Summary
Denne protokollen beskriver en ny teknikk for å måle de tre viktigste parametrene for iskemisk hjerneskade på samme sett med gnagerhjerneprøver. Bruk av bare én hjerneprøve er svært fordelaktig når det gjelder etiske og økonomiske kostnader.
Abstract
En av de vanligste årsakene til sykelighet og dødelighet over hele verden er iskemisk slag. Historisk, en dyremodell som brukes til å stimulere iskemisk slag innebærer midten cerebral arterie okklusjon (MCAO). Infarct sone, hjerneødem og blod-hjernebarriere (BBB) sammenbrudd måles som parametere som gjenspeiler omfanget av hjerneskade etter MCAO. En betydelig begrensning til denne metoden er at disse målingene normalt oppnås i forskjellige rottehjerneprøver, noe som fører til etiske og økonomiske byrder på grunn av det store antallet rotter som må eutaniseres for en passende prøvestørrelse. Her presenterer vi en metode for å nøyaktig vurdere hjerneskade etter MCAO ved å måle infarct sone, hjerneødem og BBB permeabilitet i samme sett av rottehjerner. Denne nye teknikken gir en mer effektiv måte å evaluere patofysiologien til hjerneslag.
Introduction
En av de vanligste årsakene til sykelighet og dødelighet over hele verden er hjerneslag. Globalt representerer iskemisk slag 68% av alle slagtilfeller, mens i USA står iskemisk slag for 87% av hjerneslagtilfeller1,2. Det er anslått at den økonomiske byrden av hjerneslag når $ 34 milliarder i USA2 og € 45 milliarder i EU3. Dyremodeller av hjerneslag er nødvendig for å studere sin patofysiologi, utvikle nye metoder for evaluering, og foreslå nye terapeutiske alternativer4.
Iskemisk slag oppstår med okklusjon av en stor cerebral arterie, vanligvis den midterste hjernearterien eller en av dens grener5. Dermed har modeller av iskemisk slag historisk involvert midten cerebral arterie okklusjon (MCAO)6,7,8,9,10,11,12. Etter MCAO, nevrologisk skade vurderes oftest ved å måle infarktsone (IZ) ved hjelp av en 2,3,5-triphenyltetrazoliumklorid (TTC) fargingsmetode13, hjerneødem (BE) ved hjelp av tørking eller beregning av hemisfæriske volumer14,15,16,og blod hjernebarriere (BBB) permeabilitet av en spektrometri teknikk ved hjelp av Evans blå flekker17,18,19.
Den tradisjonelle MCAO-metoden bruker separate sett med hjerner for hver av de tre hjernemålingene. For en stor utvalgsstørrelse resulterer dette i et betydelig antall eutaniserte dyr, med ekstra etiske og økonomiske hensyn. En alternativ metode for å lindre disse kostnadene ville innebære målinger av alle tre parametrene i et enkelt sett med post-MCAO gnagerhjerner.
Tidligere forsøk er gjort for å måle kombinasjoner av parametere i samme hjerneprøve. Samtidige immunofluorescerende fargingsmetoder20 samt andre molekylære og biokjemiske analyser21 har blitt beskrevet etter TTC-farging i samme hjerneprøve. Vi har tidligere beregnet hjernehalvkulevolumer for å vurdere hjerneødem og utført TTC-farging for å beregne infarktsone i samme hjernesett15.
I den nåværende protokollen presenterer vi en modifisert MCAO-teknikk som måler iskemisk hjerneskade ved å bestemme IZ, BE og BBB permeabilitet i samme sett med gnagerhjerner. IZ måles ved TTC-farging, BE bestemmes ved å beregne hemisfært volum, og BBB permeabilitet oppnås ved spektrometrimetoder19. I denne protokollen brukte vi en modifisert MCAO-modell, basert på direkte innsetting og fiksering av monofilamentkateteret i den indre halspulsåren (ICA) og ytterligere blokkering av blodstrømmen til den midterste hjernearterien (MCA)22. Denne modifiserte metoden viser en redusert dødelighet og sykelighet sammenlignet med den tradisjonelle MCAO-metoden16,22.
Denne nye tilnærmingen gir en økonomisk forsvarlig og etisk modell for måling av nevrologisk skade etter MCAO. Denne vurderingen av de viktigste parametrene for iskemisk hjerneskade vil bidra til å undersøke sin patofysiologi grundig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende prosedyrer ble utført i henhold til anbefalingene fra Helsingfors- og Tokyo-erklæringen og retningslinjene for bruk av eksperimentelle dyr i Det europeiske fellesskap. Eksperimentene ble også godkjent av Dyrevernskomiteen ved Ben-Gurion University of the Negev.
1. Klargjør rotter for eksperimentell prosedyre
- Velg voksne hann Sprague-Dawley rotter uten overt patologi, hver veier mellom 300 og 350 g.
- Opprettholde alle rotter ved romtemperatur ved 22 °C, med 12 timer med lyse og mørke sykluser før eksperimentet.
- Sørg for at mat og vann er tilgjengelig ad libitum.
- Utfør alle prosedyrer mellom 18:00 .m. og 14:00.m.
2. Klargjøre rotter for kirurgi
- Bedøve rotter i 30 min med isofluran (4% for induksjon og 2% for vedlikehold) og 24% oksygen (1,5 l / min).
- Test nivået av anestesi hos rotter ved å sikre at de ikke har en pedaluttaksrefleks.
- Sett det 24 gauge kateteret inn i halevenen.
MERK: Haleoppvarming for vasodilatasjon utføres ikke.- Plasser rottene på bordet i liggende stilling. Bruk medisinsk tape for å feste alle fire av rottenes lemmer.
- Plasser sonden for temperaturmåling i rotterektumet før operasjonen.
- Under prosedyren, opprettholde en varmeplate for å støtte en 37 ° C kjerne kroppstemperatur.
- Legg salve i begge rottens øyne for beskyttelse.
- Barber det kirurgiske området og desinfiser med tre anvendelser på 10% povidon-jod etterfulgt av 70% isopropylalkohol.
3. Høyre side midten cerebral arterie okklusjon
MERK: MCAO utføres av en modifisert teknikk, som tidligere beskrevet16,22,23, med bruk av instrumenter beskrevet av McGarry et al.24 og Uluç et al.25.
- Disseker huden og overfladisk fascia på ventral midtlinje i nakken med kirurgisk pinsett og saks med buede blader.
- Identifiser muskeltrekanten, bestående av ICA, ekstern halspulsåren (ECA) og vanlig halspulsåren (CCA).
- Separer forsiktig riktig CCA og ICA fra vagusnerven med mikroforceps for vaskulær kirurgi.
- Utsett riktig CCA og ICA. Blokker blodstrømmen som kommer fra CCA til ICA ved hjelp av enten mikroklipp eller spesielle turniquets for vaskulær kirurgi. Lag et snitt (ca. 1 mm) på ICA ved hjelp av mikroscissorer for vaskulær kirurgi.
- Sett inn et monofilamentkateter (4-0 nylon) direkte gjennom ICA, ca. 18,5-19 mm fra bifurcation-punktet til høyre CCA i sirkelen av Willis til de når en mild motstand, for å utelukke MCA26.
- Ligate rundt ICA over bifurcation av CCA.
- For den sham-opererte kontrollgruppen utfører du en innsetting av nylontråd i stedet for trinn 3,5 og 3,616,22.
- Administrer 5 ml 0,9 % natriumklorid ved intraperitoneal injeksjon.
- Lukk såret ved sutur og ta rotten til et gjenopprettingsområde.
MERK: Noen minutter etter anestesiens slutt vil rotten våkne opp og bevege seg uavhengig rundt buret. - Ved 23 timer etter MCAO, injisere 2% Evans blå i saltvann (4 ml / kg)23,26 inn i halen venen for begge opererte grupper via en kanyle27.
MERK: Dette brukes som en blod-hjerne permeabilitet tracer. La det sirkulere i 60 minutter.
4. Fastsettelse av ufarct sone
- Mål IZ på 24 timer etter MCAO som beskrevet tidligere9,15,18,19,26.
MERK: Rotter som mistet mer enn 20% av vekten eller utviklede anfall eller hemiplegi er utelukket fra forsøket. - Euthanize rotten ved å erstatte den inspirerte gassblandingen med 20% oksygen og 80% karbondioksid til rotten slutter å puste spontant.
- Åpne brystet med et 5-6 cm lateralt snitt gjennom bukveggen under brystkassen ved hjelp av saks og kirurgiske tang.
- Utfør et diafragmatisk snitt langs hele lengden av ribbeburet med saks og kirurgiske tang.
- Fortrenge lungene forsiktig, kutt gjennom brystkassen opp til kragebeinet på høyre og venstre side28.
- Perfuse med 200 ml normal saltvann gjennom hjertets venstre ventrikkel.
- Punkter eller inkriser hjertets høyre atrium med saks.
- Utfør halshugging ved hjelp av en giljotin og samle hjernevev.
- Bruk iris saks, kuttet fra foramen magnum til den distale kanten av bakre skallen overflaten på begge sider.
- Skill olfaktoriske pærer, nervøse forbindelser langs ventral overflate og dorsal overflate av skallen fra hjernen.
- Fjern hjernen fra hodet.
- Produser 6 hjerneskiver ved å lage 2 mm tykke horisontale seksjoner med et .009" rustfritt stål, ubestrøket barberblad med én kant.
- Inkuber i 30 min ved 37 °C i 0,05 % TTC.
- Plasser hjernevevet på mikroskopskliene og utfør optisk skanning av disse 6 hjerneskivene med en oppløsning på 1600 x 1600 dpi (se for eksempel tillegg 1).
- Legg til et blått filter med et bilderedigeringsprogram (f.eks. Adobe Photoshop CS2) ved hjelp av Kanalmikser-funksjonen (Bilde > Justeringer > Kanalmikser) og lagre bildet som et JPEG-filformat.
MERK: Når du har brukt det blå filteret, vises bildet gråtoner. - Åpne det lagrede bildet i ImageJ 1.37v29,30.
MERK: Dette dataprogrammet bruker en terskelfunksjon til å isolere og beregne pikslene som enten er svarte eller hvite (se figur 1). - For hver av de 6 hjerneskiver av bildet, velg og lagre hver halvkule (høyre skadet ipsilateral og venstre uskadet contralateral) som en egen bildefil ved hjelp av "polygon valg" verktøyet fra hovedmenyen.
- Angi cut-off for å bestemme IZ ved hjelp av en automatisk terskelfunksjon fra hovedmenyen i ImageJ-programvaren ved å velge Bilde > Juster > Terskel, og mål antall piksler på hver halvkule av ett enkelt hjernesett.
MERK: Makroer kan brukes for dette trinnet i ImageJ-programvaren (se Tillegg 2 for koden). Cut off er en kritisk parameter for å bestemme hvilke piksler som skal konverteres til hvitt, og hvilke som skal konverteres til svart, avhengig av grått nyanse (se Supplement 3 og Supplement 4 som eksempler). ImageJ sammenligner deretter hvite og svarte piksler for å bestemme IZ. Basert på fargeprotokollen og skannerinnstillingene brukte vi en konstant cut-off verdi på 0,220. - Utfør måling av IZ-korrigering for hevelse i vev ved hjelp av forholdet mellom Ipsilateral og Kontralateral cerebral halvkule (RICH)metode 13,23 (se eksempel i supplement 5).
MERK: Infarktstørrelse vurderes som en prosentandel av den kontralaterale halvkule.
5. Bestemmelse av hjerneødem31
MERK: Bruk ImageJ 1.37v for måling av BE32,33.
- Mål BE 24 timer etter MCAO. For beregning av BE, bruk dataene fra venstre og høyre halvkule volum (i enheter).
- Utfør optisk skanning med en oppløsning på 1600 x 1600 dpi (se for eksempel tillegg 1).
- Velg hjernens halvkuler og sett cut-off for å bestemme BE med ImageJ 1.37v, som beskrevet ovenfor i avsnitt 4.17-4.19.
- Uttrykk BE-området som en prosentandel av standardområdene på den upåvirkede kontralaterale halvkule, beregnet av RICH-metoden ved hjelp av følgende ligning (se eksempel i supplement 5)23,34.
MERK: Omfanget av BE vurderes som en prosentandel av den kontralaterale halvkule.
6. Bestemmelse av BBB-avbrudd
- Mål BBB-avbrudd 24 timer etter MCAO.
- Del høyre og venstre halvkule i seks skiver og legg hver og en inn i et mikrocentrifugerør.
- Homogenisere hver skive av hjernevevet i trikloreddiksyre, basert på beregning av 1 g hjernevev i 4 ml 50% trikloreddiksyre.
- Sentrifuge ved 10.000 x g i 20 min.
- Fortynn supernatant væske 1:3 med 96% etanol.
- Utfør luminescensspektrometri ved å bruke spektrometriprogramvare, installere platen og utføre en prøveavlesning ved hjelp av følgende parametere: Fluorescensintensitetsintensitetsbølgelengde på 620 nm (båndbredde 10 nm) og en utslippsbølgelengde på 680 nm (båndbredde 10 nm)23,35 ; Mod topp; Antall Kjøtt 25; Manuell 100; Risting 1 sek, 1 mm.
MERK: Bruk en eksitasjonsbølgelengde på 620 nm (båndbredde 10 nm) og en utslippsbølgelengde på 680 nm (båndbredde 10 nm). 23,35 år gammel
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Måling av infarktsone
En uavhengig t-test med en uavhengig prøve indikerte at 19 rotter som gjennomgikk permanent MCAO viste en signifikant økning i hjernens infarktvolum sammenlignet med de 16 sham-opererte rotter (MCAO = 7,49% ± 3,57 vs. Sham = 0,31 % ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (se figur 2A)). Dataene uttrykkes som en gjennomsnittlig prosentandel av den kontralaterale halvkule ± SD.
Måling av hjerneødem
En uavhengig t-test indikerte at 19 rotter som gjennomgikk permanent MCAO viste signifikant økning i omfanget av hjerneødem etter 24 timer sammenlignet med de 16 sham-opererte rotter (MCAO = 12,31% ± 8,6 vs. Sham = 0,64 % ± 10,2, t(29,37) = 3,61, p = 0,01, d = 1,23 (se figur 2B)). Dataene uttrykkes som en gjennomsnittlig prosentandel av den kontralaterale halvkule ± SD.
Permeabilitet i blod hjernebarrieren
En uavhengig t-test med en uavhengig prøve indikerte at 19 rotter som gjennomgikk permanent MCAO viste signifikant økning i omfanget av BBB-sammenbrudd etter 24 timer sammenlignet med de 16 sham-opererte rotter (MCAO = 2235 ng / g ± 1101 vs. Sham = 94 ng/g ± 36, t(18,05) = 8,47 p < 0,01, d = 2,7 (se figur 2C)). Dataene måles i ng/g av hjernevev og presenteres som ± SD.
| Gruppe | Tid | Prosedyrer |
| Sham operert (16 rotter) | 0 | Induksjon av MCAO og innsetting av filament for sham operert gruppe |
| MCAO (19 rotter) | ||
| Sham operert (16 rotter) | 23 timer i s | Injeksjon av Evans blå |
| MCAO (19 rotter) | ||
| Sham operert (16 rotter) | 24 timer i døgnet | Hjernesamling for målinger av IZ-, BE- og BBB-forstyrrelser |
| MCAO (19 rotter) |
Tabell 1: Tidslinje for protokoll. Ved 23 timer etter MCAO ble Evans blå oppløsning injisert. En time senere (24 timer etter MCAO), ble hjernesamling utført, og IZ, BE og BBB permeabilitet ble målt i alle grupper.
Figur 1: Representative hjerneskiver av sham-opererte og MCAO rotter.
(A-B) Opprinnelig skannet bilde. -Det er ikke noe å si på. Transformasjon til gråtoner. (E-G) Terskelfunksjon. -Det er ikke noe å gjøremed det. Påføring av et blått filter. -Jeg er ikke her. Terskelfunksjon etter blått filterprogram. -Jeg har ikke noe å gjøre. Ved hjelp av terskelfunksjon for å vurdere hjerneødem. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Histologiske utfall av MCAO rotter sammenlignet med sham-opererte rotter.
(A) Infarct sone. Volumet av infarktsone hos 19 rotter etter at MCAO ble betydelig økt sammenlignet med de 16 sham-opererte rotter 24 timer etter operasjonen (*p < 0,01). (B) Hjerneødem. Volumet av hjerneødem hos 19 rotter etter at MCAO ble signifikant økt sammenlignet med de 16 sham-opererte rotter 24 timer etter operasjonen (*p < 0,01). (C) Blod hjernebarriere permeabilitet. Blodhjernebarrieren permeabilitet hos 19 rotter etter MCAO ble betydelig økt sammenlignet med de 16 sham-opererte rotter 24 timer etter operasjonen (*p < 0,01). Verdiene ble uttrykt som en gjennomsnittlig prosentandel av den kontralaterale halvkule ± SD og gjennomsnittlig Evans blå ekstravasasjonsindeks i ng / g av hjernevev ± SD i henhold til uavhengige prøver t-test. Resultatene ble ansett som statistisk signifikante når p< 0,05, og svært signifikante når p < 0,01. Denne figuren er endret fra Kuts et al.23 Vennligstklikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplement 1: Eksempel skanning av hjerneskiver. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Tillegg 2: Makroer som kan brukes i ImageJ-programvare for automatisk terskelfunksjon og målepiksler. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tillegg 3: Eksempel på automatisk terskel. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Supplement 4: Eksempel på målte piksler på hver halvkule. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Tillegg 5: Eksempelanalyse. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hovedmålet med den nåværende protokollen var å demonstrere konsistente målinger av tre hovedparametere for iskemisk skade: IZ, BE og BBB permeabilitet. Tidligere studier på dette feltet har vist muligheten for å utføre en eller to av disse parametrene sammen i samme utvalg. Foruten kostnadsreduksjonen som denne tredelte metoden tilbyr, gir den også en mer ønskelig bioetisk modell som begrenser antall dyr som må opereres på og deretter eutaniseres. Som i alle histologiske teknikker er metoden begrenset av manglende evne til å observere iskemiske skader dynamisk.
Fire dataprogrammer ble brukt i bildeanalysen: ImageJ 1.37v, Adobe Photoshop CS2, Microsoft Excel 365 og IBM SPSS Statistics 22. ImageJ ble brukt til å måle utvidelsen av infarktsone og hjerneødem. Adobe Photoshop ble brukt til å begrense effekten av Evans blå på hjernevev, siden en blå farge indikerer BBB-sammenbrudd. Før beregning av infarktsonen er det nødvendig å fjerne den blå fargen fra bildet, siden fargen ikke tillater nøyaktige målinger av infarktsonen (se figur 1B, 1D, 1F). Excel og SPSS ble brukt til databehandling.
Teknikken for å vurdere en infarktsone med ImageJ-dataprogramvare er basert på en sammenligning av svarte og hvite piksler på en sunn halvkule til piksler på en infarcted halvkule. På den infarkte halvkule er den infarktsonen ikke farget med TTC; Derfor indikeres det av et hvitt område i figur 1B som måles. For at programmet skal kunne beregne infarktsonen riktig, er det nødvendig å konvertere pikslene til nyanser av varierende intensiteter av grå farger (se figur 1F, 1J). Den blå fargen, som er forårsaket av Evans blå (se figur 1B),kan påvirke vurderingen av infarktsonen (se figur 1F). Det første trinnet er derfor å fjerne den blå fargen ved hjelp av et blått filter og deretter konvertere bildet til et svart-hvitt bilde (se figur 1J). Vi brukte Adobe Photoshop, men andre dataprogrammer kan også brukes til dette formålet, for eksempel RawTherapeePortable.
Vi etablerte deretter ensartede parametere for beregning av infarktsonen i alle 6 skiver av ett hjernesett ved hjelp av ImageJ for å standardisere måleprosedyren. Dette er nødvendig fordi alle 6 skiver fra hvert sett ble farget og skannet under samme forhold og krever en enhetlig cut-off parameter. Den avskårne er en kritisk parameter for å bestemme hvilke piksler som skal konverteres til hvitt, og hvilke som skal konverteres til svart, avhengig av grått nyanse (se figur 1D, 1H). Vi brukte Terskel-funksjonen fra hovedmenyen til dette formålet. Det siste trinnet i bildeanalysen var beregningen av infarktsonen og hjerneødem.
Den infarktsonemålingen kan utføres av ulike teknikker, inkludert histologisk farging eller radiologiske teknikker som en beregnet tomograf36,positronutslippstomografi og magnetisk resonansavbildning23,36. Tidligere studier i laboratoriet har vist vurderingen av infarktvolum ved hjelp av farging med TTC15,26. Denne metoden er basert på en kjemisk reaksjon mellom TTC og mitokondriedehydrogenaser av nevroner. Det sunne vevet, rikt på dehydrogenaser, er farget med rødt med denne fargingen. Men i nekrotiske celler oppstår ikke denne fargeendringen på grunn av skade i systemet som deltar i oksidasjon av organiskeforbindelser 37. I våre tidligere studier viste vi en høy sammenheng mellom denne histologiske teknikken og resultater fra hjernebildeskanning av dette området23.
Målinger av cerebralt ødem kan vurderes både in vivo og in vitro. Cerebralt ødem skyldes patologiske forandringer i aktivitetene til natrium- og kalsiumionkanaler og transportører som fører til en økning i intracellulærtvann 38,39,40,41. Alternativt kan hevelse oppstå ved BBB-skade som øker ekstracellulært vann. 42 I tidligere studier ble cerebralt ødem bestemt basert på våte og tørre teknikker etterfulgt av beregning av vevsvanninnhold43. En fordel med metoden vi presenterer i denne protokollen er dens enkelhet og nøyaktighet sammenligne med andre eksisterende teknikker23,44,45.
Den mest nyttige metoden for BBB sammenbrudd deteksjon er luminescence spektroskopi etter Evans blå injeksjon. Målingen av BBB permeabilitet er basert på injeksjon av Evans blå, som binder seg til albumin. I sin tur er den molekylære massen av albumin 66 kDa og mye viktigere enn den molekylære vekten av Evans blå 961 Da. Dermed bestemmes målingen av BBB-permeabiliteten nøyaktig av den molekylære massen av albumi som trenger gjennom den skadede BBB, og dermed overfører Evans blå. I tillegg til teknikkene beskrevet ovenfor, er det andre teknikker, spesielt de som er basert på en kombinasjon av ulike dextrans og radioaktive molekyler, som sammen gir mer nøyaktige resultater. Måling av BBB sammenbrudd ved luminescence spektrometri er billigere og enklere å bruke, sammenlignet med mer nøyaktige, men dyrere teknikker. Vi brukte denne metoden for evalueringer av BBB-forstyrrelser sammen med målinger av infarktsone og hjerneødem. Injeksjon av Evans blå for vurdering av BBB permeabilitet før induksjon av MCAO påvirker ikke nøyaktigheten av å måle disse toparametrene 23.
Den nåværende protokollen presenterer en ny teknikk for å måle de tre viktigste determinantene for iskemisk hjerneskade på samme hjerneprøve. Denne metoden kan også brukes på modeller av andre hjerneskader. Denne protokollen vil bidra til studiet av patofysiologien til iskemisk skade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko og Evgenia Goncharyk ved Institutt for fysiologi, Fakultet for biologi, økologi og medisin, Oles Honchar, Dnipro University, Dnipro, Ukraina for deres støtte og nyttige bidrag til våre diskusjoner. Dataene som er innhentet er en del av Ruslan Kuts ph.d.-avhandling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL Syringe | Braun | 4606027V | |
| 2% chlorhexidine in 70% alcohol solution | Sigma-Aldrich | 500 cc | Provides general antisepsis of the skin in the operatory field |
| 27 G Needle with Syringe | Braun | 305620 | |
| 3-0 Silk sutures | Henry Schein | 1007842 | |
| 4-0 Nylon suture | 4-00 | ||
| Brain & Tissue Matrices | Sigma-Aldrich | 15013 | |
| Cannula Venflon 22 G | KD-FIX | 183603985447 | |
| Centrifuge Sigma 2-16P | Sigma-Aldrich | Sigma 2-16P | |
| Compact Analytical Balances | Sigma-Aldrich | HR-AZ/HR-A | |
| Digital weighing scale | Sigma-Aldrich | Rs 4,000 | |
| Dissecting scissors | Sigma-Aldrich | Z265969 | |
| Eppendorf pipette | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
| Eppendorf tube | Sigma-Aldrich | EP0030119460 | |
| Fluorescence detector | Tecan, Männedorf Switzerland | Model: Infinite 200 PRO multimode reader | Optional. |
| Fluorescence detector | Molecular Devices LLC | VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument | Optional. |
| Gauze sponges | Fisher | 22-362-178 | |
| Heater with thermometer | Heatingpad-1 | Model: HEATINGPAD-1/2 | |
| Hemostatic microclips | Sigma-Aldrich | ||
| Horizon-XL | Mennen Medical Ltd | ||
| Infusion cuff | ABN | IC-500 | |
| Micro forceps | Sigma-Aldrich | ||
| Micro scissors | Sigma-Aldrich | ||
| Multiset | Teva Medical | 998702 | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| Operating forceps | Sigma-Aldrich | ||
| Operating scissors | Sigma-Aldrich | ||
| Optical scanner | Canon | Cano Scan 4200F | Resolution 3200 x 6400 dpi |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5606 | |
| Purina Chow | Purina | 5001 | Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment. |
| Rat cages | Techniplast | 2000P | Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment |
| Scalpel blades #11 | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Software | |||
| Adobe Photoshop CS2 for Windows | Adobe | ||
| ImageJ 1.37v | NIH | The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA | |
| SPSS Statistics 22 | IBM | ||
| Office 365 ProPlus | Microsoft | - | Microsoft Office Excel |
| Windows 10 | Microsoft | ||
| Reagents | |||
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
| 50% trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 76-03-9 | |
| Ethanol 96 % | Romical | Flammable liquid | |
| Evans blue 2% | Sigma-Aldrich | 314-13-6 | |
| Isoflurane, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | NDC 66794-017 |
References
- Krishnamurthi, R. V., et al. Global and regional burden of first-ever ischaemic and haemorrhagic stroke during 1990-2010: findings from the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet Global Health. 1, 259-281 (2013).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, 146 (2017).
- Wilkins, E., et al. European cardiovascular disease statistics 2017. , (2017).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
- Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, 480-486 (2009).
- Shigeno, T., McCulloch, J., Graham, D. I., Mendelow, A. D., Teasdale, G. M. Pure cortical ischemia versus striatal ischemia. Circulatory, metabolic, and neuropathologic consequences. Surgical Neurology. 24, 47-51 (1985).
- Albanese, V., Tommasino, C., Spadaro, A., Tomasello, F. A transbasisphenoidal approach for selective occlusion of the middle cerebral artery in rats. Experientia. 36, 1302-1304 (1980).
- Hudgins, W. R., Garcia, J. H. Transorbital approach to the middle cerebral artery of the squirrel monkey: a technique for experimental cerebral infarction applicable to ultrastructural studies. Stroke. 1, 107-111 (1970).
- Waltz, A. G., Sundt, T. M., Owen, C. A. Effect of middle cerebral artery occlusion on cortical blood flow in animals. Neurology. 16, 1185-1190 (1966).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1, 53-60 (1981).
- Aspey, B. S., Cohen, S., Patel, Y., Terruli, M., Harrison, M. J. Middle cerebral artery occlusion in the rat: consistent protocol for a model of stroke. Neuropathology and Applied Neurobiology. 24, 487-497 (1998).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- O'Brien, M. D., Jordan, M. M., Waltz, A. G. Ischemic cerebral edema and the blood-brain barrier. Distributions of pertechnetate, albumin, sodium, and antipyrine in brains of cats after occlusion of the middle cerebral artery. Archives of Neurology. 30, 461-465 (1974).
- Chen, C. H., Toung, T. J., Sapirstein, A., Bhardwaj, A. Effect of duration of osmotherapy on blood-brain barrier disruption and regional cerebral edema after experimental stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 26, 951-958 (2006).
- Boyko, M., et al. Establishment of Novel Technical Methods for Evaluating Brain Edema and Lesion Volume in Stroked Rats: a Standardization of Measurement Procedures. Brain Research. , (2019).
- Boyko, M., et al. An experimental model of focal ischemia using an internal carotid artery approach. Journal of Neuroscience Methods. 193, 246-253 (2010).
- Sifat, A. E., Vaidya, B., Abbruscato, T. J. Blood-Brain Barrier Protection as a Therapeutic Strategy for Acute Ischemic Stroke. AAPS Journal. 19, 957-972 (2017).
- Jiang, X., et al. Blood-brain barrier dysfunction and recovery after ischemic stroke. Progress in Neurobiology. 163-164, 144-171 (2018).
- Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Research. 739, 88-96 (1996).
- Li, L., Yu, Q., Liang, W. Use of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride-stained brain tissues for immunofluorescence analyses after focal cerebral ischemia in rats. Pathology - Research and Practice. 214, 174-179 (2018).
- Kramer, M., et al. TTC staining of damaged brain areas after MCA occlusion in the rat does not constrict quantitative gene and protein analyses. Journal of Neuroscience Methods. 187, 84-89 (2010).
- Kuts, R., et al. A middle cerebral artery occlusion technique for inducing post-stroke depression in rats. Journal of Visualized Experiments. , e58875 (2019).
- Kuts, R., et al. A Novel Method for Assessing Cerebral Edema, Infarcted Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Post-stroke Rodent Brain. Frontiers in Neuroscience. 13, 1105 (2019).
- McGarry, B. L., Jokivarsi, K. T., Knight, M. J., Grohn, O. H. J., Kauppinen, R. A. A Magnetic Resonance Imaging Protocol for Stroke Onset Time Estimation in Permanent Cerebral Ischemia. Journal of Visualized Experiments. , e55277 (2017).
- Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. Journal of Visualized Experiments. , e1978 (2011).
- Boyko, M., et al. The effect of blood glutamate scavengers oxaloacetate and pyruvate on neurological outcome in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Neurotherapeutics. 9, 649-657 (2012).
- Kuts, R., et al. A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats. Journal of Visualized Experiments. , e58875 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. , e3564 (2012).
- Poinsatte, K., et al. Quantification of neurovascular protection following repetitive hypoxic preconditioning and transient middle cerebral artery occlusion in mice. Journal of Visualized Experiments. , e52675 (2015).
- Rasband, W. S. ImageJ, U. S. National Institutes of Health. , Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij (2018).
- Boyko, M., et al. Pyruvate's blood glutamate scavenging activity contributes to the spectrum of its neuroprotective mechanisms in a rat model of stroke. European Journal of Neuroscience. 34, 1432-1441 (2011).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Rasband, W. S. ImageJ, U. S. National Institutes of Health. , Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij (1997).
- Kaplan, B., et al. Temporal thresholds for neocortical infarction in rats subjected to reversible focal cerebral ischemia. Stroke. 22, 1032-1039 (1991).
- Kumai, Y., et al. Postischemic gene transfer of soluble Flt-1 protects against brain ischemia with marked attenuation of blood-brain barrier permeability. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 27, 1152-1160 (2007).
- Schuleri, K. H., et al. Characterization of peri-infarct zone heterogeneity by contrast-enhanced multidetector computed tomography: a comparison with magnetic resonance imaging. Journal of the American College of Cardiology. 53, 1699-1707 (2009).
- Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative Stress: A Key Modulator in Neurodegenerative Diseases. Molecules. 24, (2019).
- Di Napoli, M. Caplan's Stroke: A Clinical Approach. Journal of the American Medical Association. 302, 2600-2601 (2009).
- Deb, P., Sharma, S., Hassan, K. M. Pathophysiologic mechanisms of acute ischemic stroke: An overview with emphasis on therapeutic significance beyond thrombolysis. Pathophysiology. 17, 197-218 (2010).
- Simard, J. M., Kent, T. A., Chen, M., Tarasov, K. V., Gerzanich, V. Brain oedema in focal ischaemia: molecular pathophysiology and theoretical implications. Lancet Neurology. 6, 258-268 (2007).
- Klatzo, I. Pathophysiological aspects of brain edema. Acta Neuropathology. 72, 236-239 (1987).
- Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42, 3323-3328 (2011).
- Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of brain edema on infarct volume in a focal cerebral ischemia model in rats. Stroke. 24, 117-121 (1993).
- Liu, C., et al. Increased blood-brain barrier permeability in contralateral hemisphere predicts worse outcome in acute ischemic stroke after reperfusion therapy. Journal of NeuroInterventional Surgery. 10, 937-941 (2018).
- Boyko, M., et al. Establishment of novel technical methods for evaluating brain edema and lesion volume in stroked rats: A standardization of measurement procedures. Brain Research. 1718, 12-21 (2019).
