalar 25 rpm'de mTeSR1 ortamda, farklılaşmaya başlamadan önce istenilen çapa ulaşıncaya kadar korunmuştur (~200 μm). 2. günde, F002.1A.13 hücre hattı için ortalama çapı 221.0 ± 54.4 μm (ortalama ± SD) ve 212.1 ± 42.1m idi. Bu nedenle, her iki hücre hattı da bu zaman noktasında en uygun toplam boyutuna ulaşmıştır (Şekil 1C).
İstenilen agrega çapına ulaştıktan sonra, 2. Daha sonra, FGF19 ve SDF1 farklı serebellar atalarının neslini tanıtmak amacıyla sırasıyla 14 ve 28. Nöral indüksiyonun ilk günlerinde, daha büyük agregaların birikmesi ve kümelenmesini önlemek için 7 gün sonra 30 rpm'ye yükseltilen 25 rpm dönüş hızı kullanılmıştır(Şekil 2A). Ayırım sırasında organoidler, luminal alana sahip nöral tüp benzeri yapılara benzer daha belirgin bir epitelizasyon gösterdiler (Şekil 2B). Ayrıca organoid çap dağılımının değerlendirilmesi, ilk serebellar bağlılık sırasında 14. güne kadar homojen boyut dağılımı nı göstermiştir(Şekil 2B).
İmmünofloresans analizi, iPSC kaynaklı organoidlerin etkin bir nöral bağlılığının FGF2 ve SB431542'yi ekledikten sonra 7. Organoidlerin kriyokesitleri PAX6 ve NESTIN için nöral tüp boyamaan birçok yapıyı ortaya koymuştur, organoidler içindeki hücrelerin çoğu 7 ve 14' üncü yıllarda diferansiyasyon(Şekil 2C)sırasında progenitor belirteç NESTIN'i ifade eder. Daha sonra, FGF19 ve SDF1 sürekli çoğalan ata katmanları (PAX6+) ve verimli bir nöronal farklılaşma üretimi terfi, TUJ1 ifade gösterildiği gibi, nöron özgü sınıf III beta-tubulin, gün 21 ve 35(Şekil 2C). Buna ek olarak, etkili bir serebellar farklılaşma da gözlendi 21 gün sonra 0.1 L VW biyoreaktörler, iki farklı hücre popülasyonlarının varlığı ile gösterilmiştir: granül hücre ataları (BARLH1+ hücreler, Şekil 3A), ve Purkinje hücre ataları (OLIG2+ hücreleri, Şekil 3B). Kültürde 35 gün sonra, organoidler içinde farklı hücre popülasyonları farklı katmanlar halinde organize olduğu ortaya çıktı. Organoidler içinde çeşitli düz-oval yapılar barhl1+ dorsal serebellar atalar ile organoidin yüzeysel tarafında sürekli bir tabaka olarak gözlendi (Şekil 3C,D) ve SOX2+ Bu oval yapıların luminal bölgesinde(Şekil 3D). Buna ek olarak, TUJ1+ yenidoğan nöronlar yüzeye doğru göç ortaya çıktı, organoid dış yüzeyinde radyal hizalama yeniden (Şekil 3E).
Serebellar atalarının nesil sonra, daha fazla olgunlaşma BrainPhys orta kullanılarak teşvik edildi28 nörotrofik faktörler BDNF ve GDNF ile desteklenmektedir. Serebellar nöronların farklı alt tiplerini saptamak için organoid kriyokesilerin immünoresans boyaması kullanıldı. Purkinje hücreleri, kalsiyum bağlayıcı protein kalbindin ifade GABAerjik nöronlar (CALB, Şekil 3F),olgunlaşma protokolü nden sonra serebellar organoidlerde saptandı. Buna ek olarak, başka bir majör serebellar nöronal tip, granül hücreleri, PAX6 ve MAP2 coexpressing hücrelerin bir alt kümesi olarak tespit edildi(Şekil 3G). İlginçtir, PAX6+ ataları MAP2 ifade olmayan bir havuz farklılaşma 80 gün kadar muhafaza edildi. TBR2(Şekil 3H)ifade eden tekipolar fırça hücreleri ve TBR1'i ifade eden derin serebellar nüksüm projeksiyon nöronları da dahil olmak üzere diğer serebellar nöron tipleri de saptanmıştır (Şekil 3I). Etkin serebellar farklılaşma ve olgunlaşmaya ek olarak, PBS 0.1 L VW biyoreaktörleri kullanan bu 3D dinamik kültür sistemi, organoidlerin önemli hücre ölümü ve nekroz olmaksızın 90 güne kadar canlı kalmasını sağlamıştır (Şekil 3J).
Şekil 1: Ölçeklenebilir biyoreaktörler kullanılarak boyut kontrollü agregaların üretimi. (A) Biyoreaktörün tasarım özellikleri. (B) Brightfield fotomikrografı, 1, 2 ve 5. Ölçek çubuğu = 100 μm. (C) Biyoreaktörlerdeki farklı iPSC hatlarından yüzen agregaların boyut dağılımı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 0.1 L biyoreaktörler kullanılarak insan iPSC kaynaklı organoidlerin üretimi. (A) Serebellar organoidler için iPSCs farklılaşmasını neden kültür prosedürü şematik gösterimi. Hücreler 250.000 hücre/mL yoğunlukta tohumlanmış ve hücre toplamayı teşvik etmek için 27 rpm ajitasyon hızı kullanılmıştır. Farklılaşmanın ilk günlerinde, agregalar 25 rpm ajitasyon hızında muhafaza edildi. Daha sonra, daha büyük agregaların birikimini önlemek için ajitasyon hızı 30 rpm'ye çıkarıldı. (B) Organoid şekil ve boyutun karakterizasyonu. 0.1 L VW biyoreaktörlerde serebellar farklılaşma sırasında iPSC türetilmiş organoidleri gösteren brightfield fotomikrograflar. Ölçek çubuğu = 100 μm. Organoid çaplarının dağılımı, kültürün farklılaşma protokolü boyunca homojen organoid boyutlarını koruduğunu göstermektedir. (C) IPSC kaynaklı organoidlerde etkin nöral indüksiyon. Serebellar farklılaşma sırasında NESTIN, PAX6 ve TUJ1 için immünofloresans. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İnsan iPSC kaynaklı organoidlerde etkin serebellar farklılaşma ve olgunlaşma. (A-E) Etkili serebellar bağlılık. Serebellar farklılaşma protokolünün belirtilen zaman noktalarında BARHL1, SOX2, OLIG2, NCAD ve TUJ1 belirteçleri için immünboyama analizi. (F-I) İnsan iPSC türetilmiş serebellar organoidlerin verimli olgunlaşması. Purkinje hücreleri (CALB, F), granül hücreler (PAX6 ve MAP2, G), tek kutuplu fırça hücreleri (TBR2) ve derin serebellar nükleus projeksiyonları nöronlar (TBR1) dahil olmak üzere serebellar nöronların farklı gösteren immünfloresans. (J) Serebellar olgunlaşma sonrası yüksek hücre canlılığı. Canlı/ölü (calcein-AM, yeşil ve propidium iyodür, kırmızı) organoidlerin boyanmasının yüksek hücre canlılığı ve biyoreaktörlerde 80 gün sonra nekrotik alanlara dair hiçbir kanıt göstermemede. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Medya hazırlığı |
mTeSR1 Son hacim: 500 mL |
1. Çözülme mTeSR1 5× ek oda sıcaklığında (RT) veya 4 °C gecede ve bazal orta ile karıştırın 2. Tam mTeSR1 ortamını 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın veya -20 °C'de 40 mL aliquot hazırlayın ve saklayın 3. Kullanmadan önce RT'de önceden ısıtmalı komple mTeSR1 |
|
gfCDM (büyüme faktörüolmayan kimyasal olarak tanımlanmış ortam) Son cilt: 60 mL |
30 mL Ham F12 30 mL IMDM 600 μL kimyasal olarak tanımlanmış lipid konsantresi (1 % v/v) 2.4 μL monotiyogliserin (450 μM) 30 μL apo-transferrin (suda 30 mg/mL stok çözeltisi, son konsantrasyon: 15 g/mL) 300 mg kristalizasyon-saflaştırılmış BSA (5 mg/mL) 42 μL insülin (stok konsantrasyonu 10 mg/mL, son konsantrasyon: 7 g/mL) 300 μL P/S (%0.5 v/v, 50 U/ml penisilin/50 g/ml streptomisin) |
|
|
Nörobazal Son cilt: 60 mL |
Nörobazal orta 60 mL 600 μL N2 takviyesi 600 μL Glutamax I 300 μL P/S (%0.5 v/v). |
|
|
Tam BrainPhys Son cilt: 60 mL |
BrainPhys 60mL 1.2 mL NeuroCult SM1 Nöronal Eki 600 μL N2 Eki 12 μL BDNF (son konsantrasyon: 20 ng/mL) 12 μL GDNF (son konsantrasyon: 20 ng/mL) 300 μL Dibutyryl-cAMP (stok konsantrasyonu: suda 100 mg/mL, son konsantrasyon: 1 mM) 42 μL askorbik asit (stok konsantrasyonu: suda 50 μg/mL, son konsantrasyon: 200 nM) |
|
| Büyüme faktörleri nin ve küçük moleküllerin stok çözümleri |
Temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF/FGF2) Stok konsantrasyonu: 100 μg/mL |
1. 10 mg/mL konsantrasyonda 5 mM Tris, pH 7.6'da yeniden oluşturma 2. PBS 'de (v/v) %0,1 BSA ile seyreltilen son stok konsantrasyonu 100 g/mL |
|
Stromal hücre türetilmiş faktör 1 (SDF1) Stok konsantrasyonu: 100 μg/mL |
1. 10 mg/mL konsantrasyonda suda yeniden oluşturma 2. PBS'de %0,1 BSA (v/v) ile 100 μg/mL'lik son stok konsantrasyonuna seyreltin. |
|
|
Beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) Stok konsantrasyonu: 100 μg/mL |
||
|
Glial hücre kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF) Stok konsantrasyonu: 100 μg/mL |
||
|
Fibroblast büyüme faktörü 19 (FGF19) Stok konsantrasyonu: 100 μg/mL |
1. 10 mg/mL konsantrasyonda 5 mM sodyum fosfat, pH 7.4 2. PBS 'de (v/v) %0,1 BSA ile seyreltilen son stok konsantrasyonu 100 g/mL |
|
|
KAYA inhibitörü Y-27632 Stok konsantrasyonu: 10mM |
DMSO'da 10 mM konsantrasyonda yeniden oluşturulun. | |
|
SB431542 Stok konsantrasyonu: 10mM |
||
|
Insülin Stok konsantrasyonu: 10 mg/mL |
1. 10 mM NaOH'un 300 μL'sinde 10 mg insülini yeniden oluşturma 2. Çözelti net-saydam hale gelene kadar dikkatlice 1 M NaOH ekleyin 3. Steril su ile 1 mL doldurun. |
Tablo 1: Stok çözümleri ve ortam hazırlama. Listelenen tüm bileşenleri ve hacimleri iPSCs bakım ve farklılaşma protokolü için medya hazırlamak için kullanılan yanı sıra büyüme faktörleri ve küçük moleküllerin stok çözümleri. Stok çözümleri için, tüm stok konsantrasyonu ve yeniden yapılanma protokolleri listelenir.
|
Jelatin/Sakaroz Son konsantrasyon: 7.5%/15% w/w |
1. Steril Schott Cam Şişe'de 15 g sakaroz ve 7,5 g jelatin tartın ve iyice karıştırın 2. PBS 1× 65 °C'de Önceden ısıtın 3. Önceden ısıtılmış PBS 1× 100 g son ağırlığına ekleyin ve iyice karıştırın 4. Schott Cam Şişeyi 65 °C'de bir ısıtma plakası içinde yerleştirin ve jelatin eriyene kadar sallayın 5. Çözelti stabilize olana kadar 37 °C'de kuluçka |
|
Glycine Son konsantrasyon: 0.1 M |
Yeni hazırlanmış PBS 1× 50 mL'ye 0,37 g glisin ekleyin. |
|
Triton çözeltisi Son konsantrasyon: 0.1 % w/v |
1. % 10 Triton X-100 stokhazırlayın: 5 g Triton X-100 50 mL PBS 1× 2. 0,5 mL Triton X-100 stoğunu 50 mL PBS 1× ekleyin. |
|
TBST 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, %0.05 w/v Tween-20 |
20 mL Tris 1 M 30 mL NaCl 5 M 5 mL Tween-20 (% 10 stok: 50 mL suda 5 g Tween-20) 1 L'ye kadar su ile doldurun. |
| Engelleme Çözümü | 5mL fetal büyükbaş serum (FBS, son konsantrasyon: % 10 v/v) ila 50 mL TBST ekleyin. |
| DAPI çözümü | 10 mL destilated suya 15 μL DAPI stok çözeltisi (1 mg/mL) ekleyin |
| Mowiol | 1. 2,4 g Mowiol ila ve gliserol 6 g ekleyin ve 50 °C'de önceden ısıtılmış bir tabakta 1 saat çalkalayın 2. 6 mL distile su ekleyin ve 2 saat çalkalayın 3. Tris 200 mM (pH 8.5) 12 mL ekleyin ve 10 dakika sallayın 4. Santrifüj 5.000 × g 15 dk için 5. Aliquot ve saklamak -20 °C. |
Tablo 2: Kriyosiksiyon ve immünboyama için organoidlerin hazırlanması için çözümler. Listelenen kriyoseksiyon ve immünboyama için organoidlerin hazırlanmasında kullanılan çözümleri hazırlamak için kullanılan tüm bileşenleri ve hacimleri vardır.
| Antikor | Ev sahibi türler | Seyreltme |
| BARHL1 | Tavşan | 1/500 |
| CALBINDIN | Tavşan | 1/500 |
| HARİtA2 | Fare | 1/1000 |
| N-KADHERIN | Fare | 1/1000 |
| NESTIN | Fare | 1/400 |
| OLIG2 | Tavşan | 1/500 |
| PAX6 | Tavşan | 1/400 |
| SOX2 | Fare | 1/200 |
| TBR1 | Tavşan | 1/200 |
| TBR2 | Tavşan | 1/200 |
| TUJ1 | Fare | 1/1000 |
Tablo 3: Primer antikorlar. Primer antikorlar, klon ve immünboyama için kullanılan optimize edilmiş seyreltikler listelenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uyuşturucu taraması ve rejeneratif tıp uygulamaları için belirli hücre tipleri oluşturmak için büyük hücre numaralarının yanı sıra tanımlanmış kültür koşullarına duyulan ihtiyaç ölçeklenebilir kültür sistemlerinin gelişmesine yol açmıştır. Son yıllarda, çeşitli gruplar nöral atalar ve fonksiyonel nöronların ölçeklenebilir nesil bildirdin32,33,34, nörodejeneratif bozukluklar için yeni modellerin geliştirilmesinde önemli gelişmeler sağlayan. Yine de, embriyonik gelişim bazı kritik olayların recapitulation hala eksik, ve uzun süre süspansiyon üretilen fonksiyonel nöronların bakımı henüz elde edilmemiştir34. Burada sunulan dinamik bir 3D kültür sistemi serebellar kimlik ile iPSC türetilmiş nöral organoidler oluşturmak ve daha fonksiyonel serebellar nöronlar içine dinamik kültür kimyasal olarak tanımlanmış ve besleyici içermeyen koşullar altında olgunlaşma teşvik etmektir.
Serebellar farklılaşma başlamadan önce, insan iPSCs kalitesini korumak için önemlidir. Bu nedenle, farklılaşmadan ödün vermemek için, çözülmeden biyoreaktör aşısına kadar en fazla üç iPSC pasajı yapılmalıdır. Ayırt etme protokolünde önemli bir adım, toplam boyutunu değerlendirmektir. Toplam boyutu belirli bir hücre soyu doğru farklılaşma neden kritik bir role sahiptir29. Bunun yanı sıra, farklılaşma35lehine görünen bir minimum boyut eşiği vardır. Daha önce bildirildiği gibi, etkili bir nöral bağlılık teşvik etmek için optimal iPSC türetilmiş agrega çapı31,32 ve serebellar farklılaşma21 ~ 200 μm çapındadır.
Ayrıca, bu dinamik protokolde, kültürün ilk günlerinde kullanılan ajitasyon hızı toplam çapı ve nöral indüksiyonu kontrol etmek için çok önemlidir. Kültür 27 rpm'de başladı, bu da iPSC'lerin toplanmasının desteklenmesi ve daha büyük agregaların oluşmasını önlemek için yeterlidir (350 μm'nin üzerindeki çaplardan kaçınılmalıdır). Tek hücreli tohumlama dan sonra hücre agregasyonunu teşvik etmek için kullanılan ajitasyon hücre canlılığını etkilemeden 30 rpm'ye yükseltilebilir; ancak, daha yüksek ajitasyon hızları daha küçük agregalar üretmek için bekleniyor. IPSC hattına bağlı olarak, hücre tohumlamadan 24 saat sonra 27 rpm kullanılarak iki farklı senaryo beklenmektedir: oluşan agregalar daha küçük çaplarda (<200 μm) veya 200-300 μm arasında bir boyut aralığına ulaşmıştır. Hücre tohumlamadan sonra 24 saat agrega350 μm'den büyükse, farklılaşma yapılmamalı ve hücre tohumlaması tekrarlanmalıdır, çünkü farklılaşmanın etkinliği çok düşük olacaktır. Agregalar 200 μm'den küçükse, harcanan ortam iPSC bakım ortamı ile değiştirilmeli ve ajitasyon hızı 25 rpm'ye düşürülmelidir. Bu ayarlama ile, muhtemelen ajitasyon hızındaki azalmanın teşvik ettiği bireysel agregaların birleşmesi nedeniyle, toplam çapının 1 günden 2.güne kadar artması beklenmektedir. 200-300 μm arasında ebatları olan agregalarda harcanan ortam farklılaşma ortamı ile değiştirilmeli ve kültürde 2 gün sonra FGF2 ile nöral indüksiyona başlanmalıdır. Bu noktada, ajitasyon hızı da biraz aşırı hücre ölümü önlemek için azaltılmalıdır, hücreler farklılaşma ortamı varlığında kesme strese daha duyarlı olduğu için. Ayrıca, popülasyon homojenliği, denkleme göre standart sapmaile toplam çaportalaması arasında ilişkilendirilerek değişkenliği ölçen varyasyon katsayısı (CV) kullanılarak analiz edilebilir.
δ toplam çapının standart sapması temsil eder ve μ ortalama çaptır. Bu dinamik sistemde, f002.1A.13 hücre hattı için %12.5 ± %3.3 (ortalama ± SD) ± ve 2. Bu nedenle, bu sistemde, CV'si 0,2'nin altında olan homojen bir popülasyon (< varyasyonun %20'si) beklenmelidir. 7 günlük farklılaşmadan sonra ortalama toplam çapı 300-360 μm arasında değişmekteydi ve 0.1 L VW biyoreaktörün dibine yerleşmek için ajitasyon hızı 30 rpm'ye çıkarıldı.
Serebellar organoidlerin 35.21 Yazarlar 3D agregalar oluşan ve plakalar (örneğin, Aggrewell) gün 7 farklılaşma kadar oluşturulan ve muhafaza boyut ve şekil21homojen olduğunu gösterdi. Ancak, ultra-düşük eki 6 iyi kültür plakaları agregalar aktardıktan sonra, agregalar boyutu vemorfolojisi 21değişmeye başladı. 35. günde statik koşullarda, 3D agregalardan bazıları farklı hücre hatları için 1.000 μm'ye ulaştı ve bu da besin ve oksijen difüzyonunu sınırlasaydı. Buna karşılık, dinamik koşullarımızı kullanarak, agregalar 35. Ayrıca, toplam boyutları olgunlaşma sürecinin sonuna kadar muhafaza edildi, gün 90 tarafından 646.6 ± 104.2 μm toplam çapı gösteren, 0.1 L VW biyoreaktörler de yapılan en uzun kültür.
Bu 3D dinamik sistemde SB431542, FGF2, FGF19 ve SDF1'in sıralı eklenmesiyle etkin serebellar indüksiyona neden oldu. Protokol, mesendodermal farklılaşmayı inhibe eden bir transformasyon faktörü beta (TGF-ß)-reseptör blokeri ve nöroepitel doku25kaudalizasyonda önemli bir etkiye sahip FGF2 olan SB431542 kombinasyonu ile başlar. Bu nedenle, kültürün ilk günlerinde bu iki molekülün eklenmesi orta-arka beyin hücre farklılaşması teşvik etmek için esastır, serebellar doku ya yılını veren bölge. Orta-arka beyin dokusuna ilk indüksiyon sonra, dorsal-ventral polarite ile orta-arka beyin yapıların spontan nesil teşvik için FGF19 eklemek için gerekli, yanı sıra farklı serebellar atalarının üretimi36,26. SDF1 serebellar nörogenezi oluşur gelişim aşamasında görüldüğü gibi, serebellar atalarının farklı tabakaların organizasyonu kolaylaştırır27. Gün 35 kadar, Bu moleküller insan serebellar gelişimi recapitulate serebellar organoidlerin organizasyonu teşvik edebilir, hangi ilk trimester serebellum karşılık gelir. Farklı tabakalarda serebellar atalarının organizasyonu ndan sonra, tanımlanmış bir nöronal ortam onların olgunlaşma teşvik etmek için kullanılmıştır28. Nöronal hücreleri korumak için kullanılan diğer medya da test edilebilir, ancak düşük verimlilik bekleniyor. Böylece, Bu protokolde, BrainPhys serebellar nöronlara serebellar kararlı hücrelerin farklılaşmasını teşvik etmek için kullanılmıştır, daha iyi sağlıklı nöronal ortamı taklit etmek ve oluşturulan nöronların nörofizyolojik aktivitesini desteklemek için bildirilmiştir çünkü28.
Bu dinamik koşullar kullanılarak, besin, oksijen ve büyüme faktörlerinin daha verimli difüzyon elde edilebilir. Ancak, bazı sınırlamalar farklılaşma protokolünde kullanılan ajitasyon ile ilişkilidir. Bazı kesme stresi ajitasyon süreci ile tanıtılabilir, hangi hücrelerin hayatta kalmasını etkileyebilir, çoğalma, ve hücrelerin farklılaşması. Bu nedenle, hücrelerin daha hassas olduğu olgunlaşma adımı sırasında, kültür dikkatle izlenmelidir.
İnsan embriyonik serebellar gelişimini anımsatan serebellar organoidlerin farklılaşması bildirilmiştir7. Ancak, bu embriyonik serebellar organoidlerin 3D kültürleri kullanarak serebellar nöronlar içine daha fazla olgunlaşma bir sorun olmaya devam etmektedir. Fonksiyonel serebellar nöronların üretimi sadece çeşitli kaynaklardan granül hücreleri ile kokülatarak elde edildi4,7,15. Bu protokol başarıyla insan iPSCs serebellar bağlılık ölçekli; buna ek olarak, bu besleyici hücreleri ile kokülasyon olmadan bir 3D kültür sisteminde farklı serebellar nöronların farklılaşması için ilk protokoldür. Özellikle, aşağıdaki hücre tipleri dinamik kültür sistemimizde üretilebilir: Purkinje hücreleri (Calbindin+), granül hücreleri (PAX6+/MAP2+), tek kutuplu fırça hücreleri (TBR2+), ve derin serebellar çekirdekleri projeksiyon nöronları (TBR1+), 3 ay kadar uzun süre süspansiyon da muhafaza edildi.
Serebellar organoidlerin ölçeklenebilir nesil serebellum embriyonik gelişimi ve bu organın dejenerasyonu dahil patolojik yolları incelemek için değerli bir araç temsil eder. Ayrıca, serebellar fonksiyonu geri moleküller için yüksek iş lenme taraması bu ölçeklenebilir sistem ile elde edilen organoidler kullanılarak yapılabilir. Genel olarak, bu yöntem biyomedikal uygulamaların çeşitli için önemli olabilir yüksek kaliteli serebellar organoidler üretimi için ölçeklenebilir bir protokol için karşılanmamış bir ihtiyacı karşılar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar YH ve SJ PBS Biotech çalışanlarıdır. Yazar BL, PBS Biotech, Inc.'in CEO'su ve kurucu ortağıdır. Bu işbirlikçi yazarlar el yazmasında kullanılan biyoreaktörlerin geliştirilmesine katıldılar. Bu, yazarların veri ve materyallerin paylaşılmasına ilişkin derginin tüm ilkelerine bağlılığını değiştirmez. Diğer tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmez.
Acknowledgments
Bu çalışma Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portekiz (UIDB/04565/2020 programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Project N. 007317, PD/BD/105773/2014 to T.P.S ve PD/BD/128376/2017 to D.E.S.N., FEDER tarafından ortaklaşa finanse edilen projeler (POR Lisboa 2020—Programa Operacional Regional de Lisboa PORTEKIZ 2020) ve FCT hibe PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 ve CEREBEX Nesil Serebellar Organoidler AtaksiA Araştırma hibe LISBOA-01-0145-FEDER-029298. 739572 sayılı Hibe Anlaşması kapsamında Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Programı'ndan da fon alındı- Keşifler Rejeneratif ve Hassas Tıp Keşifler Merkezi H2020-GENİş-01-2016-2017.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3MM paper | WHA3030861 | Merck | |
| Accutase | A6964 - 500mL | Sigma | cell detachment medium |
| Anti-BARHL1 Antibody | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
| Anti-Calbindin D-28k Antibody | CB28 | Millipore | |
| Anti-MAP2 Antibody | M4403 | Sigma | |
| Anti-N-Cadherin Antibody | 610921 | BD Transduction | |
| Anti-NESTIN Antibody | MAB1259-SP | R&D | |
| Anti-OLIG2 Antibody | MABN50 | Millipore | |
| Anti-PAX6 Antibody | PRB-278P | Covance | |
| Anti-SOX2 Antibody | MAB2018 | R&D | |
| Anti-TBR1 Antibody | AB2261 | Millipore | |
| Anti-TBR2 Antibody | ab183991 | Abcam | |
| Anti-TUJ1 Antibody | 801213 | Biolegend | |
| Apo-transferrin | T1147 | Sigma | |
| BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 - 500mL | Stem cell tecnhnologies | |
| Chemically defined lipid concentrate | 11905031 | ThermoFisher | |
| Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
| Crystallization-purified BSA | 5470 | Sigma | |
| DAPI | 10236276001 | Sigma | |
| Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
| DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
| Fetal bovine serum | A3840001 | ThermoFisher | |
| Gelatin from bovine skin | G9391 | Sigma | |
| Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
| Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
| Glycine | MB014001 | NZYtech | |
| Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
| Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
| IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
| Insulin | 91077C | Sigma | |
| iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
| Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
| L-Ascorbic acid | A-92902 | Sigma | |
| Matrigel | 354230 | Corning | basement membrane matrix |
| Monothioglycerol | M6154 | Sigma | |
| Mowiol | 475904 | Millipore | mounting medium |
| mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
| N2 supplement | 17502048 | ThermoFisher | |
| Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
| Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
| PBS-0.1 Single-Use Vessel | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
| PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
| Recombinant human BDNF | 450-02 | Peprotech | |
| Recombinant human bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
| Recombinant human FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
| Recombinant human GDNF | 450-10 | Peprotech | |
| Recombinant human SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
| SB431542 | S4317 | Sigma | |
| Sucrose | S7903 | Sigma | |
| SuperFrost Microscope slides | 12372098 | ThermoFisher | adhesion microscope slides |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
| Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
| Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
| Tween-20 | P1379 | Sigma | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Thomson, J. A. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Ishida, Y., et al. Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs. Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).
- Liu, Y., Zhang, S. C. Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).
- Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162 (2), 375-390 (2015).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Aubry, L., et al. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).
- Gunhanlar, N., et al. A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).
- Hu, B. Y., Zhang, S. C. Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells. Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).
- Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Muguruma, K., et al. Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells. Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).
- Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells. The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).
- Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Science Reports. 5, 9232 (2015).
- Tao, O., et al. Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).
- Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies. Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144 (6), 976-985 (2017).
- Lou, Y. R., Leung, A. W. Next generation organoids for biomedical research and applications. Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).
- Silva, T. P., et al. Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering. Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).
- Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).
- Yaguchi, Y., et al. Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development. Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).
- Fischer, T., et al. Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis. Developmental Biology. 350 (2), 496-510 (2011).
- Bagri, A., et al. The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells. Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).
- Bardy, C., et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).
- Bauwens, C. L., et al. Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
- Miranda, C. C., et al. Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment. Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells. Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).
- Bardy, J., et al. Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells. Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).
- Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
- Arora, N., et al. A process engineering approach to increase organoid yield. Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).
- Gimeno, L., Martinez, S. Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh. Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).
