CRISPR/Cas9, model olmayan organizmalarda gen fonksiyonunu karakterize etmek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu protokol, enjeksiyon karışımlarının hazırlanmasından sivrisinek embriyolarının elde ve enjektesine kadar Culex pipiens'innakavt hatlarının nasıl oluşturulacağını ve enjekte edilen sivrisineklerin ve bunların istenen mutasyonlar için soylarının nasıl arka, çapraz ve taramadan geçeceğini açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
CRISPR/Cas9 Kullanarak Boş Mutasyonlar Oluşturmak için Culex Sivrisineklerinin Embriyolarının Hazırlanması ve EnjekteSi
Bu makalede
Özet
Özet
Culex sivrisinekleri, Batı Nil virüsü ve köpek kalp kurdu ve elephantasis gibi filarial nematodların neden olduğu hastalıklar da dahil olmak üzere insan ve hayvan sağlığını olumsuz etkileyen çeşitli hastalıkların başlıca vektörleridir. Son zamanlarda, CRISPR / Cas9 genom düzenleme, bir rehber RNA (gRNA) ile karmaşık hale gelen bir Cas9 proteinini, Anopheles ve Aedes cinslerine ait sivrisinekler de dahil olmak üzere çeşitli böcek türlerinin taze döşenmiş embriyolarına enjekte ederek bölgeye yönelik mutasyonları teşvik etmek için kullanılmıştır. Culex sivrisineklerini manipüle etmek ve enjekte etmek biraz daha zordur, çünkü bu sivrisinekler yumurtalarını diğer sivrisinek türleri gibi ayrı ayrı değil, sallara dik bir şekilde bırakırlar. Burada gRNA'ların nasıl tasarlanacağı, Cas9 proteini ile nasıl karmaşıklaşacağı, Culex pipiens'in dişi sivrisineklerinin yumurta bırakmaya nasıl teşvik edeceği ve cas9/gRNA ile mikroenjeksiyon için yeni döşenen embriyoların nasıl hazırlanacağı ve enjekte edeceği anlatılacağı açıklanmaktadır. Ayrıca, istenen mutasyon için enjekte edilen sivrisineklerin nasıl arka ve taramadan geçirildiği de açıklanmaktadır. Temsili sonuçlar, bu tekniğin Culex sivrisineklerinin genomunda bölgeye yönelik mutasyonları teşvik etmek için kullanılabileceğini ve hafif değişikliklerle diğer sivrisinek türlerinde de boş mutantlar oluşturmak için kullanılabileceğini göstermektedir.
Giriş
Culex sivrisinekleri dünyanın ılıman ve tropikal bölgelerine dağılmıştır ve Batı Nil virüsü1, St. Louis ensefaliti2 ve köpek kalp kurdu3 ve elephantiasis4'eneden olan filarial nematodlar da dahil olmak üzere birkaç ölümcül virüs iletir. Cx. quinquefasciatus , Cx. pipiens pipiensve Cx. pipiens molestus içeren Culex pipienskompleksinin üyeleri, biyolojilerinin birçok alanında çarpıcı varyasyonlar göstermektedir. Örneğin, Cx. quinquefasciatus ve Cx. pipiens molestus kışlayan bir dormancy 5,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Çoğu araştırma kurumunda, genetiği değiştirilmiş organizmaların laboratuvar tesisinden kaçmamasını veya çıkarılmamasını sağlamak için transgenik böcekler üretilmeden veya korunmadan önce onaylanmış bir Biyogüvenlik Protokolü uygulanmalıdır. Ek hükümet düzenlemeleri de geçerli olabilir. Bu nitelikte bir projeye başlamadan önce, hangi belge ve onayların gerekli olduğunu belirlemek için tüm kurumsal politika ve prosedürleri kontrol edin.
1. GRNA'ların tasarlanması ve enjeksiyon karışımlarının hazırlanması
- Bazı gRNA'lar diğerlerinden daha iyi çalıştığından, her hedef gen için 2-5 gRNA tasarlayin. ilgi çekici bir geni ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Açıklanan protokolü kullanarak, Cx. pipiensembriyolarını başarıyla enjekte edebildik ve enjekte edilen embriyolar arasında yüksek bir hayatta kalma oranı gözlemledik (~% 55, Şekil 1). Daha önceki denemeler daha düşük bir hayatta kalma yüzdesine sahipti, muhtemelen yumurta folikülünün ön kısmı tıbbi pansuman şeridine tutturuldu, sivrisinek larvalarının korondan kaçmasını ve suya başarılı bir şekilde yüzmesini önledi. Ön ucun tıbbi pansuman şeridinin ötesine uzanmasını sağlamak larva .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, Culex sivrisineklerinin genomuna belirli mutasyonları sokmak için yöntemler sunar ve diğer sivrisineklerin genomlarını düzenlemek için de kullanılabilir. Protokol, sadece enjeksiyon malzemelerinin nasıl hazırlanacağına dair özel ayrıntılar değil, aynı zamanda sivrisineklerin yumurta bırakmaya nasıl teşviklanacağı ve bu yumurtaların nasıl hazırlanacağı ve enjektelanacağı hakkında ayrıntılı bir video özeti sağlaması açısından önemlidir. Ayrıca, dişi Cx. pipiens'in biyolojisinden yararlanarak .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
RH, böcek genetik modifikasyonunda hizmet veren Böcek Dönüşüm Tesisi için çalışmaktadır.
Teşekkürler
Dr. David O'Brochta'ya ve Böcek Genetik Teknolojileri Koordinasyon Araştırma Ağı'nın tüm üyelerine genetik teknolojilerin uygulanması konusunda bize ve diğerlerine sağladıkları yardım ve eğitim için teşekkür ederiz. Özellikle Channa Aluvihare'ye Culex embriyolarının enjekte edilmesine ve yumurtadan çıkmasına izin vermek için mikro yönetim protokolünü optimize ettiği için teşekkür ediyoruz. Ayrıca, Meuti laboratuvarında çalışan lisans öğrencileri Devante Simmons ve Joseph Urso'ya transgenik sivrisineklerin bakım ve taramalarına yardımcı olmaları için ve ITF'den Zora Elmkami'ye sivrisineklerin enjeksiyon için yetiştirilmelerine ve hazırlanmasına yardımcı olmala....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Yapay Membran Besleyici | Hemotek | SP5W1-3 | Şirket yeri: Blackburn, İngiltere |
| ATP | Invitrogen | 18330019 | Şirket yeri: Carlsbad, CA, ABD |
| Borosilikat cam mirokapiller tüpler, 1 mm dış çap | Dünya Hassas Aletler | 1B100-6 | Şirket Yeri: Sarasota, FL, ABD |
| BV10 İğne Beveler | Sutter Instruments | BV-10-B | Şirket Yeri: Nobato, CA, ABD |
| Whatman Dairesel filtre kağıdı (12,5 cm) | Sigma Aldrich | WHA1001125 | Şirket Yeri: St. Louis, MO, ABD |
| Konik tüp (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | Şirket Yeri: Waltham, MA, ABD |
| Hızlı akış hızına sahip Fisherbrand kurs filtre kağıdı | Thermo Fisher Scientific | 09-800 | Şirket Yeri: Waltham, MA, ABD |
| Kapak camı (24 x 40 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-311-20 | Şirket Yeri: Waltham, MA, ABD |
| Diş barajı | Henry Schein Inc | 1010171 | Şirket Yeri: Melville, NY ABD |
| Scotch çift taraflı bant | Thermo Fisher Scientific | NC0879005 | Şirket Yeri: Waltham, MA, ABD |
| FemtoJet 4i mikroenjektör | Eppendorf | 5252000021 | Şirket Konumu: Hamburg, Almanya |
| Cam şişe (2 dram) | Thermo Fisher Scientific | 033401C | Şirket Yeri: Waltham, MA, ABD |
| Halokarbon yağı | Sigma Aldrich | H8898-50ML | Şirket Yeri: St. Louis, MO, ABD |
| P-2000 Lazer İğne Çektirme | Sutter Instruments | P-2000/G | Şirket Yeri: Nobato, CA, ABD |
| Parafilm | Thermo Fisher Scientific | 50-998-944 | Şirket Yeri: Waltham, MA, ABD |
| PC-100 Ağırlıklı İğne Çektirme | Narishige | PC-100 | Bu, üretimi durdurulan önceki PC-10 modeliyle uyumludur. Şirket Yeri: Amityville, NY, ABD |
| Phire Doğrudan PCR Kiti | Thermo Fisher Scientific | F140WH | Şirket Yeri: Waltham, MA, ABD |
| Kodak Photo-Flo (%1) | Thermo Fisher Scientific | 50-268-05 | Şirket Yeri: Waltham, MA, ABD |
| Kuvars cam mirokapiller tüpler, 1 mm dış çap | Kılcal Boru Malzemeleri Limited | QGCT 1.0 | Şirket Yeri: Cornwall, İngiltere |
| Rehberlik ve ticaret; sgRNA Tarama Kiti | Takara, Bio USA | 632639 | Bu kit, gRNA'ların DNA dizilerini in vitro olarak kesip kesmediğini belirlemenizi sağlar. Şirket Yeri: Mountain View, CA, ABD |
| Sigmacote Sigma | Aldrich | SL2-100ML | Şirket Yeri: St. Louis, MO, ABD |
| Küçük petri kapları (35X10 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-190-0273 | Şirket Yeri: Waltham, MA, ABD |
| Sodyum sitrat tavuk | kanı Lampire biyolojikleri | 7201406 | Şirket Yeri: Everett, PA, ABD |
| Fisherbrand Kare petri kabı (10 cm x 10 cm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875711A | Şirket Yeri: Waltham, MA, ABD |
| Tegaderm | Henry Schein Inc. | 7771180 | Şirket Yeri: Melville, NY ABD |
| Tropikal balık yemi | Tetramin | N/A | |
| Whatman filtre kağıdı | Thermo Fisher Scientific | 09-927-826 | Şirket Yeri: Waltham, MA, ABD |
| Whatman filtre kağıdı, 4.25 cm | Sigma Aldrich | 1001-042 | Şirket Yeri: St. Louis, MO, ABD |
Kaynaklar
- Hamer, G. L., et al. Culex pipiens (Diptera: Culicidae): a bridge vector of West Nile virus to humans. Journal of Medical Entomology. 45 (1), 125-128 (2008).
- Bailey, C. L., et al. Isolation of St. Louis encephaliti....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
