Summary
Denne protokollen beskriver en kronisk kranial vindu implantasjon teknikk som kan brukes til langsgående avbildning av nevro-glio-vaskulære strukturer, interaksjoner, og funksjon i både sunne og syke forhold. Det fungerer som et komplementært alternativ til den transkranielle bildetilnærmingen som, mens den ofte foretrakk, har noen kritiske begrensninger.
Abstract
Sentralnervesystemet (CNS) reguleres av et komplekst samspill mellom nevronale, glial, stromal og vaskulære celler som letter riktig funksjon. Selv om det å studere disse cellene isolert in vitro eller sammen ex vivo gir nyttig fysiologisk informasjon; fremtredende trekk ved nevralcellefysiologi vil bli savnet i slike sammenhenger. Derfor er det behov for å studere nevrale celler i deres innfødte in vivo miljø. Protokollen som er beskrevet her beskriver repeterende in vivo to-foton av nevrale celler i gnagercortex som et verktøy for å visualisere og studere bestemte celler over lengre perioder fra timer til måneder. Vi beskriver i detalj bruken av den grovt stabile hjernevaskulaturen som et grovt kart eller fluorescerende merket dendritter som et fint kart over utvalgte hjerneområder av interesse. Ved hjelp av disse kartene som en visuell nøkkel, viser vi hvordan nevrale celler kan nøyaktig flyttes for etterfølgende repeterende in vivo-bildebehandling. Ved hjelp av eksempler på in vivo-avbildning av fluorescerende merket microglia, nevroner og NG2+ celler, viser denne protokollen evnen til denne teknikken for å tillate repeterende visualisering av cellulær dynamikk i samme hjerneplassering over lengre tidsperioder, som kan ytterligere bidra til å forstå de strukturelle og funksjonelle svarene til disse cellene i normal fysiologi eller følge patologiske fornærmelser. Der det er nødvendig, kan denne tilnærmingen kobles til funksjonell avbildning av nevrale celler, for eksempel med kalsiumavbildning. Denne tilnærmingen er spesielt en kraftig teknikk for å visualisere den fysiske interaksjonen mellom ulike celletyper av CNS in vivo når genetiske musemodeller eller spesifikke fargestoffer med distinkte fluorescerende koder for å merke cellene av interesse er tilgjengelige.
Introduction
Sentralnervesystemet (CNS) styres av et komplekst samspill mellom ulike bosatte celletyper, inkludert nevroner, glia og fartøyrelaterte celler. Tradisjonelt ble nevrale celler studert i isolert, co-kultivert1,2,3,4,5 (in vitro) eller utskåret hjernevev (ex vivo)6,7,8,9,10 sammenhenger. Det er imidlertid behov for å ytterligere forstå nevralcelleatferd og interaksjoner i det innfødte miljøet til den intakte hjernen in vivo. I denne protokollen beskriver vi en metode for å kartlegge in vivo-områder av interesse og nøyaktig re-bilde disse områdene i fremtidige bildeøkter for å spore de komplekse interaksjonene mellom de ulike CNS-celletypene over lengre perioder.
Utviklingen av in vivo imaging tilnærminger har gitt betydelige gevinster for riktig forståelse av nevrale funksjon11,12,13,14,15. Spesielt gir disse tilnærmingene flere fordeler fremfor tradisjonelle in vitro- og ex vivo-tilnærminger. For det første har in vivo-bildesystemer fysiologisk relevante celle- og vevskomponenter som vaskulaturen med hele repertoaret av cellulære interaksjoner for å gi en fullstendig forståelse av nevrale nettverksfysiologi. For det andre tyder nylige funn på at når de fjernes fra sitt opprinnelige miljø, mister visse nevrale celler (som microglia) viktige egenskaper ved sin identitet og dermed fysiologi16,17 som kan bevares i in vivo-innstillingen. For det tredje gir in vivo-bildesystemer mulighet for stabile langsgående undersøkelser av uker til måneder til å studere CNS cellulære interaksjoner. Til slutt, gitt det økende beviset for bidrag fra det perifere immunsystemet18,,19 og mikrobiomet20,21 i CNS fysiologi, gir in vivo-systemer en plattform for å avhøre slike bidrag og effekter på CNS-celler. Dermed tilnærminger som bruker langsgående in vivo imaging å studere nevro-immun fysiologi og interaksjoner i friske, skadde, og syke tilstander er et flott komplementært tillegg til tradisjonelle tilnærminger.
I denne protokollen beskriver vi en pålitelig tilnærming til bilde forskjellige celletyper i hjernen, inkludert microglia, nevroner og NG2+ celler som eksempler. To tilnærminger for å visualisere nevrale celler in vivo er utviklet: den tynnede skallen tilnærming og den åpne skallen med en kranievindu tilnærming. Selv om tynnet skallen tilnærminger er i bruk og foretrekkes fordi de overvinne noen av ulempene ved den åpne skallen tilnærming som glial celle aktivering, høyere enn fysiologiske ryggraden dynamikk og bruk av anti-inflammatoriske midler22,23,24,25, tynnet skallen tilnærminger viser også noen kritiske ulemper. For det første er tynningsprosedyren en svært delikat prosedyre som mange forskere finner vanskelig å perfeksjonere, spesielt når re-tynning er nødvendig. Dette er tilfelle fordi det ofte er vanskelig for eksperimenterere å fastslå at de har tynnet skallen til en ~ 20 μm dybde. For det andre, for tilstrekkelige sammenligninger mellom mus, må tynning være identisk, og en rekke tynningssuksess mellom bildeøkter eller mus kan komplisere visualisering av nevrale strukturer. For det tredje, når de brukes til langsgående avbildning, kan dyr med tynnede hodeskaller bare brukes til et begrenset antall økter når re-tynning av skallen er ansatt. Forth, siden noen av beinvevet fortsatt gjenstår, kan klarhet i dybden av bildebehandling bli kompromittert fra den tynnede skallen tilnærming slik at for stor visualisering av mer overfladisk, men ikke så mye med dypere regioner. I lys av dette kan ikke dypere hjernestrukturer som hippocampus, med hell avbildet med den tynnede skallentilnærmingen. Disse hensynene øker behovet for alternative og komplementære tilnærminger som kan overvinne disse bekymringene.
Alternativ til den tynnet skallen tilnærming, den åpne skallen vindu implantasjon tilnærming bruker en prosedyre der skallen er erstattet med en optisk klart glass deksler. Dette gir mulighet for et nesten ubegrenset antall bildeøkter. Videre, gitt utskifting av skallen med glassdekslerslip, gir denne metoden et klart visningsvindu av fluorescerende merkede hjerneceller i omfattende perioder fra timer til måneder, og kan derfor brukes til å studere celleaktivitet og interaksjoner som er relevante for fysiologi, aldring og patologi.
Samlet sett beskriver vi trinn som kan følges for å gjøre implantat kroniske kraniale vinduer gjennom en stereotaxic kraniotomi som muliggjør in vivo-avbildning av hjerneområder av interesse. Vi beskriver også hvordan den brutto stabile hjernevaskulaturen eller de fluorescerende merkede dendrittene kan brukes til å generere et grovt eller fint kart, henholdsvis av hjernens interesseområder. Denne tilnærmingen kan deretter brukes til gjentatt bildebehandling over flere økter. Betydningen av denne teknikken ligger derfor i sin evne til å avbilde de langsiktige endringene eller stasis i hjerneelementer, inkludert arrangement, morfologi og interaksjoner av de forskjellige cellulære typene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle tiltak er i samsvar med retningslinjene som er fastsatt og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Virginia.
1. Mus forberedelse for kranial vindu implantasjon
MERK: Ulike transgene muselinjer med blomstrende koder er egnet for bildebehandling.
- Bruk CX3CR1GFP/+ mus26 til å visualisere microglia in vivo. Vanligvis brukes unge til unge voksne 4 til 10 uker gamle mus som veier 17-25 g.
MERK: Selv om denne tilnærmingen til og med er egnet for pre-avvennede mus, kan behovet for å returnere musene til buret med sine mødre for fôring, komplisere utvinning hvis moren ikke tar tilstrekkelig vare på valper etter operasjonen. Derfor anbefales bruk av mus etter avvenning. - Bedøve musen ved hjelp av isofluran (5% strøm i oksygen for induksjon i 1 min) i et bedøvelseskammer. Kontroller at musen ikke viser noen bevegelses- eller rykninger til tå- og/eller haleklemminger. Ta musen ut av kammeret og i friluft grundig barbere håret på hodet mellom ørene fra omtrent øyehøyde til toppen av nakkeområdet ved hjelp av en hårtrimmer.
MERK: Konsentrasjonen av isofluran som brukes, avhenger av størrelsen på induksjonskammeret. Derfor, for mindre kamre, kan 3-4% isofluran brukes til effektivt å indusere anestesi mens større kamre vil kreve opptil 5%. - Flytt musen til den stereotaktiske kirurgistasjonen nesekjegle for anestesi (1,5-2% for vedlikehold for operasjonen), stabilisere hodet ved hjelp av ørestenger, og opprettholde musen på en varmepute for å holde kroppstemperaturen varm.
- Smør begge øynene med øyesalve. Injiser 100 μL av 0,25 % bupivikain (for å gi lokal analgesi til musen som varer 8-12 timer) og 100 μL med 4 mg/ml deksametason (for å redusere betennelsen som kan oppstå som følge av operasjonsprosedyren) subkutøst på snittstedet. La musen sitte i minst 5 minutter før du flytter til neste trinn.
- Rengjør det barberte hodet med tre vekslende vattpinner av betadin og 70% alkohol. Lag et mellomlinjehodebunnssnitt ved hjelp av kirurgisk blad eller saks som strekker seg fra baksiden av skallen regionen mellom ørene til frontområdet mellom øynene. Den gjenværende huden er kuttet for å eksponere skallen.
- Rengjør bindevevet mellom hodebunnen og den underliggende skallen med 3% hydrogenperoksid (H2O2)og lokaliser hjerneområdet som skal avbildes med stereotaktiske koordinater.
MERK: Det er ofte noen blødninger (trinn 1.5) fra snittet på skallen overflaten. Denne blødningen forsvinner vanligvis av seg selv innen 3-5 min. Rengjøring med peroksid hjelper. Tidligere bupivacaine behandling (trinn 1.4) er også notert for å begrense mengden blødning i løpet av denne tiden.
2. Mus kranial vindu implantasjon kirurgi
- Bor en sirkulær åpning ~4 mm inn i skallen ved hjelp av en tannborkrone (0,7 mm spissdiameter) og fjern forsiktig denne delen av skallen ved hjelp av spisse tang. For avbildning av somatosensorisk cortex av 6-8 uker gamle mus, finn midten av kraniotomien på -2,5 bakre og ± 2,0 lateral til bregma. Under boring, fukt regelmessig skallen med steril saltvann og bomullspinner for å kjøle hjernen, rense av bein rusk og myke skallen bein for eventuell fjerning.
MERK: Koordinatene for kraniotomien vil variere avhengig av interesseområdet og musens alder. - Etter at skallen er fjernet, plasser forsiktig et lite dekkglass (størrelse #0 ved 0,1 ± 0,02 mm tykkelse) fuktet med saltvann i kraniotomien. Tørk av overflødig saltvann ved hjelp av en steril tørk.
- Bruk en spiss applikator (for eksempel en pipettespiss eller den spisse enden av en ødelagt bomullspinne i tre), påfør cyanoakrylatlim rundt vinduet og la den feste seg til hjernen og skallen. Påfør primerlimet til resten av skallen og kurere det med et herdelys i 20-40 s. Lag en brønn rundt vinduet med det endelige limet og kur med herdingslys i 20-40 s.
- Lim en liten hodeplate på skallen på den kontralaterale halvkule av kraniotomien først med primerlimet som primer og deretter med det endelige limet. Herd begge med herdelys i 20-40 s hver.
MERK: Suturer er ikke nødvendig hvis skallen er helt dekket med limet under denne prosedyren.
3. Post-kirurgi omsorg
- La musen våkne opp i fravær av anestesi (gjenoppretting gjort på en varmepute forkorter gjenopprettingstiden) og returnerer den til hjemmeburet når den er helt våken. Injiser en subkutan dose buprenorfin SR (0,5 mg/kg) som postoperativ analgesi som er tilstrekkelig i 72 timer.
- For å lette en sunn gjenoppretting fra operasjonen, gi musen en ekstra myk mat, som kan være i form av vanlig fast chow i vann for å myke chow eller mat i form av en gel.
MERK: En engangsforsyning av myk mat umiddelbart etter operasjonen er tilstrekkelig. - Overvåk musen daglig for helse og riktig gjenoppretting for de første 72 timer av operasjonen prosedyren. Etterpå utfører du bildebehandling fra så tidlig som 2 uker fra vindusimplantasjonsoperasjonen.
MERK: Hvis det gjøres bra, gjenoppretter musene godt som viser normal ambulerende atferd, tilstrekkelig burutforskning, god hydrering, stabil vektøkning og omfattende interaksjoner med andre mus i buret og andre elementer i buret. Mus som viser sløvhet, dehydrering og større enn 10% vekttap etter operasjonen er euthanized og fjernet fra studien.
4. To-foton hjernekartlegging for første bildebehandling
- Bedøv musen (Isoflurane, 5 % induksjon og 1,5 % vedlikehold). Stabiliser hodet ved hjelp av skruer for å montere hodeplaten på det to-fotonmikroskopstadiet, som vedlikeholdes på en varmeplate ved 35 °C. Injiser intraperitonealt 100 μL blodkarfargestoff som Rhodamine B (2 mg/ml).
MERK: Bildebehandling kan også gjøres hos våkne mus uten anestesi. Nyere studier tyder imidlertid på at anestesi påvirker mikroglial overvåkingdynamikk 27,28,29 og at hodet fiksering for to foton bildebehandling i våken mus øker stress selv under kronisk avbildning i minst 25 dager (se Juczewski et al., 2020)30. - Rengjør overflaten av kranievinduet forsiktig ved hjelp av en bomullspinne dabbed i 70% etanol. Sett noen dråper vann eller saltvann på kranievinduet og senk objektivet i løsningen siden målet er en nedsenkingslinse.
- Håndtegn et grovt kart for å betegne de store blodkar landemerkene i en lab notatbok mens du ser gjennom okularet ved epiflorescence. Bruk denne tegningen til å identifisere de spesifikke områdene under to fotonbilder. Alternativt kan du ta bilder av blodårene enten gjennom et kamera montert på mikroskopet eller gjennom et håndholdt kamera eller telefon.
MERK: Disse håndtegnede bildene og bildene skal lette å besøke de samme brede områdene under mikroskopet før to fotonbilder. Dette er ikke nøyaktig bildetilordning. - Under to fotonbilder samler du bilder av blomstrende celler og fartøy etter behov. Ta nøye notater med passende koordinater for å sikre at de nøyaktige områdene kan besøkes på nytt for etterfølgende bildebehandling. Samle flere synsfelt i denne første bildeøkten, for eksempel skaffe z-stack bilder hver 1-2 μm gjennom et volum av vev.
MERK: Når du samler inn bilder med to foton, brukes blodkarene til grov kartlegging. Hvis fin kartlegging er nødvendig, brukes YFP-merkede dendritter fra Thy1-YFP31 mus.- Bruk disse anbefalte parametrene for bildebehandling: en bølgelengde på 880-900 nm er optimal; for GFP og/eller dsRed / Rhodamine eksitasjon, brukes et 565 nm dichroic speil med 525/50 nm (grønn kanal) og 620/60 nm (rød kanal) utslippsfiltre; for GFP- og YFP-separasjon brukes et 509 nm dichroic speil med 500/15 og 537/26 nm utslippsfiltre; kraften i hjernen opprettholdes ved 25 mW eller under; bildeoppløsningen er 1024 x 1024 piksler, synsfeltet tatt med en 25X 0,9 NA-mål på en 1,5X zoomfaktor er 295,24 x 295,24 μm.
- På slutten av avbildningen, ta musen av scenen, la den våkne opp fra anestesi og gå tilbake til hjemmeburet til en fremtidig bildeøkt.
5. To-foton bildebehandling og re-imaging
- For fremtidige påfølgende bildebehandlingsøkter, som kan være alt fra noen få timer til måneder etter den første bildebehandlingsøkten, bedøve musen (Isoflurane, 5% induksjon og 1,5% vedlikehold), monteres på to-fotonmikroskop, opprettholde på en varmeplate og re-injisere 100 μl et blodkar fargestoff som Rhodamine B (2 mg / ml).
- Åpne de tidligere oppnådde bildene i ImageJ, og ved hjelp av disse bildene samt notatene fra forrige økt, identifiser de tidligere avbildede områdene og nøye bilde dem.
- Gjenta dette så lenge bildevinduet er klart eller som avgjørende for omfanget av studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å visualisere mikroglial dynamikk in vivo ble dobbelt transgene CX3CR1GFP/+:Thy1YFP-mus brukt. Thy1-YFP H-linjen brukes i motsetning til Thy1-GFP M-linjen for å unngå florescence overlapping av microglia (GFP) og nevroner (YFP). Alternative tilnærminger kan bruke en reporterlinje der microglia er merket med f.eks, tdTomato og deretter Thy1-GFP M-linjen kan brukes. En ulempe med H-linjen er at YFP merker mange nevroner og etiketten øker med økende alder (personlig observasjon). M-linjen viser sparsom merking av nevroner. Mellom 2 – 4 uker av vinduet implantasjon kirurgi, microglial dynamikk kan etterfølges av gjentatt bildebehandling. Store blodkar brukes til å lokalisere bestemte regioner, og deretter brukes YFP-merkede dendritter til fin kartlegging av hjerneregioner. Med denne tilnærmingen kan spesifikke dendritter brukes som stabile landemerker for fin kartlegging av hjerneregioner (Figur 1, piler i figur 1b). Mens dendritter er stabile, beveger noen microglia seg daglig (Figur 1c).
I tillegg er denne tilnærmingen tilstrekkelig for ukentlig langsgående bildebehandling på lang sikt. Dermed ble enkelttransgene CX3CR1GFP/+ mus brukt til å følge microglia kombinert med intraperitoneale injeksjoner av Rhodamine B for å merke vaskulaturen under hver bildeøkt i opptil 8 uker (figur 2). Alternativt, som omtalt ovenfor, kan Thy1-mus brukes til langsgående finkartlegging. Når ukentlig bildebehandling utføres, er vaskulaturen bemerket å være stabilt fast, men microglia kan ses å være dynamisk som vist i tre spesifikke områder av interesse (ROI, stiplede sirkler) i figur 2. I toppavkastningen begynner microglia å gå inn i avkastningen innen den fjerdeuken med bildebehandling og fortsette gjennom den8. I midten roi med en bifurcated fartøy, en mikroglial celle dukker opp rundt den nedre fartøyet i 3rd uke, går tapt på 6th uke og en annen microglia dukker opp på øvre blodkar i 7th uke og opprettholdes inn i 8th uke. Til slutt, i bunnen ROI, en mikroglial celle i vedlikeholdt gjennom 6th uke og tapt i 7th og 8th uker med bildebehandling. Disse resultatene indikerer dynamiske endringer i mikroglial posisjonsnettverket over uker til måneder.
Denne tilnærmingen kan også brukes til å undersøke cellulær dynamikk etter akutt skade eller under patologisk sykdomsprogresjon. Enkelt transgene CX3CR1GFP/+ mus ble brukt til å følge mikroglia kombinert med intraperitoneale injeksjoner av Rhodamine B for å merke vaskulaturen før (data ikke vist) og etter alvorlige anfall indusert av kainsyre (figur 3). Etter anfall opprettholdes vaskulær sengestruktur uten overt perturbations (Figur 3a). Imidlertid er det mikrogliale mobilnettet og posisjonslandskapet forbigående endret (noen celler er "oppnådd" og andre er "tapt" i synsfeltet) med større endringer innen 24-48 h av anfall som gjenopprettes til normalt med 72 h (Figur 3b) som vi tidligere rapporterte32.
Til slutt kan denne tilnærmingen også brukes til å undersøke cellecelleinteraksjoner eller sammenligne dynamikk mellom nevrale celletyper. Dobbel transgene CX3CR1GFP/+:NG2dsRed/+ mus ble brukt til å spore microglia og NG2+ celler in vivo. Uten merking av vaskulaturen kan mikroglia- og NG2-celler identifiseres (figur 4a). NG2 er en proteoglykan som merker både fartøy-assosierte pericytes og oligodendrocyte precursor celler (OPCs)33,34. Pericytes har vanligvis langstrakte prosesser som følger langs vaskulærveggen (presumptivt identifisert med pilspisser i figur 4a) og OPCer viser vanligvis større cellelegemer som ligger i hjerneparenchyma bort fra vaskulaturen (presumptivt identifisert med piler i figur 4a). For å skille mellom pericytes og OPCer tilstrekkelig, er vaskulaturen merket med Rhodamine B. Den lysere florescence av NG2+-fartøy tilknyttede celler (pericytes, pilspisser) kan skilles fra svakere florescence av luminal Rhodamine til tross for lignende eksitasjon av to foton avbildning (Figur 4b, c). Daglig bildebehandling viser at pericytes er stabilt plassert, mens OPCer (stjerner i figur 4b)og microglia (sirkler i figur 4b)er dynamiske i samsvar med tidligere rapporter32,,35,36.
Figur 1: Daglig avbildning av microglia ved hjelp av fin kartlegging med nevronale dendritter i doble transgene CX3CR1GFP/+:Thy1YFP mus. (a)Representativt todelt bilde av microglia (grønn) og dendritter (rød) fra en dobbel transgen CX3CR1GFP/+:Thy1YFP mus. (b-c), Daglige bilder av boxed region i (a) viser gjentatte ganger avbildet dendritter (piler i b) og dendritter med microglia (c). Mens dendrittiske strukturer var posisjonsstabil, ble noen mikroglia bemerket å translokalisere fra sin opprinnelige posisjon i de påfølgende dagene. Slike celler ble identifisert med et tall (1, 2 eller 3). Dagen før ble deres posisjon notert med en hvit stjerne, og på en påfølgende dag ble deres posisjon notert med en gul stjerne. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Langvarig ukentlig avbildning av microglia hos CX3CR1GFP/+ mus i flere måneder. (a-h), Representative to-foton bilder av microglia (grønn) fra en CX3CR1GFP / + mus under gjentatt avbildning ved hjelp av akutt merket vaskulatur (rød, Rhodamine, 2 mg / ml, dvs.) som et grovt landemerke for å spore mikroglial nettverk i opptil 8 uker. Vaskulaturen var strukturelt stabil gjennom bildeperioden. Tre små regioner med vaskulaturen (stiplede sirkler) ble uthevet for å indikere bevegelsen av mikroglial somata i (topp to stiplede sirkler) eller ut av (nederste sirkel) disse regionene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Langvarig daglig avbildning av microglia hos CX3CR1GFP/+ mus etter anfall. (a-b), Representative to-foton bilder under daglig avbildning av samme synsfelt av en bestemt hjerneregion med microglia (grønn) og akutt merking av vaskulaturen (rød, Rhodamine, 2 mg / ml, i.p.). Imaging begynner etter induksjon av alvorlige anfall ved hjelp av et kjemokonvulsivt middel, kainsyre. Den vaskulære strukturen ble opprettholdt som individuelle vaskulære segmenter (piler) kan identifiseres gjennom tiden (a). Mikroglial nettverksdynamikken ble imidlertid økt i løpet av de to første dagene etter anfallene og går tilbake til normale nivåer innen den tredje dagen (b). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Daglig avbildning av microglia og NG2+ celler i CX3CR1GFP/+:NG2dsRed/+ mus. (a) Et representativt to-foton bilde av microglia (grønn) og NG2+ celler (rød) in vivo. Den umerkede vaskulaturen klarer ikke å skille NG2-celler (pericytes, presumptivt identifisert med pilspisser) og NG2-celler som ikke er forbundet med vaskulaturen (oligodendrocyte precursor celler eller OPCs, presumptivt identifisert med piler). (b) Representative to-foton bilder av microglia (grønn) og NG2+ celler (rød) i påfølgende dager av bildebehandling med vaskulatur merket med Rhodamine. Pericytes (pilspisser) er stasjonære mens OPCer er dynamiske (hvite til gule stjerner). Microglia er også dynamiske (sirkler: stiplede sirkler representerer en posisjon uten microglia og fylt sirkel representerer en posisjon med en tilsvarende mikroglia). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruk av in vivo to-foton imaging har åpnet muligheter til å utforske overflod av cellulære interaksjoner og dynamikk som oppstår i den sunne hjernen. Innledende studier fokusert på å bruke den åpne skallen craniotomy tilnærming til bilde nevronale dendritter av både akutt og kronisk imaging37,38. Dette kan også brukes til å belyse nevroimmune interaksjoner i hjernen. Denne protokollen beskriver en metode for pålitelig avbildning av fluorescerende merkede celler (spesielt microglia, den bosatte immuncellen i hjernen) i lengre perioder på kort eller lang sikt. Bruken av fargestoff-merket vaskulær og / eller fluorescerende merket dendritter er detaljert for grov eller fin kartlegging av hjernen regioner av interesse for å tillate gjentatt, pålitelig avbildning av celler. Selv om Thy1YFP-linjen foreslås for bruk for fin hjernekartlegging, kan alternative tilnærminger bruke andre teknikker eller muselinjer for merking av utvalgte nevronale populasjoner som i utero elektroporasjon39,,40,tidlig postnatal AAV injeksjoner41 eller bruk av TRAP mus42. Videre, selv om kortikal bildebehandling var fokus for denne diskusjonen, kan denne tilnærmingen tilpasses for å visualisere dype hjernestrukturer på lang sikt også43.
For denne protokollen kan kirurgiprosedyren på hver mus fullføres i 30-60 min fra initiering av anestesi til utvinning fra anestesi. Under operasjonen fjernes skallen forsiktig og erstattes med et sterilt dekkglass som implanteres for langsiktig avbildning etter minst to uker. Dødelighet er ekstremt sjelden (mindre enn 5 %) hos wildtype mus, selv om mus med koagulasjonsproblemer, som P2Y12R knockout mus, viser høyere dødelighet og kirurgi svikt. Hos slike mus kan blødning vedvare i lengre perioder, og mus kan dø i løpet av de første 48 timer av kraniotomien antagelig på grunn av komplikasjoner fra indre blødninger. Mus med implanterte vinduer fra denne protokollen har ikke blitt lagt merke til å vise tegn på infeksjon, og protokollen kan brukes pålitelig til å generere klare vinduer for langsiktig avbildning hos 50-80% av musene.
Alternativ til den nåværende kroniske vinduimplantasjonstilnærmingen, eksisterer den tynne skallen tilnærming for å visualisere hjerneceller i den intakte hjernen gjentatte ganger. Flere studier har fremhevet verdien og til og med prioritet av valg av tynn skallen tilnærming over vinduet implantasjon tilnærming22,23,24,25. Løftet om denne tilnærmingen bør ikke ignoreres som, når det gjøres riktig, motvirker det flere fremtredende begrensninger eller ulemper ved den nåværende tilnærmingen, inkludert mangel på aktivering av glialceller, lav omsetning av spines som er mer fysiologisk, og mangel på behov for bruk av antiinflammatoriske midler som også kan påvirke hjernens fysiologi. Ved valg av en tilnærming til spesifikke forskningsspørsmål, bør disse alvorlige begrensningene vurderes før du velger tilnærmingen som er beskrevet i denne protokollen.
Men appellen til denne tilnærmingen er firedoblet. For det første er den kraniale vinduimplantasjonsmetningen attraktiv på grunn av den enkle mestring av denne prosedyren i forhold til den tynne skallenprosedyren. Passende skalletynning kan ikke alltid mestres av eksperimenterere, og hvis det ikke gjøres bra, kan det føre til glial aktivering som begrenser appellen. For det andre gir denne kraniale vinduimplantasjonsmetoden kraftig dybde klarhet i hjernestrukturer når hjernen avbildes gjennom et optisk klart vindu. Vinduet som er tilgjengelig for bildebehandling er også vanligvis mye større enn det som brukes i den tynne skallen tilnærming slik at tilgang til et større volum av vev for analyse. For det tredje, som dybdeklarhet, gir denne tilnærmingen en jevn klarhet gjennom vinduet siden glassdekslerslips er jevnt tynn og klar. Dette forenkler sammenligninger mellom økter og mellom dyr. Spesiell kompetanse er nødvendig for tynn skallen teknikk for å sikre jevn klarhet over vinduet under gjentatte økter og mellom dyr. Til slutt gir denne tilnærmingen mye fleksibilitet i hyppigheten av bildebehandling fra timer, til dager til uker til måneder og til og med år. For den tynne skallen tilnærming, maksimalt fem repetisjoner har blitt foreslått24.
Fremtidige anvendelser av denne tilnærmingen er mange. For det første kan applikasjoner innebære å belyse nye nevro-glio-vaskulære interaksjoner i hjernen i både normal fysiologi og patologi. For det andre, selv om bosatte celler diskuteres i denne prosedyren, kan tilnærmingen brukes til å studere dynamikken og interaksjonene mellom infiltrerende immunceller som oppstår, for eksempel under akutt skade, kronisk hjerneinfeksjon og/ eller nevrodegenerative tilstander så lenge mus med de respektive fluorescerende merkede cellene er tilgjengelige. Til slutt har denne tilnærmingen blitt diskutert hovedsakelig i sammenheng med strukturelle studier av hjerneceller. Men med bruk av funksjonell bildebehandling f.eks ved hjelp av kalsium44,,45,,46 eller spenning imaging teknikker47,48, kan denne tilnærmingen brukes til funksjonell avbildning over tid i helse og sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker medlemmer av Eyo-laboratoriet for å diskutere ideene som presenteres i dette manuskriptet. Vi takker Dr. Justin Rustenhoven fra Kipnis Lab ved University of Virginia for gaven til NG2DsRed mus33. Dette arbeidet støttes av finansiering fra National Institute of Neurological Disorders and Stroke of the National Institute of Health til U.B.E (K22 NS104392).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverglass (3mm) | Warner Instruments | 64-0726 | |
| Cyanoacrylate glue (Krazy Glue) | Amazon | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2 | |
| Demi Ultra LED Curing Light System | Dental Health Products, Inc | 910860-1 | |
| Dental Drill | Osada: www.osadausa.edu | EXL-M40 | |
| Drill Bit | Fine Science Tools | #19008-07 | |
| Eye Ointment | Henry Schien | 1338333 | |
| iBond Total Etch (Primer glue) | Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer) | 66040094 | |
| Rhodamine B | Millipore Sigma | 81-88-9 (R6626) | |
| Tetris Evoflow glue (Final glue) | Top Dent (Ivoclar Vivadent) | #595956 | |
| Wahl Brav Mini+ | Amazon | https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1 |
References
- Engle, S. J., Blaha, L., Kleiman, R. J. Best Practices for Translational Disease Modeling Using Human iPSC-Derived Neurons. Neuron. 100 (4), 783-797 (2018).
- Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. In Vitro Microfluidic Models for Neurodegenerative Disorders. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).
- Croushore, C. A., Sweedler, J. V. Microfluidic systems for studying neurotransmitters and neurotransmission. Lab Chip. 13 (9), 1666-1676 (2013).
- Wu, V. W., Schwartz, J. P. Cell culture models for reactive gliosis: new perspectives. J Neuroscience Research. 51 (6), 675-681 (1998).
- Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Pena, F. Organotypic cultures as tool to test long-term effects of chemicals on the nervous system. Current Medicinal Chemistry. 17 (10), 987-1001 (2010).
- Humpel, C. Organotypic Brain Slice Cultures. Current Protocols in Immunology. 123 (1), 59 (2018).
- Heine, C., Franke, H. Organotypic slice co-culture systems to study axon regeneration in the dopaminergic system ex vivo. Methods in Molecular Biology. 1162, 97-111 (2014).
- Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies. Molecualar Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Kerr, J. N., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nature Review Neurosciences. 9 (3), 195-205 (2008).
- Akassoglou, K., et al. In Vivo Imaging of CNS Injury and Disease. Journal of Neuroscience. 37 (45), 10808-10816 (2017).
- Tran, C. H., Gordon, G. R. Astrocyte and microvascular imaging in awake animals using two-photon microscopy. Microcirculation. 22 (3), 219-227 (2015).
- Tvrdik, P., Kalani, M. Y. S. In Vivo Imaging of Microglial Calcium Signaling in Brain Inflammation and Injury. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2366 (2017).
- Bennett, F. C., et al. A Combination of Ontogeny and CNS Environment Establishes Microglial Identity. Neuron. 98 (6), 1170-1183 (2018).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Mueller, K. L., Hines, P. J., Travis, J. Neuroimmunology. Science. 353 (6301), 760-761 (2016).
- Kipnis, J., Filiano, A. J. Neuroimmunology in 2017: The central nervous system: privileged by immune connections. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 83-84 (2018).
- Moloney, R. D., Desbonnet, L., Clarke, G., Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome: stress, health and disease. Mammalian Genome. 25 (1-2), 49-74 (2014).
- Skonieczna-Zydecka, K., Marlicz, W., Misera, A., Koulaouzidis, A., Loniewski, I. Microbiome-The Missing Link in the Gut-Brain Axis: Focus on Its Role in Gastrointestinal and Mental Health. Journal of Clinical Medicine. 7 (12), 521 (2018).
- Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Developmental Neurobiology. 68 (6), 771-778 (2008).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Grutzendler, J., Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Gan, W. B. Transcranial two-photon imaging of the living mouse brain. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular Cell Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Liu, Y. U., et al. Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling. Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).
- Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
- Sun, W., et al. In vivo Two-Photon Imaging of Anesthesia-Specific Alterations in Microglial Surveillance and Photodamage-Directed Motility in Mouse Cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Juczewski, K., Koussa, J., Kesner, A., Lee, J., Lovinger, D. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method. bioRxiv. , (2020).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Eyo, U. B., et al. P2Y12R-Dependent Translocation Mechanisms Gate the Changing Microglial Landscape. Cell Reports. 23 (4), 959-966 (2018).
- Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity. Nature Review Neurosciences. 10 (1), 9-22 (2009).
- Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes. Development. 135 (1), 145-157 (2008).
- Hughes, E. G., Kang, S. H., Fukaya, M., Bergles, D. E. Oligodendrocyte progenitors balance growth with self-repulsion to achieve homeostasis in the adult brain. Nature Neuroscience. 16 (6), 668-676 (2013).
- Berthiaume, A. A., et al. Dynamic Remodeling of Pericytes In Vivo Maintains Capillary Coverage in the Adult Mouse Brain. Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Holtmaat, A. J., et al. Transient and persistent dendritic spines in the neocortex in vivo. Neuron. 45 (2), 279-291 (2005).
- Wang, C., Mei, L. In utero electroporation in mice. Methods in Molecular Biology. 1018, 151-163 (2013).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8 (6), 67680 (2013).
- Guenthner, C. J., Miyamichi, K., Yang, H. H., Heller, H. C., Luo, L. Permanent genetic access to transiently active neurons via TRAP: targeted recombination in active populations. Neuron. 78 (5), 773-784 (2013).
- Pilz, G. A., et al. Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus. Science. 359 (6376), 658-662 (2018).
- Wu, J., et al. Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo. Nature Methods. 17 (3), 287-290 (2020).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nature Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hannan, S., et al. In vivo imaging of deep neural activity from the cortical surface during hippocampal epileptiform events in the rat brain using electrical impedance tomography. Neuroimage. 209, 116525 (2020).
- Kulkarni, R. U., et al. In Vivo Two-Photon Voltage Imaging with Sulfonated Rhodamine Dyes. ACS Central Science. 4 (10), 1371-1378 (2018).
- Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
