Summary
Protokollen beskriver eksperimentelle metoder til at opnå stabile større histokompatibilitetskomplekser (MHC) klasse I gennempotentielleβ 2-mikroglobulin (β2m) substitutioner fra forskellige arter. Den strukturelle sammenligning af MHC I stabiliseret af homologe og heterologe β2m blev undersøgt.
Abstract
Den store histokompatibilitet kompleks (MHC) spiller en central rolle i antigen peptid præsentation og T celle immunrespons mod smitsomme sygdomme og tumor udvikling. Den hybride MHC I, der er sammensat med heterolog β 2-microglobulin (β2m) substitution fra forskellige arter, kan stabiliseres in vitro. Dette er et muligt middel til at undersøge pattedyrs MHC I, når den homologe β2m ikke er tilgængelig. I mellemtiden er det angivet, at pattedyr β2m substitution ikke påvirker peptidpræsentationen væsentligt. Der er dog begrænset opsummering med hensyn til metoden og teknologien til hybrid MHC I, der er kompleks med heterolog β 2-mikroglobulin (β2m). Heri præsenteres metoder til evaluering af gennemførligheden af heterologe β2m substitution i MHC I-undersøgelsen. Disse metoder omfatter udarbejdelse af udtrykskonstruktioner; rensning af inklusionsorganer og omdringning af MHC-komplekset bestemmelse af proteintermosterstabilitet krystalscreening og strukturbestemmelse. Denne undersøgelse giver en anbefaling til forståelse funktion og struktur AF MHC I, og er også signifikant for T celle respons evaluering under smitsomme sygdomme og tumor immunterapi.
Introduction
Det største histokompatibilitetskompleks (MHC) findes i alle hvirveldyr og er et sæt gener, der bestemmer den cellemedierede immunitet over for smitsomme patogener. MHC klasse I præsenterer endogene peptider, såsom virale komponenter produceret ved virusinfektion, til T-cellereceptorer (TCR) på overfladen af CD8+ T-celler for at mægle cellulær immunitet og deltage i immunregulering1. En strukturel undersøgelse af MHC I binding til peptider giver oplysninger om peptid bindende motiver og præsentation funktioner ved MHC I molekyler, som spiller afgørende roller i evalueringen af CD8+ T celle immunrespons og vaccine udvikling.
Siden den første krystallisering og strukturelle bestemmelse af MHC I molekylær af Bjorkman et al.2, krystalstrukturanalysen af MHC I-molekyler har i høj grad fremmet forståelsen af, hvordan peptider binder sig til MHC I-molekyler og hjælper med at forstå samspillet mellem lyskæder med tunge kæder og peptider. En række opfølgende undersøgelser viste, at selv om de gener, der koder lyskæden, ikke er forbundet med MHC, er lyskæden et nøgleprotein til samling af MHC I-molekyler3,4. Det interagerer med de tre domæner af MHC klasse I molekyler på flere overflader. Når lyskæden er fraværende, kan MHC klasse I molekyler ikke udtrykkes korrekt på overfladen af antigen-præsentere celler og kan ikke interagere med TCR til at udøve deres immunologiske funktioner.
MHC I består af en tung kæde (H-kæde) og lyskæde (dvs. β2-microglobulin (β2m)) og samles gennem binding til en passende peptid5. H-kædens ekstracellulære segment består af α1-, α2- og α3-domæner6. α1- og α2-domænerne danner peptidbindingsrillen (PBG). Den β 2 m kædefungerersom en strukturel underenhed af samlingskomplekset i MHC I, der stabiliserer kompleksets kropsbygning og er en molekylær chaperone til MHC I H-kædefoldning7,8,9. En række undersøgelser har vist, at MHC I H kæder fra forskellige pattedyr såsom flagermus (Chiroptera) (Ptal-N *01:01)10, rhesus makak (Primater) (Mam11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, mus (Rodentia) (H-2Kd)14,15, hund (Carnivora) (DLA-88 *50801)16, kvæg (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 og heste (Peris (Eqca-N*00602 og Eqca-N*00601)18 kan kombineres med heterologe β2m (tabel 1). Disse hybridmolekyler bruges ofte i strukturelle og funktionelle undersøgelser. Metoden til den funktionelle og strukturelle undersøgelse af hybrid MHC I med heterolog β2m er imidlertid endnu ikke sammenfattet. I mellemtiden er det strukturelle grundlag for den udskiftede β2m mellem forskellige taxa fortsat uklart.
Heri opsummeres proceduren for MHC I-udtryk, refolding, krystallisering, krystal dataindsamling og strukturbestemmelse. Derudover analyseres potentielle substitutioner af β2m fra forskellige arter ved at sammenligne den strukturelle kropsbygning af MHC I stabiliseret af homologe og heterologe β2m. Disse metoder vil være nyttige for yderligere MHC I strukturelle undersøgelse og CD8+ T celle immunrespons evaluering i kræft og smitsomme sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Udarbejdelse af udtrykskonstruktioner
- Hent sekvenserne af MHC klasse I-gener (herunder forudsagte gener) fra flagermus fra NCBI-databasen.
- Hent højere pattedyr MHC I tunge kædesekvenser fra Immuno Polymorphism Database (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) og UniProt-databasen (www.uniprot.org).
- For at opnå opløselige MHC-komplekser skal sekvenserne mutageniseres for at fjerne de cytosliniske og transmembrane-regioner.
- Klon generne kodning ectodomains af flagermus Ptal-N * 01:01 (GenBank nr. KT98792919) (restkoncentrationer 1-277) og flagermus β2m (GenBank nr. XP_006920478.1) (restkoncentrationer 1-98) i henholdsvis pET-28a vektorer (Novagen, Beijing, Kina).
- Indsæt de optimerede (for Escherichia coli)sekvenser blev indsat mellem NcoI og EcoR1 steder af en modificeret pET-28a vektor.
- Konstruere humane β2m udtryk plasmider som tidligere beskrevet20.
2. Peptidsyntese
- Forudsigelse af peptider
- Som beskrevet tidligere10, at screene for peptider, der kan binde sig til Ptal-N * 01:01, forudsige kandidat peptider ved hjælp af protein organer bat-relaterede vira hendra virus (HeV). For at opnå høj affinitet peptider baseret på den strukturelle model fra online-serveren, NetMHCpan 4,0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)21 og Rosetta FlexPepDock22 forudsagde potentielle binding i den valgte peptid fraktion. Derudover er anden software og andre databaser, herunder BIMAS, Immun Epitope Database (IEDB), NetCTL 1.2, og SYFPEITHI kan også bruges, alle af dem integrere forudsigelse af peptid-MHC klasse I bindende affinitet, transporter forbundet med antigen behandling (TAP) transport effektivitet, proteasomal C-terminal kavalergang og halv tid af dissociation af peptid-HLA klasse I molekyler i deres udlæsninger.
- Hvis du vil forudsige højbindings peptider, skal du bruge både NetMHCpan- og Rosetta FlexPepDock-serveren.
BEMÆRK: Desværre matchede ingen af de producerede forudsigelser de eksperimentelle data. Dette kan indikere, at de nuværende MHC bindende peptid forudsigelser ikke var egnet til ikke-menneskelige og ikke-mus pattedyr såsom flagermus, som kan have en anden form for peptid bindende. Derfor er vi nødt til at kombinere forskellige forudsigelse software og eksperimentelle resultater for omfattende analyse for at opnå høj affinitet peptider.
- Tilberedning og konservering af peptider
- I stedet for at generere brugerdefinerede peptider skal du bruge specialiserede tjenesteudbydere. Køb alle peptider kommercielt efter peptid forudsigelse værktøjer, som har en højere bindende score. Peptidrenhedn blev bestemt til at være >95% af HPLC og massespektrometri.
- Alle købte peptider opbevares som frysetørret pulver ved −80 °C og opløses i dimethylsulfoxid (DMSO) inden brug.
3. Rensning af inklusionsorganer
- Omdannelse af E. coli
- Omdan 10 ng plasmid indeholdende bat MHC I Ptal-N*01:01 H-kæde, eller human β2m eller flagermus β2m til 100 μL BL21(DE3) E. coli. Bad i is i 30 minutter.
- Varmechok ved 42 °C i 90 s, efterfulgt af badning i is i 2 min.
- Der tilsættes 800 μL lysogen bouillon (LB: gærekstrakt, tryptone og NaCl; se materialetabellen) til trin 3.1.2 og rystes ved 200 omdrejninger i minuttet (omdrejninger) på en gyngeplatform ved 37 °C i 20 min.
- Der påføres 100 μL bakteriel suspension på pladen, der indeholder den tilsvarende antibiotikaresistens (ampicillin: 100 ng/mL), som er de samme som tidligere konstruktioner.
- Pode kulturer
- Vælg en enkelt nyligt omdannet bakterieklon til 3 mL LB med antibiotisk medium (ampicillin: 100 ng/mL) og kultur ved 37 °C, mens du ryster ved 200 rpm på en gyngeplatform for at aktivere bakterierne. Kulturer kan podes sent om aftenen, at være klar til induktion næste morgen.
- En nat i forvejen overføres 500 μL af den aktiverede bakteriebestand til 50 mL LB med antibiotisk medium (ampicillin: 100 ng/mL) og inkuberes natten over ved 37 °C, ryster ved 200 omdrejninger i minuttet. For nemheds skyld ved tilberedning af det næste podningsmiddel skal den resterende aktiverede bakteriebestand fryses i 1 mL aliquots (500 μL kultur med 500 μL på 40% glycerol) ved −80 °C, indtil det næste præparat er nødvendigt.
- For at generere store mængder rekombinant protein overføres bakteriepræparatet til 2 L LB med antibiotikummedium (ampicillin: 100 ng/mL) i et forhold på 1:100, inkuber ved 37 °C, mens det ryster ved 200 omdrejninger ved 200 omdrejninger i minuttet. Kultur indtil en absorbans på 0,6 ved 600 nm er opnået. Der tilsættes 1 mM isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) (varierer koncentrationen af IPTG for forskellige MHC'er, for det meste mellem 0,1 mM-1 mM) til kolben til induktion af proteinudtryk.
- Høstbakterier
- Bakterierne overføres til centrifugeflasker og centrifuge ved 5000 x g i 20 minutter ved 4 °C. Alle trin fra nu af skal udføres ved 4 °C.
- Resuspend bakterierne i 60 mL fosfat buffer saltvand (PBS) og befri de udtrykte rekombinant protein ved ultralyd celle disruptor.
BEMÆRK: Generelt er det program, vi indstiller på denne maskine ultralyd 6S, interval 12S, 300 W, 99 gange).
- Rensning af inklusionsorganer
- Centrifuge den sonikerede bakteriel suspension på 12.000 x g i 30 min. Supernatanten kasseres og genbruges pellet i en passende mængde vaskebuffer (0,5% Triton-100, 50 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT). Gentag denne proces igen.
- Centrifuge ved 12.000 x g i 10-20 min. Supernatanten kasseres, og inklusionsorganerne genbruges i resuspensionsbufferen (50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT). Der udtages en prøve på 20 μL (inkluderingsorganer i suspensionsbuffer) til SDS-PAGE for at teste inklusionsorganernes renhed.
- Centrifuge det resterende præparat ved 12.000 x g i 10-20 min. Kassér supernatanten. Pelleten med inkluderingsorganerne vejes, og opløsningsbufferen tilsættes (6 M Gua-HCl, 10% glycerin, 50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA) til en endelig koncentration på 30 mg/mL. Omrør langsomt ved hjælp af en magnetisk omrører ved 4 °C, indtil inklusionsorganerne opløses i opløsningsbufferen.
- Centrifuge 12.000 x g i 10-20 min. Kassér bundfaldet. Medtagelsesorganerne opbevares ved −20 °C eller −80 °C.
BEMÆRK: Før du fortsætter med rensning af inklusionsorganer, skal du bekræfte, at induktionen og ekspressionen af rekombinant protein var vellykket. Køre prøver fra hver kultur (taget før og efter IPTG induktion) på en proteingel; 15% SDS-PAGE (SDS-PAGE koncentreret tyggegummi: H2O, 30% acrylamid, 1 M Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 10% APS og TEMED; SDS-PAGE separation gel: H2O, 30% acrylamid, 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 10% SDS, 10% APS og TEMED; se materialetabellen ) for β2m, 10% SDS-PAGE for H-kæden.
4. Omdringning af MHC-kompleks
BEMÆRK: Effektiviteten af inklusionsorganer, der foldes, vil påvirke udbyttet af det opnåede protein. Folding konkurrerer med polymerisering, så det er almindeligt accepteret, at refolding ved lave proteinkoncentrationer er den mest succesfulde metode. I dette dokument er koncentrationen af inklusionsorganer 30 mg/mL.
- Forbered refoldingsbuffer.
- Varier sammensætningen af refoldingsbufferen afhængigt af proteinet. For eksempel vil pH, ionisk styrke, redox betingelser og tilstedeværelsen af ligands påvirke refolding resultater. Det mest almindelige er at bruge Tris- eller HEPES-baserede buffere ved en neutral pH med NaCl-koncentrationen på 50-500 mM, men dette afhænger også af målproteinet. Følgende er den bufferformel til genmapper, der bruges i denne artikel.
- Forbered foldebufferen med 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 400 mM L-arginin, 2 mM EDTA-2Na.
- Bufferen afkøles til 4 °C i en 250-300 mL kolbe, og der tilsættes derefter 5 mM reduceret glutathion (GSH) og 0,5 mM oxideret glutathion (GSSG). Rør langsomt med en magnetisk omrører ved 4 °C i yderligere 10-20 minutter, før du tilføjer inklusionsorganer og peptider.
- Injektion og fortynding af MHC H-kæden og β2m
BEMÆRK: Den temperatur, hvor der udføres refolding, kan variere, men generelt er 4 °C bedst for at minimere sammenlægningen. Vi bruger fortynding til at folde proteinerne igen.- Ved hjælp af en nål fra en 1 mL sprøjte injiceres henholdsvis 1 mL hβ2m inklusionsorganer eller bβ2m inklusionskroppe i to refoldingsbuffere (1 liter hver). Injiceres i nærheden af den kraftigt roterende omrøringsstang for at opnå hurtig og effektiv fortynding. β2m refolds relativt let og forbliver stabil selv uden H-kæden.
- Efter at β2m er opløst i refoldingopløsning, opløses peptider (5 mg/mL) i DMSO, og der injiceres hurtigt 200 μL i refoldingopløsningen. Rør langsomt i 10-20 minutter, før du tilføjer H-kæden.
- H-kæden indsprøjtes med samme fremgangsmåde som beskrevet ovenfor for β2m. H-kæden er meget ustabil; Derfor er injektionsrækkefølgen ret vigtig. Der tilføres 3 mL H-kædeinddragelsesorganer i to forskellige refoldingsbuffere (hver 1 liter) med henholdsvis hβ2m eller bβ2m. Den fortløbende injektion af små aliquots i stedet for den enkelte anvendelse af hele mængden af protein øger udbyttet af refolded MHC. Lad refolding fortsætte ved 4 °C i 8-10 timer.
- Koncentration af refolded protein
- Brug ultrafiltrering i et trykkammer med 10 kDa MMCO membran til koncentration af refoldingsproteinerne. Denne metode er praktisk og kan kombineres med bufferudveksling. Tilsættes udvekslingsbuffer (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl pH 8.0) til kammeret og koncentreres til et slutvolumen på 30-50 mL.
- Refoldingsopløsningen overføres til et centrifugerør, drejes ved 12.000 x g i 15 minutter ved 4 °C for at fjerne bundfald.
- Overfør forsigtigt supernatanten og koncentrer dig yderligere til et endeligt volumen på ~ 1 mL.
- Centrifuge ved 12.000 xg i 10-20 min. Supernatanten overføres til et sterilt rør, og proteinerne renses ved hjælp af en kolonne med 10/300 GL-størrelsesudelukkelse.
- Indsamle prøverne på toppen og analysere dem ved hjælp af SDS-PAGE (15% polyacrylamid gel).
- Opsamling af MHC-kompleksets top og koncentrer dig til en endelig koncentration på 15 mg/mL.
- Komplekset fortyndes til 7,5 mg/mL og 15 mg/mL til krystallisering.
5. Krystallisering, dataindsamling og -behandling
- Udfør krystallisering af kompleks MHC og peptid ved hjælp af siddende drop vapor diffusionsteknik.
- Screen Ptal-N*01:01/peptidkomplekser med kommercielle krystalsæt (f.eks. Crystal Screen kit I/II, Index Screen kit, PEGIon kit I/II og PEGRx-sættet).
- Den resulterende opløsning forsegles og ekvilibreres mod 100 μL reservoiropløsning ved 4 eller 18 °C.
- Overhold krystalvæksten i kulturen i 3 dage, 1 uge, 2 uger, 1 måned, 3 måneder og 6 måneder. Brug et mikroskop for at se, om hver dråbe i krystalpladen har krystaller.
BEMÆRK: Ptal-N*01:01/HeV1(bβ2m) krystaller blev observeret i 0,2 M NaCl, 0,1 M Bis-Tris (pH 5,5) og 25% (w/v) polyethylen glycol 3.350 i en koncentration på 7,5 mg/mL. Ptal-N*01:01/HeV1(hβ2m) krystaller blev observeret i 0,1 M HEPES, pH 7,0, 2% w/v polyethylen glycol 3,350 i en koncentration på 7,5 mg/mL. - For kryogen beskyttelse overføres krystallerne til en opbevaringsopløsning, der indeholder 20% glycerol, og afkøles derefter hurtigt i en 100 K gasformig nitrogenstrøm.
- Indsamle røntgen diffraktion data fra beamline BL19U af Shanghai synkrotron stråling facilitet (Shanghai, Kina).
6. Bestemmelse og analyser af struktur
- Med strukturelle data med høj opløsning skal du behandle og skalere samlingens styrke ved hjælp af Denzo-programmet og HKL2000-softwarepakken (https://hkl-xray.com/)23.
- Efter at have valgt en bedre indledende model i Protein Data Bank (PDB), bestemme strukturer ved hjælp af molekylær udskiftning med programmet Phaser MR i CCP424 (http://www.ccp4.ac.uk/). Den anvendte model var strukturen koordinater med Protein Data Bank (PDB) kode 5F1I.
- Brug den raffinerede røntgenmodel til den første fælles raffinement. Brug Phenix forfine alene og fælles tilstande for X-ray alene og den fælles neutron og X-ray raffinement, hhv.
- Efter hver runde af raffinement, manuelt kontrollere modellen mod Fo − Fc og 2Fo − Fc positive nukleare tæthed kort i Coot25 (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/). Dette letter korrekt placering af vand og visse D-atomer. Alle figurer af strukturer blev skabt af PyMOL (http://www.pymol.org/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidligere arbejde rapporterede, at HeV-afledte HeV1 (DFANTFLP) peptid blev præsenteret af Ptal-N * 01:0110,19. Heri blev bindingskapaciteten for denne peptid til Ptal-N*01:01 med homolog flagermus β2m (bβ2m) og heterologe menneskelige β2m(hβ2m) (figur1C,1D)evalueret. Krystaller med højere opløsning blev dannet henholdsvis (Figur 1E,1F). En krystal dannes af Ptal-N*01:01/HeV1 komplekset, som blev dannet ved renaturation med bβ2m, og opløsningen er 2,31 Å. En krystal dannes af Ptal-N*01:01/HeV1 komplekset, som blev dannet ved renaturation med hβ2m, og opløsningen er 1,6 Å. Ptal-N*01:01/HeV1-komplekset blev med succes dannet ved renaturation med både bβ2m og hβ2m (Figur 1C, 1D). I denne forbindelse viste vi, at Ptal-N*01:01/HeV1-komplekset ikke blev dannet uden tilstedeværelsen af β2m (Figur 1A) og H-2Kd, der foldes korrekt gennem hβ2m (Figur 1B).
Strukturerne Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m og Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m blev derefter analyseret. I Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m-strukturen, restkoncentrationer R3, H31, Q34, D53, W60, Y63 af bβ2m bundet til H-kæderesterne gennem bunden af PBG og restkoncentrationer Q8, Y10, R12, N24, Y28, N98, N99 bundet til H-kædens α3-domæne. I lighed med Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m komplekset, i Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m struktur, bevarede restkoncentrationer H31, D53, W60, Y63 af hβ2m, som svarer til bβ2m, kom i kontakt med bunden af PBG og bevarede restkoncentrationer Q8, Y10, R12, N24, som svarer til bβ2m bundet til α3 domæne(figur 2A,2B).
I de overordnede strukturer Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m og Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m, den gennemsnitlige kvadratiske standardafvigelse (RMSD) for restkoncentrationer 1-184 af H-kæderne (der udgør α1α2 PBG) var 0,248 under alleC-α atomernes superposition (Figur 3A). Denne konklusion tydede på, at der ikke var nogen forskel mellem disse to komplekser. Conformationerne af de lignende peptider i komplekserne med forskellige β2m blev derefter sammenlignet. Strukturen af peptidjusteringen viste, at hev1 peptiders kropsbygninger i disse to komplekser var ret ens (Figur 3B). Desuden blev strukturerne i gp33 (KAVYNFATM) præsenteret af H-2Db og sammensat med mus β2m (mβ2m) eller hβ2m justeret. RMSD for α1α2 PBG af H-2Db var 0,283, og de overordnede konformationer af peptider i disse to strukturer var også ens (figur 3C, 3D). Disse data viser, at β2m substitution mellem bβ2m og hβ2m og mβ2m og hβ2m ikke påvirker de præsenterede peptiders overensstemmelser.
Sekvensjusteringen viste, at aminosyrerne på β2m fra forskellige arter er stærkt bevarede (figur 4). Efter analyse af β2m fra forskellige arter viste, at de fleste af de aminosyrer på β2m, der dannede brintbindingerne med H-kæden af MHC I, blev bevaret (Figur 4, Tabel 2). I mellemtiden var de forskellige rester også aminosyrer med lignende kemiske egenskaber hos pattedyr. De vigtigste restkoncentrationer, der var involveret i β2m bindende for H-kæden af MHC I, viste imidlertid polymorfier hos kyllinger, fisk og padder (figur 4).
Tabel 1: De forskellige pattedyr kombineres med heterologe β2m. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Samspillet mellem hydrogenbinding mellem heterologe β2m og tung kæde i MHC I af forskellige arter. Klik her for at downloade denne tabel.
Figur 1: Rensning af de opløselige og refolded Ptal-N*01:01/HeV1 komplekse proteiner og fotografier af krystal, der anvendes til diffraktion analyse. M er molekylvægtmarkører i kDa. P1 er aggregaterne. P2 er MHC-komplekset. P3 er det β2m. (A) Ptal-N*01:01/HeV1-komplekset blev ikke dannet uden tilstedeværelse af β2m. (B) H-2Kd kompleks blev dannet ved renaturation med hβ2m.(C)Ptal-N*01:01/HeV1-komplekset blev dannet ved renaturation med bβ2m. Profilen er markeret med de omtrentlige positioner af molekylmassestandarderne på 75,0, 44,0 og 13,7 kDa. (d) Ptal-N*01:01/ HeV1 kompleks blev dannet ved renaturation med hβ2m. (E) Krystallen er dannet af Ptal-N*01:01/HeV1 kompleks, som blev dannet ved renaturation med bβ2m. Den sorte pil repræsenterer den krystal, der bruges til at indsamle data under røntgendiffraktion. (F) Krystallen er dannet af Ptal-N*01:01/HeV1 kompleks, som blev dannet ved renaturation med hβ2m. Den sorte pil repræsenterer den krystal, der bruges til at indsamle data under røntgendiffraktion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Brintbinding mellem β2m og tung kæde i hybride MHC I-komplekser. Hydrogenbinding mellem β2m og H-kæden i (A) Ptal-N*01:01/bβ2m/HeV1 og (B) Ptal-N*01:01/hβ2m/HeV1 MHC-komplekser. Hydrogenbindingsinteraktioner repræsenteres af en sort prikket linje. Feltet repræsenterer det område, der er zoomet ind og vist til højre i de tilsvarende farvede bokse. Den røde repræsenterer, at den homologe β2m, og den heterologe β2m bruger de samme aminosyrer til at danne hydrogenbindinger med H-kæden. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Lignende kropsbygning af MHC-komplekset og de antigene peptider i hybride MHC I-komplekser. (A) Overlejring af α1α2-domæner af Ptal-N*01:01/bβ2m (grøn) og Ptal-N*01:01/hβ2m (grå). (B) Superpositionen af HeV1 peptid med overlejring af α1α2 domæne af hvert Ptal-N*01:01 molekyle. HeV1 Peptide er repræsenteret som pink i Ptal-N*01:01/bβ2m og som gul i Ptal-N*01:01/hβ2m. (C) Overlejring af H-2D b/mouse-domæner β på2m (mβ2m) (grøn) og H-2Db /hβ2m (grå). (D) Overlejring af gp33 peptid med overlejring af α1α2 domæne af hvert H-2Db molekyle. Peptid gp33 er repræsenteret som blå i H-2Db /mβ2m og som pink i H-2Db /hβ2m. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Strukturbaseret sekvensjustering af hβ2m med β2m andre arter. De sorte pile angiver β-tråde. De rester, der fremhæves med rødt, bevares fuldstændigt, og resterne i blå bokse er meget (>80%) Bevaret. De gule trekanter repræsenterer de vigtigste aminosyrer for samspillet mellem β2m og H kæder. Sekvensjusteringen blev genereret ved hjælp af Clustal X32 og ESPript33. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Opførelsen af et hybridproteinkompleks gennem heterolog substitution fra forskellige taxaer er en fælles strategi for funktionelle og strukturelle undersøgelser, når det homologe kompleks ikke er tilgængeligt, som i MHC I og dets ligands. Der er dog begrænset opsummering af metoden og teknologien. Heri blev strukturen af bat MHC I, Ptal-N*01:01, stabiliseret af bβ2m eller hβ2m analyseret. De vigtigste aminosyrer på β2m bindende til Ptal-N*01:01 viste sig at være bevaret mellem flagermus og menneske. Ved nærmere analyse, de vigtigste rester involveret i β2m bindende til H-kæden af MHC jeg blev anset for at være bevaret i pattedyr, men polymorfe hos kyllinger, fisk og padder. Disse data tyder på, at heterolog β substitution på2m er en mulig måde at undersøge pattedyrs MHC I på. Det er dog muligvis ikke muligt at erstatte pattedyr og fugle, fisk eller padder.
Strukturelle undersøgelser spiller afgørende roller i forståelsen af de molekylære mekanismer peptid præsentation af MHC I molekyler. Heterolog β2m substitution er almindeligt anvendt i MHC I strukturelle undersøgelser14,16,17,18,26,27,28. Tidligere arbejde har vist, at i kvæg MHC I, N * 01801, murine β2m og kvæg β2m opførte sig på samme måde under binding til α1α2 domæner af N * 01801 H kæde17. Heri blev strukturen af en enkelt peptid præsenteret af den samme H-kæde af MHC I, men forskellige β2m analyseret. Disse data viser, at peptidformationerne er ens, når de stabiliseres med cross-taxa β2m, hvilket indikerer, at heterolog β2m substitution ikke påvirker peptidpræsentationen.
Antigenpeptider præsenteret af MHC I genkendes af TCR til at mægle T-celleaktivering29. Under virusinfektion, evaluering af antigen-specifikke T-celle immunrespons vil i høj grad forbedre forståelsen af virusinfektioner og vært immunrespons. Peptid-MHC tetramer er en vigtig teknik til at evaluere T-celleresponser; det er en teknik til at tetramerisere MHC monomer molekyle, forbedre sin affinitet, og kombinere det med flere TCRS på T-celler. Tetramere anvendes i vid udstrækning til forskning og klinisk diagnose14,29,30. For nylig, TCR-manipuleret T-celler (TCR-T) er blevet et varmt emne i tumor immunterapi for deres potentielle effekt i behandlingen af ondartede tumorer31. MHC I tetramer farvning er en afgørende metode til screening af specifik TCR binding til kræftrelaterede antigenpeptider præsenteret af MHC I molekyler29. Derfor spiller MHC I tetramerpræparat en afgørende rolle i TCR-screening. Ud over bindingen af MHC IH-kædenbinder β 2 m sig også til CD8 på T-celleoverfladen, hvilket kan føre til ikke-specifik farvning under TCR-screening af MHC I tetramer farvning. Heterolog β substitution på2m kan mindske denne ikke-specifikke binding af MHC I-tetrameren.
Der er dog nogle begrænsninger i protokollen. For det første kan der, selv om E. coli fortsat er den dominerende ekspression vært for rekombinante proteiner, ikke udføres mange ændringer efter oversættelsen, og de udtrykte proteinprodukter danner uopløselige inklusionsorganer. På grund af den lignende substitution af nogle ikke-pattedyr β2m med pattedyr β2m vides det ikke, om ikke-pattedyr β2m kan erstattes af heterologe β2m for at hjælpe og stabilisere deres MHC-struktur. I protokollen har vi inkluderet en beskrivelse af vores afprøvede analyser ved hjælp af både NetMHCpan og Rosetta FlexPepDock-serveren. Desværre matchede ingen af de producerede forudsigelser de eksperimentelle data. Dette kan indikere, at de nuværende MHC bindende peptid forudsigelser ikke var egnet til ikke-menneskelige og ikke-mus pattedyr såsom flagermus, som kan have en anden form for peptid bindende. Derfor er vi nødt til at kombinere forskellige forudsigelse software og eksperimentelle resultater for omfattende analyse for at opnå høj affinitet peptider.
I den protokol, der er beskrevet her, er det vigtigste trin, at MHC kan frasigers korrekt. Det er meget vigtigt at opnå et MHC-kompleks med høj refolding effektivitet. Derfor er det vigtigt at være opmærksom på at vælge egnede peptider og øge renheden af inklusionsorganer.
Afslutningsvis opsummeres en protokol for MHC I-udtryk, refolding, krystallisering, krystal dataindsamling og strukturbestemmelse. Desuden blev gennemførligheden af heterologe β2m substitution i MHC I-undersøgelsen analyseret. Denne undersøgelse giver en god reference til forståelse MHC I i strukturelle og funktionelle undersøgelser. Derudover er disse data også vigtige for evaluering af T-celleresponser under smitsomme sygdomme og tumor immunterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at erklære.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af den åbne fond af statens nøglelaboratorium for farmaceutisk bioteknologi, Nan-jing University, Kina (Grant no. KF-GN-201905), National Natural Science Foundation of China (tilskud 81971501). William J. Liu er støttet af Excellent Young Scientist Program af NSFC (81822040) og Beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 kDa MMCO membrane | Merck millipore | PLGC07610 | |
| 30% Acrylamide | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
| 5×Protein SDS Loading | Novoprotein | PM099-01A | |
| AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff | Merck millipore | UFC901096 | |
| Ampicillin | Inalco | 1758-9314 | |
| APS | Sigma | A3678-100G | |
| BL21(DE3) strain | TIANGEN | CB105-02 | |
| DMSO | MP | 219605580 | Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| DTT | Solarbio | D1070 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
| Glycerin | HUSHI | 10010618 | |
| GSH | Amresco | 0399-250G | |
| GSSG | Amresco | 0524-100G | |
| Guanidine hydrochloride | Amresco | E424-5KG | |
| hβ2m | our lab | Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
| IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
| L-Arginine Hydrochloride | Amresco | 0877-5KG | |
| NaCl | Solarbio | S8210 | |
| Protein Marker | Fermentas | 26614 | |
| SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
| Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| TEMED | Thermo | 17919 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. |
| Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
| Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
References
- Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. The known unknowns of antigen processing and presentation. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).
- Bjorkman, P. J., et al. Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).
- Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).
- Zijlstra, M., et al. Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells. Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).
- Gao, G. F., et al. Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2. Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).
- Bjorkman, P. J., Parham, P. Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules. Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).
- Achour, A., et al. Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin. Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).
- Kubota, K. Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture. Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).
- Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells. Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).
- Lu, D., et al. Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats. PLoS Biology. 17 (9), 3000436 (2019).
- Wu, Y., et al. Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus. Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).
- Chu, F., et al. First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape. Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).
- Liu, J., et al. Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus. Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).
- Liu, W. J., et al. Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC. Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).
- Mitaksov, V., Fremont, D. H. Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).
- Xiao, J., et al. Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I. Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).
- Li, X., et al. Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides. Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).
- Yao, S., et al. Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles. Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).
- Wynne, J. W., et al. Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule. Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).
- Zhang, S., et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).
- Hoof, I., et al. NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans. Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).
- Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors. PLoS One. 6 (4), 18934 (2011).
- Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
- Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, Pt 5 905-921 (1998).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).
- Glithero, A., et al. Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity. Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).
- Tungatt, K., et al. Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig. PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017 (2018).
- McCoy, W. H. t, Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox. PLoS Biology. 10 (11), 1001432 (2012).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Zhao, M., et al. Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses. mBio. 9 (4), (2018).
- Zhao, L., Cao, Y. J. Engineered T cell therapy for cancer in the clinic. Search Results. 10, 2250 (2019).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
- Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).
