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Artículo de método

Evaluación in vitro de la protección miocárdica después del preaccondicionamiento de hipotermia en un modelo de miocitos cardíacos humanos

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DOI:

10.3791/61837

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27 de octubre de 2020

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1Department of Cardiothoracic Surgery, Children's Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Los distintos efectos de los diferentes grados de hipotermia en la protección miocárdica no han sido evaluados a fondo. El objetivo del presente estudio era cuantificar los niveles de muerte celular tras diferentes tratamientos de hipotermia en un modelo humano basado en cardiomiocitos, sentando las bases para futuras investigaciones moleculares en profundidad.

Resumen

La disfunción miocárdica derivada de la isquemia/reperfusión es un escenario clínico común en pacientes después de una cirugía cardíaca. En particular, la sensibilidad de los cardiomiocitos a lesiones isquémicas es mayor que la de otras poblaciones celulares. En la actualidad, la hipotermia ofrece una protección considerable contra un insulto isquémico esperado. Sin embargo, las investigaciones sobre cambios moleculares complejos inducidos por hipotermia siguen siendo limitadas. Por lo tanto, es esencial identificar una condición de cultivo similar a las condiciones in vivo que pueden inducir daños similares a los observados en la condición clínica de una manera reproducible. Para imitar condiciones similares a la isquemia in vitro, las células de estos modelos fueron tratadas por la privación de oxígeno/glucosa (OGD). Además, aplicamos un protocolo estándar de temperatura de tiempo utilizado durante la cirugía cardíaca. Además, proponemos un enfoque para utilizar un método simple pero completo para el análisis cuantitativo de la lesión miocárdica. La apoptosis y los niveles de expresión de proteínas asociadas a la apoptosis fueron evaluados por la citometría de flujo y utilizando un kit ELISA. En este modelo, probamos una hipótesis sobre los efectos de diferentes condiciones de temperatura en la apoptosis cardiomiocito in vitro. La fiabilidad de este modelo depende de un estricto control de temperatura, procedimientos experimentales controlables y resultados experimentales estables. Además, este modelo se puede utilizar para estudiar el mecanismo molecular de cardioprotección hipotérmica, que puede tener implicaciones importantes para el desarrollo de terapias complementarias para su uso con hipotermia.

Introducción

La disfunción miocárdica derivada de la isquemia/reperfusión es un escenario clínico común en pacientes después de la cirugía cardíaca1,2. Durante la perfusión de bajo flujo nopulsatile y los períodos de detención circulatoria total, todavía se producen daños que involucran todo tipo de células cardíacas. En particular, la sensibilidad de los cardiomiocitos a lesiones isquémicas es mayor que la de otras poblaciones celulares. En la actualidad, la hipotermia terapéutica (TH) ofrece una protección sustancial contra un insulto isquémico esperado en pacientes sometidos a cirugía cardíaca3,4. TH se define como una temperatura corporal central de 14-34 °C, aunque no existe consenso con respecto a una definición de enfriamiento durante la cirugía cardíaca5,6,7. En 2013, un panel internacional de expertos propuso un sistema de presentación de informes estandarizado para clasificar varios rangos de temperatura de la detención circulatoria hipotérmica sistémica8. Basándose en estudios de electroencefalografía y metabolismo del cerebro, dividieron la hipotermia en cuatro niveles: hipotermia profunda (≤ 14 °C), hipotermia profunda (14.1-20 °C), hipotermia moderada (20.1-28 °C) e hipotermia leve (28.1-34 °C). El consenso de expertos proporcionó una clasificación clara y uniforme, permitiendo que los estudios fueran más comparables y proporcionaran resultados más relevantes clínicamente. Esta protección otorgada por TH se basa en su capacidad para reducir la actividad metabólica de las células, limitando aún más su tasa de consumo de fosfatos de alta energía9,10. Sin embargo, el papel de la TH en la protección miocárdica es controvertido y puede tener múltiples efectos dependiendo del grado de hipotermia.

La E/R miocárdica es bien conocida por el aumento de la apoptisis celular11. Informes recientes han observado que la muerte programada de cardiomiocitos aumenta durante la cirugía a corazón abierto, y puede coincidir con necrosis, aumentando así el número de células miocárdicas muertas12. Por lo tanto, reducir la apoptosis cardiomiocito es un enfoque terapéutico útil en la práctica clínica. En el modelo de cardiomiocito HL-1 auricular del ratón, se demostró hipotermia terapéutica para reducir la liberación mitocondrial de citocromo c y factor inductor de apoptosis (AIF) durante la reperfusión13. Sin embargo, el efecto de la temperatura en la regulación de la apoptosis es controvertido y parece depender del grado de hipotermia. Cooper y sus colegas observaron que en comparación con un grupo de control de bypass cardiopulmonar normotérmico, la tasa de apoptosis de tejido miocárdico de cerdos con el arresto circulatorio hipotérmico profundo se incrementó14. Además, los resultados de algunos estudios han sugerido que la hipotermia profunda puede activar la vía de la apoptosis, mientras que la hipotermia menos agresiva parece inhibir la vía12,15,16. La razón de este resultado puede deberse a efectos confusos asociados con lesiones isquémicas y la falta de comprensión de los mecanismos por los cuales la temperatura afecta el tejido miocárdico. Por lo tanto, los límites de temperatura en los que se mejora o atenua la apoptosis deben definirse con precisión.

Para obtener una mejor comprensión de los mecanismos asociados con la eficacia de la hipotermia y proporcionar una base racional para su implementación en seres humanos, es esencial identificar una condición de cultivo similar a las condiciones in vivo que pueden producir daños similares a los observados para la condición clínica de una manera reproducible. Un paso esencial hacia la consecución de este objetivo es establecer las condiciones óptimas para inducir la apoptosis cardiomiocito. En consecuencia, en el presente estudio, exploramos los detalles metodológicos con respecto a los experimentos de privación de oxígeno y glucosa con células cultivadas, un modelo in vitro fácil de isquemia-reperfusión. Además, evaluamos el efecto de diferentes tiempos hipoxico-isquémicos en la apoptosis cardiomiocito, y verificamos nuestra hipótesis sobre el efecto de diferentes condiciones de temperatura en la apoptosis celular in vitro.

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Protocolo

La información relativa a los reactivos e instrumentos comerciales figura en la Tabla de Materiales.

La línea celular cardiomiocito humano AC16 se derivó de la fusión de células primarias del tejido cardíaco ventricular adulto con fibroblastos humanos transformados en SV4017,que fueron comprados a BLUEFBIO (Shanghai, China). La línea celular desarrolla muchas características bioquímicas y morfológicas características de los miomiocitos. Además, la línea celular se utiliza ampliamente para evaluar el daño miocárdico y la función miocárdica in vitro18,19.

1. Cultivo celular

NOTA: El medio de cultivo basal consiste en el medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco sin suero, 10% suero bovino fetal (FBS), 1% suplemento de crecimiento de miocitos cardíacos, y 1% solución de penicilina/estreptomicina. Guarde el medio a 4 °C y prewarm a 37 °C antes de su uso.

  1. Retire las células criopreservadas de cardiomiocitos humanos (HCM) del nitrógeno líquido y descongelarlas en un baño de agua a 37 °C.
  2. Agitar suavemente el vial (<1 minuto) en un baño de agua de 37 °C hasta que sólo quede un pequeño trozo de hielo en el vial.
  3. Transfiera el vial a una campana de flujo laminar estéril. Limpie el exterior del vial con una bola de algodón sumergida en un 70% de alcohol.
  4. Transfiera 4 ml de medio de crecimiento completo prewarmed en sentido dropwise en el tubo centrífuga que contiene las células descongeladas.
  5. Centrífuga la suspensión celular a 200 × g durante 10 minutos. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a gastar el pellet en 5 ml de medio completo.
  6. Mantenga las células a 37 °C en una incubadora humidificada bajo una atmósfera con un 95% de aire y un 5% de CO2.
    NOTA: Antes de cosechar las células para experimentos, se permite que las células crezcan hasta alcanzar aproximadamente un 60-70% de confluencia.

2. Establecimiento de un modelo de privación de oxígeno y glucosa (OGD)

NOTA: Dos horas antes del período de estudio, reemplace el medio de crecimiento por medio libre de suero, y las células fueron recubinadas en una incubadora humidificada durante 2 h a 37 °C bajo una atmósfera con 5% deCO2.

  1. Aspirar el medio desde una placa de 6 pozos y lavar suavemente las células tres veces con solución salina tamponada de fosfato (PBS).
  2. Agregue 2 ml de DMEM fresco sin azúcar por pozo.
  3. Culta las células a una temperatura constante en una incubadora de tres gases bajo una atmósfera con una mezcla de 95% N2,5% CO2,y 0.1% O2 a 37 °C para 1, 2, 4, 8, 12 o 16 h.
  4. Después del tratamiento con hipoxia, aspirar el medio de la placa de 6 pozos y lavar las células con PBS (pH 7.4) tres veces.
  5. Añadir 2 ml de DMEM completo por pozo.
  6. Mantenga las células a 37 °C en una incubadora humidificada bajo una atmósfera con un 95% de aire y un 5% de CO2.

3. Protocolo de temperatura de tiempo

NOTA: Se utiliza un protocolo estándar de temperatura-tiempo durante la cirugía cardíaca, como se describió anteriormente por otros20,21. Tratar HCMs según el protocolo siguiente (Figura 1): el punto de tiempo 1 (T1) indica el final de la inducción, el punto de tiempo 2 (T2) indica el final del mantenimiento y el punto de tiempo 3 (T3) indica el final del reajuste. Analizar las células de control mantenidas en condiciones normotérmicas continuas (37 °C). Las condiciones de temperatura se crean utilizando una incubadora de tres gases, que permite una regulación precisa de la temperatura.

  1. Dos horas antes de los experimentos, aspirar el medio de cultivo de una placa de 6 pozos y añadir 2 ml de DMEM fresco sin suero por pozo.
  2. Vuelva a incubar las células en una incubadora humidificada durante 2 h a 37 °C bajo una atmósfera con un 5% de CO2.
  3. Después de 2 h, aspirar el medio de la placa de 6 pozos y lavar las células con PBS (pH 7.4) tres veces.
  4. Añadir 2 ml de DMEM fresco sin suero por pozo.
  5. Vuelva a instalar las células de la incubadora de tres gases.
    NOTA: Reemplace el medio para eliminar las células y los desechos no separados.
  6. Cambie inmediatamente la temperatura colocando los platos de cultivo en una incubadora de tres gases.
  7. Después de 1 h de enfriamiento, a aspire rápidamente el medio de la placa de 6 pozos y agregue 2 ml de DMEM fresco sin azúcar por pozo.
  8. Cultiva las células de una incubadora de tres gases bajo una atmósfera que comprende 95% N2,5% CO2y 0.1% O2 a 37 °C durante 12 h para establecer hipoxia.
  9. Ajuste la temperatura como se describe a continuación.
    NOTA: El protocolo comienza con 10 h de un tratamiento a baja temperatura, seguido de una fase de recalentamiento para 2 h hasta 37 °C, y 24 h de normotermia (37 °C). En cada momento, se retiran tres platos de Petri para su análisis.
  10. Después del tratamiento a baja temperatura, aspirar el medio desde la placa de 6 pozos y lavar con PBS (pH 7.4) tres veces.
  11. Añadir 2 ml de DMEM completo por pozo.
  12. Mantenga las células a 37 °C en una incubadora humidificada bajo una atmósfera con un 95% de aire y un 5% de CO2.

4. Ensayo de viabilidad CCK-8

  1. Caliente la solución de ácido trippsina-etilenodiaminetetraacetic (EDTA) del 0,25% y PBS a 37 °C antes de su uso.
  2. Aspirar el medio, enjuagar las células con 1 ml de PBS y luego añadir 0,5 ml de 0,25% de trippsina a lo largo de la pared del pozo. Incubar a 37 °C hasta que casi todos los HHCM estén separados (aproximadamente 1 min).
  3. Agregue 1 ml de medio completo DMEM a los pozos para neutralizar la trypsina.
  4. Transfiera la suspensión celular a un tubo centrífuga de 15 ml y peletó los HHCM por centrifugación a 500 × g durante 3 minutos. Aspirar el sobrenadante sin molestar el perdigón.
  5. Dispense 100 alícuotas de μL de la suspensión celular (5000 células/pozo) en una placa de 96 pozos. Preincubar la placa durante 24 h en una incubadora humidificada (a 37 °C.)
  6. Utilice las células cultivadas en las placas de 96 pozos para generar diferentes grupos de tratamiento.
  7. Incubar la placa durante un período adecuado de tiempo (16 h) en una incubadora.
  8. Añadir 10 μL de solución CCK-8 a cada pozo de la placa.
  9. Incubar el plato durante 1 hora en la incubadora.
  10. Mida la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas.
    PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de no introducir burbujas en los pozos, ya que interfieren con las mediciones de lectura de OD.

5. Cytometría de flujo para análisis de apoptosis

  1. Realice pasos de trypsinización y centrifugación siguiendo los pasos 4.2-4.4.
    NOTA: Las células se cosechan con trippsina sin EDTA. Para evaluar la apoptosis, se recogen células flotantes y adherentes.
  2. Centrífuga las células durante 5 minutos a 1000 × g. Deseche el sobrenadante y vuelva a gastar el pellet en 1 ml de PBS.
  3. Cuente las células usando un hemociclo. Con una pipeta, transfiera 100 μL de suspensión celular tratada con Trypan Blue a un hemociclo. Usando un contador de recuento de manos, cuente las células vivas y sin manchar en un conjunto de 16 cuadrados y luego use PBS para generar una suspensión celular a 1×107 celdas/ml.
  4. Obtener 200 μL de la suspensión celular (5 × 105 -1 × 106 células).
  5. Centrífuga durante 5 minutos a 1000 × g y resuspend el pellet en la solución de unión Anexión V-FITC.
  6. Añadir 5 μL de Annexin V-FITC para teñir las células.
  7. Agregue 10 μL de yoduro de propicio en la suspensión celular.
  8. Mezcle suavemente las células e incubarlas durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
    NOTA: Las células se resuspended 2-3 veces durante la incubación para mejorar la tinción.
  9. Inicie el cytómetro de flujo y asegúrese de que el software funciona correctamente.
  10. Abra dos ventanas de trazado de puntos en el software de citometría de flujo.
  11. Seleccione la luz dispersa hacia delante (FSC) en el eje X y la luz dispersa lateral (SSC) en el eje Y para excluir los desechos celulares y/o grumos en términos de su tamaño y granularidad, respectivamente.
  12. Seleccione el canal de detección PE (590 mm) y el FITC (530 mm), que se utiliza para medir la intensidad de fluorescencia de las células.
  13. Coloque el tubo de muestra en blanco (HHCMs que no se han teñido) en el cytómetro de flujo.
  14. Haga clic en Grabar para recoger partículas de la suspensión en el tubo de muestra en blanco y, a continuación, enciérguelo para su análisis posterior en la primera gráfica de puntos.
  15. Coloque las muestras manchadas en el brazo de soporte del tubo. Haga clic en Registrar para recoger partículas de la suspensión y, a continuación, enciéralo para su análisis posterior en la primera gráfica de puntos.
  16. Recopile los HHCM en otros tubos de muestra y optimice la medición ajustando los voltajes de los canales de fluorescencia.
    NOTA: Durante el experimento se utilizan muestras sin manchar y manchadas como controles de compensación.
  17. Muestre las estadísticas de cada tubo de muestra y calcule la tasa de apoptosis de cada muestra.

6. Evaluación de la despolarización mitocondrial

  1. Realice la trypsinización y la centrifugación siguiendo los pasos 4.2-4.4.
  2. Resuspend las células en 500 μL de medio completo, y luego ajustar la densidad celular ajustada a 1 × 105 - 6 × 106 células
  3. Añadir 0,5 ml de solución de trabajo JC-1 a cada tubo.
  4. Incubar las células en una incubadora celular a 37 °C durante 20 minutos.
    NOTA: Durante el período de incubación, agregue 1 ml de amortiguador de tinción JC-1 de 5× a 4 ml de agua destilada para preparar el amortiguador de tinción JC-1.
  5. Después de la incubación, centrífuga las células a 600 × g durante 3 min a 4 °C.
  6. Deseche el sobrenadante y resuspend el pellet en 1 ml de amortiguador de tinción JC-1.
  7. Repita los pasos de 6,5 a 6,6 tres veces.
  8. Resuspend los HHCM en 1 ml de amortiguador de tinción helada en un tubo centrífuga de 1,5 ml y utilizar las células para su análisis en un plazo de 30 minutos.
  9. Seleccione el canal de detección PE (590 nm) y el FITC (530 nm) para medir la intensidad de fluorescencia del tinte JC-1 en las células.
    NOTA: Configure el cytómetro de flujo siguiendo los pasos 5.10-5.17.

7. Ensayo reactivo de especies de oxígeno

  1. Realice la trypsinización y la centrifugación siguiendo los pasos 4.2-4.4.
  2. Manchar las células en medio de cultivo con 10 μM DCFDA y ajustar la densidad celular a 1 × 106 - 1 × 107 células
  3. Incubar durante 30 minutos a 37 °C.
  4. Pipetear suavemente las células hacia arriba/abajo cada 3-5 min.
  5. Después de la incubación, lave las células tres veces con el medio de cultivo celular libre de suero.
  6. Analice las células de un citómetro de flujo siguiendo los pasos 5.10-5.17.
    NOTA: Dcf está excitado a 488 nm y la intensidad de emisión medida en 530 nm.

8. Medición de Caspase 3/ Caspase 8 Actividad

  1. Realice la trypsinization siguiendo los pasos 4.2-4.4.
  2. Recoger las células por centrifugación a 600 × g a 4 °C durante 5 minutos.
  3. Añadir 100 μL de tampón de lysate por 2 × 106 células.
  4. Alice las células durante 15 minutos sobre hielo.
  5. Después de incubar durante 15 minutos en un baño de hielo, centrífuga la muestra a 1,6 × 104 x g a 4 °C durante 15 minutos.
  6. Transfiera el sobrenadante a un tubo centrífugo helado para su uso.
    NOTA: La concentración de proteínas en la muestra debe ser de al menos 1-3 mg/ml.
  7. Retire Ac-DEVD-pNA (2 mM) y colóquelo en un baño de hielo para su uso.
  8. Añada con precisión 40 μL de solución tampón a la placa etiquetada enzimática, agregue 80 μL de la muestra y, finalmente, añada 10 μL de Ac-DEVD-pNA (2 mM).
  9. Incubar la muestra a 37 °C durante 120 minutos.
  10. Midió el valor A405 en un lector de microplacas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    NOTA: La absorbancia producida por el PNA generado por caspase-3/caspase-8 se calcula restando el valor A405 del control en blanco del de la muestra.

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Resultados

El efecto de la exposición a OGD en la viabilidad de los HHCM fue determinado por el ensayo CCK-8. En comparación con la observada en el grupo de control, la viabilidad celular se redujo significativamente de manera dependiente del tiempo (Figura 2A). Las tasas de apoptosis de los HHCM en diferentes momentos después de la reperfusión mostraron una tendencia específica, donde de 0 a 16 h, las tasas de apoptosis aumentaron gradualmente y alcanzaron la tasa máxima en el punto de tiempo de 16 h<...

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Discusión

Las complejidades de los animales intactos, incluidas las interacciones entre diferentes tipos de células, a menudo impiden estudios detallados de componentes específicos de lesiones de E/S. Por lo tanto, es necesario establecer un modelo celular in vitro que pueda reflejar con precisión los cambios moleculares después de la isquemia in vivo. La investigación sobre modelos OGD se ha divulgado previamente13,22, y muchos métodos sofisticados se han establecido

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado en parte por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81970265, 81900281,81700288), la Fundación china de ciencias postdoctorales (2019M651904); y el Programa Nacional clave de investigación y desarrollo de China (2016YFC1101001, 2017YFC1308105).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Kit de detección de apoptosis celular Annexin V-FITCBio-Technology,ChinaC1062M
Suplemento de crecimiento de miocitos cardíacosSciencell,EE. UU.6252
Kit de ensayo de actividad de caspasa 3Bio-Technology,ChinaC1115
Kit de ensayo de actividad de caspasa 8Bio-Technology,ChinaC1151
DMEM, sin glucosaGibco,EE. UU.
Medio de águila modificado de DulbeccoGibco, EE. UU.11960044
Suero fetal bovinoGibco, EE. UU
Citometría de flujoCytoFLEX, EE. UU. B49007AF
Células miocárdicas humanasBLUEFBIO, ChinaBFN60808678
Kit de ensayo de potencial de membrana mitocondrial con JC-1Bio-Technology,ChinaC2006
Penicilina / Solución de estreptomicinaGibco, EE. UU.10378016
Kit de ensayo de especies de oxígeno reactivoBio-Technology,ChinaS0033S
Incubadora de tres gasesMemmert,AlemaniaICO50
Trypsin-EDTA (0.25%)Gibco, EE. UU25200056
11966025. 16140071 .

Referencias

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Reimpresiones y permisos

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Privación de oxígeno y glucosaAnálisis por citometría de flujoEvaluación de la apoptosisPotencial de membrana mitocondrialEnsayo de especies reactivas del oxígenoPrueba de viabilidad CCK-8Incubadora de tres gasesActivación de caspasas
Evaluación in vitro de la protección miocárdica después del preaccondicionamiento de hipotermia en un modelo de miocitos cardíacos humanos
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