Summary
Burada DNA programlı yapıştırma kullanarak mikropattern hücrelere tek hücreli çözünürlükte bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, cam bir slaytta DNA oligonükleotid desenleri oluşturmak için bir tezgah üstü fotolithografi platformu kullanır ve daha sonra hücre zarlarını ticari olarak mevcut tamamlayıcı oligonükleotidlerle etiketler. Oligoların hibridizasyonu programlanmış hücre yapıştırılması ilesonuçlanır.
Abstract
Hücrelerin göreli konumlandırılması, hücre-hücre etkileşimlerini düzenleyen mikroçevrinin önemli bir özelliğidir. Aynı veya farklı tipteki hücreler arasındaki etkileşimleri incelemek için mikropatterning teknikleri yararlı olmuştur. DNA Programlı Hücre Montajı (DPAC), DNA melezleme kullanarak hücrelerin bir substrata veya diğer hücrelere yapışıklıklarını hedefleyen bir mikropatterning tekniğidir. DPAC'taki en temel işlemler, hücre zarlarını lipid modifiye oligonükleotidlerle süslemek, daha sonra tamamlayıcı DNA dizileri ile desenlenmiş bir substrat üzerinden akması ile başlar. Hücreler sadece tamamlayıcı bir DNA dizisi buldukları alt tabakaya seçici olarak yapışırlar. Yapışmayan hücreler yıkanır ve yapışan hücrelerin bir deseni ortaya çıkar. Ek işlemler arasında hücre-substrat veya hücre hücre yapışıklıklarının daha fazla turu ve DPAC tarafından oluşturulan desenlerin uzun vadeli kültür için gömme bir hidrojel'e aktarılması yer alır. Daha önce, yüzeylerde oligonükleotidleri desenleme ve hücreleri DNA dizileriyle süsleme yöntemleri sırasıyla özel ekipman ve özel DNA sentezi gerektiriyordu. Modüler bir format kullanılarak dağıtılan ucuz bir tezgah üstü fotolithografi kurulumu ve piyasada bulunan kolesterol modifiye oligonükleotidler (CMO'lar) kullanılarak protokolün güncellenmiş bir sürümünü rapor ediyoruz. CMO etiketli hücreler DNA desenli yüzeylere yüksek verimlilikle yapışır. Bu yaklaşım, aynı anda birden fazla hücre tipini yüksek hassasiyetle desenlendirmek ve hücre dışı bir matris içine gömülü mikrotissues dizileri oluşturmak için kullanılabilir. Bu yöntemin avantajları arasında yüksek çözünürlüğü, hücreleri mikropattern'i bozmadan üç boyutlu bir mikroçevreğe gömme yeteneği ve herhangi bir hücre tipini desenleme esnekliği bulunur.
Introduction
Hücrelerin bir dokuda birbirine göre konumlandırılması, mikroçevrici1 , 2,3,4'ünönemli bir özelliğidir. Canlı hücreleri mekansal kontrollü düzenlemelere örüntülemek için kullanılan teknikler, farklılaşma 4 , 5,6,7,8,hücre hareketliliği9, morfogenez10 , 11 , 12, metabolizma13ve hücre-hücre etkileşimleri 7 ,14 'ü incelemek için değerli deneyselaraçlardır. . Her biri kendi avantajları ve dezavantajları olan hücrelerin desenleme için çeşitli yöntemlervardır 3,4. Mikrokontact baskı ve lazer kesim kalıplar gibi hücre dışı matris (ECM) proteinlerinin yapışkan adalarını oluşturan yöntemler basit ve ölçeklenebilirdir. Bununla birlikte, aynı anda birden fazla veya iki hücre tipini desenlamak zordur, çünkü farklı hücre tiplerinin farklı ECM moleküllerine yapışkan özellikleri genelliklebenzerdir 15,16,17. PEG kaplı bölgeleri alevlendirmek ve sonraki protein adsorpsiyonuna izin vermek için UV ışığını kullanan bir teknik olan ışık kaynaklı moleküler adsorpsiyon (LIMAP) ile daha karmaşık mikropatternler oluşturulabilir18,19. Bu işlem, birden fazla hücre tipine sahip yüksek çözünürlüklü mikropatternler oluşturmak için tekrarlanabilir. Bununla birlikte, hücrelerin farklı protein yamalarına çapraz bağlanması meydana gelebilir, bu da zayıf desen özgüllüğüne neden olabilir19. Hücrelerin mikromekanik olarak yeniden yapılandırılabilir kültür cihazlarına tohumlandırılması gibi fiziksel yöntemler, dinamik kontrole sahip yapılandırılmış ortak kültürler oluşturabilir, ancak mikrokontact baskının veya LIMAP14,8'indesen tasarımında esneklik olmadan. Diğer tekniklerden farklı olarak, biyobaskı hidrojeller20,21içindeki hücrelerin üç boyutlu düzenlemelerini oluşturabilir. Bununla birlikte, biyobaskıda yapılar diğer mikropatterning tekniklerinden çok daha düşük çözünürlüğe sahiptir, yüzlerce mikron sırasına göre ortalama özellik boyutu22. İdeal bir hücre desenleme yöntemi yüksek çözünürlüğe, desen birden fazla hücre tipine sahip olur, kolayca erişilebilen ekipman ve reaktifleri kullanır ve üç boyutlu (3D) hücre kültürü için başarılı desenleri bir hidrojel içine gömme yeteneğine sahiptir. Bu makalede, hücre yapışıklıklarını bir substrata hedeflemek için DNA hibridizasyonunun esnekliğini ve hızını kullanan bir hücre mikropatterning tekniği olan CMO-DPAC'ı sunuyoruz. Bu yöntem, daha uygun fiyatlı, modüler ve erişilebilir hale getirmek için önceki protokollerimiz23,24'ten uyarlanmıştır. Mevcut protokolü kullanarak, herhangi bir laboratuvar herhangi bir özel ekipman veya uzmanlık olmadan tamamen işlevsel bir sistem kurabilmelidir.
DNA Programlı Hücre Montajı (DPAC), hücre-hücre aralığı ve doku geometrisi üzerinde hassas kontrol ile hücreleri tek hücre çözünürlüğünde desenleyen güçlü bir doku mühendisliği tekniğidir. DPAC'ta hücre zarları, hücre zarında melezlemek için tasarlanmış iki lipid modifiye oligo kullanılarak DNA oligonükleotidleri (oligos) ile dekore edilmiştir. Oligolar hidrofobik lipitlere eşlendiği için, melezleme yaptıkları hücre zarı25'e hızla bölünürler, yaygın olarak bağlı olmayan moleküllerin net hidrofobikliğini artırırlar ve böylece hücre yüzeyinde yaşam sürelerini artırırlar26. Oligolar hücre yüzeyinde, reçete edilen bileşim, hücre hücresi aralığı ve geometri23,24ile tanımlanmış 2D veya 3D hücre desenleri oluşturmak için diğer hücrelerde tamamlayıcı oligolar veya DNA işlevli cam slaytlar ile melezlenebilecekleri şekilde sunulur. Desenli mikrotissular yüzeyden enzmatik olarak bölünebilir ve uzun süreli 3D kültürü için bir hidrojel içine gömülebilir. Birincil hücreler veya kök hücreler ile birlikte kullanıldığında, ortaya çıkan hücre koleksiyonları morfogenezden geçirilebilir ve organoidler23 , 27,28olarak oluşabilir. DPAC, rakip sinyallere yanıt olarak yetişkin nöral kök hücre kaderinin dinamiklerini araştırmak için uygulanmıştır6,29, meme epitel hücrelerinin kendi kendine organizasyonunu incelemek için 23,28ve mezenkimal yoğuşma yoluyla "doku origami" oluşturmak için27.
DPAC, birden fazla hücre popülasyonunun hassas bir şekilde yerleştirilmesine izin verir ve ekstrüzyon bazlı biyobaskılardan (mikron sırasına göre)22,23'ten önemli ölçüde daha iyi çözünürlüğe sahiptir. Ek olarak, mikrokontact baskı gibi ECM tabanlı desenleme yöntemlerinin aksine, DPAC farklı hücre tiplerinin ECM kaplı bir yüzeye diferansiyel yapışmasını gerektirmez15,23. Bir dokunun bileşiminin davranışını nasıl etkilediği, hücrelerinkararverirken birden fazla hücresel ve mikroçevronemental ipucunu nasıl entegre ettiği ve hücre çiftlerinin birbirleriyle nasıl etkileşime girdiği hakkındaki sorularıyanıtlamakiçin idealdir. Bu yöntemin diğer mikropatterning yöntemlerine göre bir avantajı, tek bir görüntüleme düzleminde 3D hücre kültürü için kullanılabilmesi, doku öz organizasyonu ve organoid morfogenez 23,27,30'unhızlandırılmış çalışmalarını kolaylaştırmasıdır.
Bu avantajlara rağmen, DPAC'ın başarılı bir şekilde uygulanması, özel oligonükleotid reaktiflerin sentezini ve DNA deseni23,24için özel ekipmanlara erişimi gerektirmiştir. Örneğin, orijinal protokolde kullanılan en uygun lipid modifiye oligolar (LMO'lar) özel sentezlenmeli, lignoserik asit veya palmitik asit ile değiştirilmeli ve saflaştırılmalıdır26. Bu işlem, bir DNA sentezleyici ve yüksek performanslı bir sıvı kromatografi aletinin kullanılmasının yanı sıra, hem kurumsal hem de federal düzenlemelere tabi olan kontrollü bir madde olan metilamin gibi ilişkili reaktiflerin satın yapılmasını gerektirir. Alternatif olarak, LMO'lar toplu olarak özel olarak satın alınabilir, ancak bu teknolojiye önemli bir ön yatırım gerektirir.
Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, özel olarak sentezlenen LMO'ların yerine piyasada bulunan kolesterol modifiye oligoları (CMO'lar) kullanan revize edilmiş bir DPAC sürümü geliştirdik. Maliyetleri daha da azaltmak ve platformun esnekliğini artırmak için modüler, üç oligolu bir sisteme dönüştük. Her benzersiz hücre popülasyonu için yeni bir kolesterol modifiye oligo sipariş etmek yerine, Bu protokolün bir kullanıcısı bunun yerine her hücre popülasyonu için aynı kolesterol modifiye oligoları ("Evrensel Bağlantı" ve "Evrensel Bağlantı") kullanabilir ve daha sonra hem Evrensel Çapa hem de yüzeydeki amin fonksiyonelleştirilmiş DNA veya başka bir hücre türünün Adaptör Teliosu ile melezlenen ucuz, değiştirilmemiş bir oligo ("Adapter Strand") kullanabilir.
Orijinal DPAC protokolünün bir başka sınırlaması, DNA desenli slaytları yüksek çözünürlüklü bir sıvı yazıcı (örneğin, Nano eNabler, BioForce Nanosciences)23,24kullanarakyaratmasıydı. Bu cihaz olağanüstü çözünürlük ve düşük reaktif gereksinimlerine sahip olsa da, çoğu kurum için mevcut değildir ve nispeten düşük bir baskı oranına sahiptir (saniyede yaklaşık 1 özellik desenli). Son zamanlarda, DNA özelliklerini yüzeylere desenlamak için iki fotolitografik yöntem geliştirilmiştir. Viola ve meslektaşları,UV ışığınamaruz kaldıktan sonra tek iplikli DNA oligolarını aktif olarak bağlayan bir poliakrilamid ve benzofenon kaplama kullandılar 30 . Bu yöntemi kullanarak, hücre kontrititesi ve kendi kendini örgütleme sonucu büyük ölçekli, programlanmış şekil değişiklikleri geçiren doku iskeleleri oluşturabildiler. Scheideler ve arkadaşları, amin modifiye DNA oligolarını aldehit fonksiyonelleştirilmiş bir slayta seçici olarak maruz bırakmak için pozitif bir fotoresistin UV maruziyetini kullanan bir yöntem geliştirdi29. Pişirme ve indirgeyici aminasyondan sonra, amin modifiye DNA kovalent olarak yüzeye bağlanır. Bu yöntem, erişkin nöral kök hücrelerin mekansal olarak sunulan kendini yenileme ve farklılaşma ipuçlarına verdiği yanıtı araştırmak için kullanılmıştır. Bu makale, Scheideler ve arkadaşlarının protokolünü CMO etiketli hücreleri yakalayacak DNA desenlerini oluşturmak için uyarlar. Bu fotopatterning protokolü temiz bir oda kullanmadan gerçekleştirilebilir. Tezgah üstü veya duman kaputuna kolayca yerebilen ucuz ve piyasada bulunan ekipmanlar kullanır. Ucuz veya KENDIN YAP (kendin yap) fotolithografi ekipmanının kullanımı, temiz oda olanaklarına erişimi olmayan araştırmacılara erişilebilirliği arttırır ve araştırmacıların büyük bir zaman veya kaynak yatırımı yapmadan tekniği denemelerini sağlar31,32. Bununla birlikte, daha iyi çözünürlük ve birden fazla DNA özelliklerinin hizalanması, temiz oda tesislerinde yaygın olarak bulunan ticari spin kaplayıcı ve maske hizalayıcı kullanılarak elde edilebilir.
Burada, DNA tabanlı yapıştırma kullanarak hücreleri tek hücre çözünürlükte desenleme yöntemini açıklıyoruz. İlk olarak, pozitif bir fotoresist ile fotopatterning, aldehit modifiye cam substrat üzerine amin modifiye DNA'nın yüksek çözünürlüklü desenlerini oluşturmak için kullanılır. Daha sonra, slayt belirli olmayan hücre ekini azaltmak için eleilir ve hücreleri desenli bölgeler üzerinde sınırlamak için PDMS akış hücreleri oluşturulur. Hücreler daha sonra kolesterol ile işlevsel hale getirilen ve sonuç olarak hücre zarına yerleştirilen kısa DNA oligonükleotidleri ile etiketlenir. Hücreler daha sonra DNA mikropatternlerinin üzerinden akar. Hücre yüzeyi DNA'sı ile cam yüzeydeki DNA arasındaki melezleme, hücrelerin DNA desenine özgü olarak yapıştırılmasıyla sonuçlanır. Yapışmayan hücreler yıkanır ve yapışan hücre deseni ortaya çıkar. Bu işlem, birden çok hücre türünü desenlamak veya çok katmanlı yapılar oluşturmak için yinelenebilir. İstenirse, hücreler 3D hücre kültürü için bir ECM'ye tamamen gömülebilir.
Protocol
1. Tasarım deneyi
- Özellik boyutunu, özellik aralığını, ilgili hücre türlerinin sayısını ve hücrelerin birbirine göre düzenlenmesini göz önünde bulundurarak istediğiniz denemeyi planlayın. Örnek oligo dizileri içeren Ek Dosya 1, deneysel tasarım için bir kılavuz ve Ek Dosya 2'ye bakın.
- Bilgisayar destekli tasarım yazılımı kullanarak foto maskesi tasarlayin. Ek Dosya 3 'te örnek bir foto maskesi verilmiştir.
- Standart mikroskop slaydının (25 mm x 75 mm) boyutlarının dikdörtgenini çizin.
- Slayt boyunca eşit olarak dağıtılmış 10 mm genişliğinde ve 10 mm uzunluğunda dört dikdörtgen bölge çizin.
- Her bölgede, deneme için istenen boyut, şekil ve aralık olan çizim özellikleri çizin. Hücreler yalnızca deneydeki bu özelliklere yapışır.
- Birden çok hücre türü için hizalanmış foto maskeler oluşturmak için, tüm özellik kümeleriyle bir ana çizim oluşturun ve ardından her hücre türüne karşılık gelen sürümleri kaydedin.
- 1.2.3 saydam ve daha büyük bölgeler siyah olarak çizilen özelliklerle bu CAD çiziminden yüksek çözünürlüklü (inç başına en az 20.000 nokta) saydamlık foto maskesi sipariş edin.
2. Fotopattern DNA'sı aldehit fonksiyonelleştirilmiş slaytlara (Scheideler ve ark.29'dan uyarlanmış protokol)
- Birden fazla hücre tipini desenliyorsanız, özelliklerin hizalamasını kolaylaştırmak için herhangi bir DNA deseni oluşturmadan önce aldehit fonksiyonelleştirilmiş slaytta fidücial belirteçler üretin. Fiducial belirteçler oluşturmak için alternatif yöntemler Ek Dosya 1'de önerilmektedir.
- Metal fidücial belirteçler oluşturmak için, 2.3 - 2.11 adımlarında açıklandığı gibi S1813 pozitif fotoresist uygulayın. Daha sonra hizalaması kolay olacak büyük özellikler içeren bir foto maskesi kullanın. Bu özellikleri DNA desenleme için kullanılacak foto maskelerin tasarımına dahil edin.
- Elektron-top buharlaştırma kullanarak slayt üzerine ince bir titanyum filmi (100 Angstroms) biriktirin29. Aseton kullanarak fazla metal ve fotoresisti çıkarın ve ardından DNA fotopatterningine geçin.
- DNA tamponunda 5'-amin modifiye oligodan oluşan 20 μM'lik bir çözelti hazırlayın (suda 50 mM sodyum fosfat, pH = 8.5). Önerilen oligo dizileri için Ek Dosya 2'ye bakın.
NOT: Bazı desenler ve uygulamalar için 5 μM kadar az amin modifiye oligo kullanmak mümkündür, bu nedenle yüzey DNA konsantrasyonunun optimize edilmesi gerekebilir. - Sıcak bir plakayı 100 °C'ye önceden ısıtın.
- Bir spin kaplayıcının rotorasına aldehit fonksiyonelleştirilmiş bir cam slayt takmak için çift taraflı bant veya vakum kullanın.
DİkKAT: Spin kaplama sırasında kayma müfrezesi bir güvenlik riskidir. Spin kaplayıcıyı her zaman akrilik kutu gibi kapaklı kapalı bir kapta kullanın.
NOT: Camı çizmek için elmas bir katip veya benzeri bir uygulama kullanarak slaydın bir köşesini etiketleyin. Bu, fotoresist yıkandıktan sonra slayt tanımlama ve yönlendirmeye yardımcı olur. - Pozitif fotoresisti aldehit kaydırağı üzerine bırakmak için tek kullanımlık bir pipet kullanın. Hatta kaplamalar için, ortada büyük bir damla yerine slayt boyunca fotoresistin küçük damlalarını ekleyin(Ek Şekil 1A).
- Spin coater'ı kullanarak, slaydı 30 s için 3000 rpm'de döndürün.
- Fotoresist çapraz bağlantı için slaytı 1,5 dakika (yumuşak fırın) için 100 °C jakuzi üzerine yerleştirin.
- Slaydı ocaktan çıkarın. Bu deney için istenen özelliklere sahip bir fotokübe slaydın üzerine yerleştirin ve fotokütleyi bir cam parçasıyla tartın(Ek Şekil 1B,C). Tüm kurulumu opak bir kutuda örtün (Ek Şekil 1D). 2 dakika boyunca bir UV lambası (365 nm dalga boyu, 360 mW, slayttan 5 inç, toplam radyant enerji yoğunluğu 100 mJ / cm2)ile maruz kalın.
NOT: UV ışığı fotokübenin şeffaf bölgelerinin altındaki fotoresistteki polimer bağlarını kırarak DNA'nın daha sonra yapışabileceği bölgeler oluşturacaktır. - 3-5 dakika boyunca geliştirici çözümüne dalarak slaytı geliştirin(Ek Şekil 1E).
- Fazla geliştirici çözümünü suyla durulayın. Bir hava veya nitrojen akışı altında kurutun. (Ek Şekil 1F).
- Mikroskop altındaki slayta bakarak fotolithografinin başarılı olduğunu onaylayın. Fotoresist UV ışığına duyarlı olduğundan, bu adımı hızlı bir şekilde yapın ve diğer slaytları hazırlarken (varsa) slaytı karanlıkta saklayın.
NOT: Başarıyla desenlenmiş bir slayt, her unsur için keskin bir şekilde tanımlanmış kenarlara sahip olmalı, çatlak olmamalı ve kenarlarda unsur bozulması olmamalıdır. Doğru ve yanlış fotolithografi örnekleri Ek Şekil 2A'da verilmiştir. Fotolithografi istenen özellik kalitesini sağlamiyorsa sorun giderme önerileri için Tablo 1'e bakın. - Slaydın her fotopatlanmış bölgesine 20 μM amin modifiye oligo çözeltisinin (Adım 2.1) bir damlacığı ekleyin. Damlacığı tüm bölgeye hafifçe yaymak için bir pipet ucu kullanın, slaydı çizmemeye dikkat edin. (Ek Şekil 1G).
- Slaydı 65-70 °C fırında DNA çözeltisi slayt yüzeyine (yaklaşık 1 saat) tamamen kuruyana kadar pişirin.
- Desenli, pişmiş slaytları 15 cm hücre kültürü çanağını içine yerleştirerek ve bir çalkalayıcının üzerine dumanlı bir davlumbazın içine yerleştirerek indirgeyici aminasyon gerçekleştirin. 100 mg sodyum borohidrit tartın. Dumanlı bir kaputta, 40 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin, hafifçe karıştırın ve desenli slaytları içeren yemeğe ekleyin. Reaksiyonun hafifçe sallanarak 15 dakika devam etmesine izin verin.
NOT: Oligodaki amin ilk olarak slayt yüzeyinde aldehitler bulunan bir Schiff tabanı oluşturur. Bu, DPAC'ta kullanılmadan önce geri dönüşü olmayan bir bağa dönüştürülmesi gereken ters çevrilebilir bir kurdant bağdır. Bir azaltıcı maddenin (sodyum borohidrit) eklenmesi, Schiff tabanını indirgeyici aminasyon ile ikincil bir amine dönüştürür.
DİkKAT: Sodyum borohidritin su ile reaksiyona girerek hidrojen gazı oluşturması ve reaksiyon başladıktan sonra saatlerce veya günlerce bunu yapmaya devam etmesidir. Duman kaputunda indirgeyici aminasyon adımını gerçekleştirin ve tüm sodyum borohidrit çözelti atıklarını duman kaputunda açık veya gevşek bir şekilde kaplanmış bir kapta en az 24 saat tutun. - %0,1 sodyum dodecyl sülfat (SDS) ile iki kez suda, ardından damıtılmış su ile üç kez yıkayarak tepkilenmemiş DNA'yı çıkarın. Kaydırağı azot veya hava akışı altında kurutun.
- Kalan fotoresisti çıkarmak için slaydı asetonla durulayın.
NOT: Bu noktada, DNA slayta geri dönüşümsüz ve yaygın olarak bağlanmış ve tüm tepkilenmemiş aldehit fonksiyonel grupları alkole dönüştürülmüştür. Fotoresiste artık gerek yok. - Birden çok oligo desenli olacaksa, 2.4 adımına dönün, fotokütleyi fiducial işaretlerle hizalayın ve yineleyin.
NOT: Deneme burada duraklatılabilir. Slaytları vakumlu bir kurutucuda saklayın. Kuru koşullar altında, slaytlar kalite kaybı olmadan 3 aya kadar saklanabilir.
3. Slayt hidrofobik (isteğe bağlı) yapın (Todhunter ve ark.24'ten uyarlanmış protokol)
NOT: Slaytın yüzey kimyasını daha hareketsiz ve hidrofobik hale getirmek için değiştirmek avantajlıdır, ancak gerekli değildir. Spesifik olmayan hücre eki bu yüzeylerde azalır33, böylece hücrelerin slaytın desensiz alanlarına özgü olmayan bağlanmasını hafifletir. Ek olarak, desenli hücreler nihayetinde bir hidrojel içine gömülecek ve slayttan aktarılacaksa, yüzey işleme, hücre yüklü hidrojelin bozulma veya yırtılma olmadan slayt boyunca güvenilir bir şekilde taşınması için gereklidir. (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctyl) dimetilchlorosilane ile silanizasyon, slayt yüzeyinde hidrofobik floroalkil gruplarının varlığı ile sonuçlanır.
DİkKAT: Asetik asit ve metilen klorür dumanına maruz kalmayı önlemek için kimyasal duman kaputunda 3,1'den itibaren tüm adımları uygulayın.
- Kaydırağı% 10 asetik asitle durulayın ve ardından bir hava akımı altında kurutun.
- Cam bir Coplin kavanozunda, 60 mL metilen klorür (dikloromethane), 0,6 mL trietillamin ve 0,6 mL (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctyl) dimetilchlorosilane çözeltisi hazırlayın. Karıştırmak için metal bir spatula ile karıştırın.
NOT: Bu reaktifler suya karşı hassastır. Kuru koşullarda saklanmalı ve mümkün olduğunca taze kullanılmalıdır. - Slanin çözeltisini içeren Coplin kavanozuna slaydı ekleyin. Coplin kavanozunu bir yörünge çalkalayıcısına yerleştirin (60-80 rpm'ye ayarlayın) ve slanin ve slaytın reaksiyonunun 15 dakika boyunca ilerlemesini sağlar.
- Slanin çözeltisinden slaydı çıkarmak için metal forseps kullanın. Slayttan fazla silane çıkarmak için 1 dakika boyunca metilen klorür içeren bir Coplin kavanozuna slaydı batırın.
- Slaydı etanol içeren 50 mL konik bir tüpe daldırın. Kışkırtmak. Slaydı damıtılmış su içeren 50 mL konik bir tüpe batırın. Kışkırtmak.
NOT: Metilen klorür ve su yanıltıcı değildir, bu nedenle son su durulamadan önce fazla metilen klorürü çıkarmak için bir etanol durulama gerekir. - Kaydırağı sudan çıkarın ve inceleyin. Slayt oldukça kuru olmalı, herhangi bir su damlacıkları 90 ° 'den fazla temas açısına sahip olmalıdır. Slaytların tamamen kurumasına izin verin ve kullanıma kadar vakum kurutucuda saklayın.
NOT: Deneme burada duraklatılabilir. Slaydı kuru koşullarda saklayın.
4. PDMS akış hücrelerini hazırlayın ve deneme için kaydırın
NOT: Dikdörtgen PDMS akış hücreleri, hücreleri slaydın desenli bölgeleri üzerinde yoğunlaşmak için kullanılır. 3D olarak kültüre edilen deneyler için akış hücreleri hidrojel için bir kalıp oluşturur.
- SU-8 master'ın PDMS akış hücreleri için kalıp olarak kullanılmasını sağla.
- Ön ısıtma ısıtıcısı 95 °C'ye kadar.
- Silikon gofrete 5 mL SU-8 2075 ekleyin.
- 10'lar için 500 rpm'de gofret üzerinde SU-8'i ve ardından 30'lar için 1.000 rpm'yi döndürün. Bu,34yüksekliğinde 240 μm'ye kadar özellikler oluşturmalıdır.
- Gofretleri ocakta en az 45 dakika yumuşak pişirin.
- Gofretleri ocaktan çıkarın. Fotomask (bkz. Ek Dosya 4)(emülsiyon tarafı aşağı) gofretin üzerine koyun ve foto maskesi ile slayt arasındaki teması sağlamak için cam bir diskle tartın.
- 350 mJ/cm2radyant enerji yoğunluğu için UV ışığı (365 nm) ile maruz kalın.
- 12-15 dakika boyunca ocakta gofret pişirin.
- Gofretleri geniş cam kaba yerleştirin. SU-8 geliştirici çözümü ile gofret örtün. Bir çalkalayıcıya yerleştirin ve en az 15 dakika boyunca çalkalarken geliştirin.
- Gofret'i geliştirici çözümünden kaldırmak için forseps kullanın. Bir fışkırtme şişesinden daha geliştirici çözelti püskürterek 5 s durulayın. Durulamak için izopropil alkol ile püskürtün. Beyaz bir çökeltme görünürse, gofret geliştirici çözümüne döndürün ve daha uzun süre geliştirin.
- Bir hava veya nitrojen akışı altında kuru gofret.
- Slaytı 5 dakika pişirin.
NOT: Ana gofret oluşturulduktan sonra, özellikler bozulmadan kaldığı sürece süresiz olarak yeniden kullanılabilir.
- PDMS'yi hazırlayın.
- Bir tartım teknesinde, polidimetilsiloxane elastomer ve crosslinker'ı 10:1 oranında (kütleye göre) ekleyin. Eşit karıştırmayı sağlamak için kuvvetlice karıştırın.
- Daha fazla kabarcık görünmeyene kadar PDMS'yi vakumlu bir kurutucuda 15-30 dakika gazdan arındırın.
- Ana gofret 15 cm'lik bir doku kültürü kabına yerleştirin. Gofret üzerine PDMS dökün. Kabarcıklar ortaya çıkarsa, birkaç dakika boyunca vakum kurutucusunda gazdan arındır.
- 60 °C fırında 3 saat pişirin.
NOT: Pişirmeden sonra, PDMS akış hücreleri tezgahta süresiz olarak saklanabilir.
- PDMS akış hücrelerini deneme için hazırlayın.
- CMO-DPAC denemesini başlatmadan kısa bir süre önce, ana gofretten gerekli sayıda PDMS akış hücresini kesin. Plazma, yüzeyi hidrofilik hale getirmek için 90 s için 10 cc/ dakika oda havasıyla oksitlenir.
- Her bir akış hücresini, her iki tarafta 1-2 mm PDMS kalacak şekilde kesin, ardından bir giriş ve çıkış oluşturmak için akış hücresinin üst ve alt kısmını kesin.
- Adım 2 ve 3'te oluşturulan desenli slaydı alın. Fotokütlenin üstüne hizalayın.
- Referans olarak fotokütleyi kullanarak, PDMS akış hücrelerini her desenli bölgenin konumuna slayda yerleştirin.
- Ek Şekil 1H'degösterildiği gibi, her akış hücresinin girişine 50 μL fosfat tamponlu salin (PBS) + % 1 sığır serum albümini (BSA) ekleyin. Akış hücresinin PBS + % 1 BSA tarafından tamamen doldurduğunu ve büyük kabarcıklar olmadığını onaylayın. Hemen Adım 5 ve 6'ya geçin.
NOT: BSA ile engelleme, slayt yüzeyine özgü olmayan hücre yapışkanını en aza indirir.
5. Kolesterol modifiye DNA ile hücreleri kaldırın ve etiketleyin
- Kolesterol modifiye DNA çözümlerini hazırlayın.
- Deneydeki her hücre kümesi için, kolesterol modifiye Universal Anchor Strand'ın 100 μM stok çözeltisinin 3 μL'sini bir Adaptör Telinin 100 μM stok çözeltisinin 3 μL'si ile karıştırın. 1 dakika kuluçkaya yatır. Bu, oligoları önceden melezleyecek. 4 μM Evrensel Bağlantı + Adaptör çözümü oluşturmak için 69 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin.
- Deneydeki her hücre kümesi için, 12 μL PBS'ye 100 μM Evrensel kolesterol modifiye Co-Anchor Strand stok çözeltisinin 3 μL'sini ekleyerek 20 μM'lik bir çözelti oluşturun.
- Tek hücreli süspansiyonları hazırlayın.
- Yapışık hücreler için, hücreleri kültür şişesinden çıkarmak için tripsin veya başka bir ayrışma maddesi kullanın. Hücreleri peletmek için tripsin ve santrifüj nötralize etmek için kültür medyası ekleyin. Yapışmayan hücreler için hücre süspansiyonu ve santrifüjü toplayarak hücreleri peletlenin.
- Hücre peletini 1 mL buz gibi PBS veya serumsuz ortamda yeniden depola. 1-3 milyon hücreyi 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 4 dakika boyunca 160 x g'da santrifüj.
NOT: Kullanılan hücre tipi topaklanma/toplama eğilimine sahipse, istenmeyen hücre toplamayı azaltmak için tüm yıkama adımları için kalsiyum ve magnezyum iyonları içermeyen PBS kullanın. Canlılık kullanılan hücre tipi için özel bir endişe ise, PBS yerine serumsuz ortam kullanın. Fetal sığır serumu içeren ortam, lipid modifiye oligoların birleştirilmesine engel olabileceği için hücre etiketlemesi için önerilmez. 35
- Hücreleri kolesterol modifiye oligolarla etiketle.
- Hücre peletini 75 μL buz gibi PBS veya serumsuz ortamda yeniden depola. Hücre canlılığını en üst düzeye çıkarmak ve kolesterolle değiştirilmiş oligoların hücre yüzeyinden kaybını en aza indirmek için hücreleri etiketleme ve yıkama işlemi boyunca bir buz kovasında tutun.
NOT: DNA'yı eklemeden önce hücrelerin yeniden dürtülmesi, DNA'nın hücre popülasyonu arasında dağılımının tekdüze olmasını sağlar. - Adım 5.1.1'de oluşturulan 4 μM Evrensel Çapa + Adaptör çözeltisinin 75 μL'lik kısmını hücre süspansiyonu içeren mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. Pipetleme ile iyice karıştırın. Buzda 5 dakika kuluçkaya yaslanın.
- Mikrosantrifüj tüpüne 15 μL Evrensel Bağlantı Çözümü ekleyin. Pipetleme ile iyice karıştırın. Buzda 5 dakika kuluçkaya yaslanın.
- Hücre süspansiyonundan fazla oligoları çıkarın. Mikrosantrifüj tüpüne 1 mL buz gibi PBS veya serumsuz ortam ekleyin. P1000 pipetle karıştırın. 4 °C'de 4 dakika boyunca 160 x g'da santrifüj. Üstnatant atın. İki kez daha tekrarla.
NOT: Hücreler topaklanmaya eğilimliyse, hücre süspansiyonunu son yıkamadan önce 40 μm'lik bir filtreden geçirin. Hücreler mikrosantrifüj tüpünün yanına adsorpsiyona eğilimliyse, tüpü kazein ile önceden engellemeyi düşünün.
- Hücre peletini 75 μL buz gibi PBS veya serumsuz ortamda yeniden depola. Hücre canlılığını en üst düzeye çıkarmak ve kolesterolle değiştirilmiş oligoların hücre yüzeyinden kaybını en aza indirmek için hücreleri etiketleme ve yıkama işlemi boyunca bir buz kovasında tutun.
6. DNA etiketli hücreleri desenlendir
- En az 25 milyon hücre/mL hücre yoğun bir çözelti oluşturmak için hücreleri buz gibi PBS veya serumsuz ortamda yeniden kullanın.
NOT: Adım 4'te açıklanan 10 mm x 15 mm x 200 μm PDMS akış hücrelerinden dördünü kullanan bir slayt için, bu yoğun hücre süspansiyonunun yaklaşık 100 μL'si gereklidir. Bu hücrelerin çoğu desene uymayacak ve sonuçta atılacak olsa da, desen üzerinde son derece konsantre bir hücre çözümüne sahip olmak hücre deseninin verimliliğini önemli ölçüde artırır. - Kaydırağı al ve hafifçe eğ. Desenli slayttaki her akış hücresinin girişine 25 μL hücre süspansiyonu ekleyin. PBS + %1 BSA çözümünü prizden çıkararak hücre süspansiyonun PDMS akış hücresini doldurmasını sağlar. Buzda veya oda sıcaklığında 30 sn kuluçkaya yatırın.
NOT: Bu noktada, akış hücresine mikroskop altında bakmak, hücreler arasında çok az veya hiç boşluk görünmeyen yoğun paketlenmiş hücreler göstermelidir. Bkz. Ek Şekil 2B. - Slaydın çıkışından 5 μL hücre süspansiyonu aspire edin ve girişe geri ekleyin. Akış hücresi başına 10 kez tekrarlayın.
NOT: CMO etiketli hücrelerin DNA desenli slayda yapıştırılması neredeyse anlıktır. Hücrelerin desenin üzerinden birden çok kez akması, bir hücrenin belirli bir DNA noktasının üzerinden akma ve yakalanma olasılığını artırır. - Fazla hücreleri yıkamak için pbs veya serum içermeyen medyayı her akış hücresinin girişine hafifçe pipetlayın. Hücre süspansiyonu çıkıştan toplayın. 2-4 kez veya mikroskop altındaki slaytın görsel incelemesi fazla hücre kalmadığını onaylayana kadar tekrarlayın.
NOT: Fazla hücreleri ilk yıkamadan kurtarmak avantajlı olabilir. Desenleme verimliliği tatmin edici değilse, fazla hücreler daha hücre yoğun bir çözelti oluşturmak için daha düşük bir PBS hacminde santrifüjlenebilir ve yeniden kullanılabilir ve ardından işlem Adım 6.2'den tekrarlanabilir. - Desendeki her hücre kümesi için 6.1-6.4 arası adımları yineleyin. Birden çok hücre türünün doğrudan yüzey şablonu tarafından desenli olduğu desenler için, desenin en az bol hücre türüyle başlayın ve en bol hücre türüyle bitirin.
NOT: Hücrelerin hepsinin ortogonal DNA dizileriyle etiketlendiği durumlarda bile, hücreleri birleştirmek yerine hücresel montajın her turunu sırayla yapmanız önerilir. Hücrelerin birleştirilmesi, her hücre popülasyonunun etkin bir şekilde seyreltilir ve desen verimliliğini azaltır. - Hücre derlemesinin son turu tamamlandıktan sonra, sonraki adımlar belirli bir denemeye göre değişir. Hücrelerin camda kalması amaçlanıyorsa, slaydı içeren bir Petri kabına ortam ekleyin ve ardından PDMS akış hücrelerini slayttan itmek için yavaşça tokmak kullanın. Hücreler bir hidrojel içine gömülecek ve 3B olarak kültürlenecekse, Adım 7'ye geçin.
7. 3D kültür için hidrojel transfer (isteğe bağlı)
- %2 DNase içeren bir hidrojel öncül çözeltisi hazırlayın.
NOT: Çözümün bileşimi deneysel kuruluma bağlı olarak değişecektir. Matrigel ve Matrigel ve kolajen karışımları Bu protokolde iyi çalışıyorum, ancak diğer hidrojeller de mümkün. - Her akış hücresinin girişine %2 DNaz içeren 50 μL hidrojel çözelti ekleyin. Hidrojel çözeltisini akış hücresine sürerek, çıkıştan fazla sıvıyı epire edin. Viskoz hidrojel öncülleri için, hidrojelin akış hücresine akmasına yardımcı olmak için slaydı hafifçe eğmek gerekebilir.
- Hidrojenin ayarlanmasına izin vermek ve hücreler ile yüzey arasındaki DNA tabanlı yapışmaları ayırt etmek için slaydı 37 °C'de 30-45 dakika (hidrojel jelasyon kinetiğine bağlı olarak) kuluçkaya bırakın.
- Her akış hücresini slayttan çıkarın ve hidrojel öncül çözeltisinin üzerine yerleştirin.
- 2 kuyulu bir oda kaydıranına veya 6 kuyulu bir plakaya 50 μL hidrojel öncüsü ekleyin.
- Pipet her akış hücresinin her iki tarafında 10 μL PBS.
- PBS'yi akış hücresinin tam uzunluğu boyunca dağıtmak için bir jilet veya ince noktalı cımbız kullanın, ardından PBS'nin hidrojelin altına hücum etmesi için akış hücresinin kenarlarını hafifçe kaldırın.
NOT: Bu, hidrojel slayt boyunca "yüzer", bozulma veya yırtılma olmadan aktarıma izin verir. - Akış hücresini cam kaydırağın kenarına hafifçe taşımak için jilet kullanın.
- Slaydı ters çevirin. Jiletle, akış hücresini kaydırağın üzerine indirerek jiletin üzerine itin.
- Kavisli forseps kullanarak jiletten akış hücresini seçin. Akış hücresini, hücrelerin altta olması için ters çevirin ve ardından hidrojel öncül çözeltisinin damlacıklarının üzerine yerleştirin.
- Her akış hücresi için 7.4.1 - 7.4.6 adımlarını yineleyin.
- En az 30 dakika kuluçkaya yatırın, böylece desenli hücreleri içeren hidrojel hidrojel altlığına bağlanabilir, bu da desenli hücrelerin tam gömülmesine neden olabilir.
- PDMS akış hücresini çıkarın.
- PDMS akış hücresini batırmak için yeterli ortam ekleyin.
NOT: Ortam akışı, hidrojel ve PDMS akış hücresi arasındaki yapışkanı gevşetecektir. - Akış hücresinin uzun ekseni boyunca yönlendirilmiş kavisli tokmaklar kullanarak akış hücresini açılana ve ortama kayana kadar hafifçe iteler. Akış hücresini kümesleri ile toplayın ve atın.
NOT: En iyi sonuçları elde etmek için kavisli forsepsleri yayın ve PDMS akış hücresinin duvarlarına hafif basınç uygulayın. Akış hücresinin uzun ekseni yönünde kuvvet uygulayın.
- PDMS akış hücresini batırmak için yeterli ortam ekleyin.
8. CMO ile hücrelerin başarılı bir şekilde etiketlenerek onaylayın (isteğe bağlı, sorun giderme için)
- Denemede kullanılan Bağdaştırıcı Teli'nin yüzey yapışıklık sırasını tamamlayan floresan modifiye (FAM veya AF647) oligonükleotid sipariş edin.
- Hücreleri CMO DNA ile etiketle ve Adım 5'te açıklandığı gibi fazla DNA'yı yıkayın. 200 μL buz gibi PBS'de yeniden depola.
- PBS'de floresan etiketli tamamlayıcı oligonükleotidden oluşan 4 μM'lik bir çözelti yapın. Hücre süspansiyonu için bu çözeltinin 200 μL'sini ekleyin. 5 dakika boyunca buzda kuluçkaya yaslanın.
- 1 mL buz gibi PBS ekleyin. Karıştır. Hücreleri peletmek için santrifüjle. Üsttant kaldırın. Melezleşmemiş DNA'ları yıkamak için bu işlemi iki kez daha tekrarlayın.
- Hücre yüzeyindeKI DNA varlığını ölçmek için analitik akış sitometrisi gerçekleştirin.
- Akış sitometresinde, DNA ile etiketlenmiş olmayan kontrol hücrelerini analiz edin. Bu nüfusa göre kapılar kurun.
- Floresan etiketli tamamlayıcı oligonükleotid ile tedavi edilmiş CMO etiketli hücreleri analiz edin.
- Ortalama floresan yoğunluğunu hesaplayın.
Representative Results
Bu protokol, hücrelerin 2D ve 3D olarak yüksek hassasiyetle ve özel reaktifler veya pahalı temiz oda ekipmanı kullanmadan desenlenerek örüntülen olmasını mümkün kılar. Şekil 1'de protokole genel bir bakış gösterilmiştir. İlk olarak fotolithografi ile DNA fonksiyonelleştirilmiş slaytlar oluşturulur. Daha sonra, hücreler CMO'larla etiketlenir. Hücreler daha sonra slaytın yalnızca DNA işlevli bölgelerine tutturularak slaytın üzerinden akar. Fazla hücreler yıkandıktan sonra istenilen hücre düzeni ortaya çıktı. Bu hücreler slaytta kültürlenebilir veya DNase içeren bir hidrojel içine gömülebilir ve 3B hücre kültürü için slayttan aktarılabilir.
Hücrelerin CMO'larla etiketlenerek DNA desenli slayda bağlanmaları sağlar (Şekil 2). İlk olarak, kolesterol modifiye Universal Anchor Strand Adaptör Teli ile önceden melezlenmiştir. Ardından, Evrensel Bağlantı + Adaptör çözümü hücre süspansiyonu ile 1:1 karıştırılır. Universal Anchor + Adapter kompleksindeki kolesterol hücre zarına girer. Evrensel Çapa Teli ile melezlenen kolesterol modifiye Universal Co-Anchor Strand'ın eklenmesi, kompleksin net hidrofobikliğini artırarak hücre zarındaki CMO kompleksinin stabilitesini artırır26. Hücre süspansiyonundan fazla DNA yıkandıktan sonra, hücreler slaytın üzerinden akar. Adaptör Teli ve Yüzey DNA Strand arasındaki hibridizasyon, hücrelerin slaytın DNA desenli bölgelerine bağlanmasıyla sonuçlanır.
Hücrelerin deseni, amin modifiye DNA oligolarının aldehit modifiye cam slaydının belirli bölgelerine bağlanmasını kısıtlamak için fotolithografi kullanılarak oluşturulur29 (Şekil 3A). Pozitif fotoresist aldehit fonksiyonelleştirilmiş bir slayt üzerine spin kaplıdır. Daha sonra slaydın üstüne saydamlık foto maskesi yerleştirilir ve slayt UV ışığına maruz kalır. Geliştikten sonra, slaytın UV ışığına maruz kalan bölgeleri artık fotoresist olarak kaplanmamıştır ve bu nedenle aldehit gruplarına maruz kalmaktadır. Amin modifiye DNA oligos 20 μM çözeltisi daha sonra slayt üzerine bırakılır ve desenli bölgeleri kapsayacak şekilde yayılır. Pişirme ve ardından indirgeme aminasyonu, amin modifiye DNA ile slayt arasında kovalent bir bağa neden olur. Dikkat çekici bir şekilde, bu işlem daha önce desenli oligoların işlevselliğini kaybetmeden birden fazla oligoyu desenlamak için tekrarlanabilir (Şekil 3B). Bununla birlikte, her iki oligonun da azaltılmış konsantrasyonda varlığına neden olan örtüşen kalıpları önlemeye özen gösterilmelidir(Ek Şekil 3). Modüler etki alanlarında (3' uca en yakın 20 taban) farklılık gösteren Bağdaştırıcı Iplikçikleri kullanılarak birden çok hücre popülasyonu sırayla desenlenebilir.
Bu fotopatterning protokolü Scheideler ve ark. tarafından temiz bir oda bağlamında geliştirilmiş olsa da, kimyasal bir duman başlığına kolayca uyan ucuz, "ev yapımı" bir fotolitografi kurulumu ile benzer sonuçlar elde etmenin mümkün olduğunu gösterdik. Kurulum, DC motor, dijital kontrolör ve CD pasta kutusundan yapılmış 400 $ spin kaplamanın yanı sıra, tek tek bileşenlerden monte edilen ve yeniden tasarlanmış bir keskinlik kabına yerleştirilen bir UV lambası içerir(Ek Şekil 1). Ev yapımı fotolithografi kurulumunun en büyük avantajı, tek hücre boyutunda özellikler oluşturabiliyorken çok uygun fiyatlı olmasıdır (tüm ekipmanlar için < $ 1000). Bununla birlikte, ucuz ekipmanın kullanımının sınırlamaları vardır - örneğin, maske hizalayıcı kullanmadan birden fazla DNA oligosunu desenlendirmek için fiducial belirteçleri hassas bir şekilde hizalamak daha zordur. Temiz bir odaya kolay erişimi olmayan veya büyük bir yatırım yapmadan bu yöntemi denemek isteyen laboratuvarlar için bu ucuz fotolithografi kurulumunu öneriyoruz.
DNA programlı hücre yapıştırma için en uygun koşulları belirlemek için, hücre yüzeylerindeki DNA iplikçik konsantrasyonlarını sistematik olarak değiştirdik ve hücre yapıştırmasının VERIMLILIĞINI DNA modifiye cam yüzeylere ölçtük. Etiketleme çözeltilerinde Universal Anchor + Adapter Strand ve Universal Co-Anchor konsantrasyonu çeşitli büyüklük sıraları arasında değişiktir (Şekil 4A, B), hücre başına 104 - 106 DNA kompleksi ilesonuçlanır (Ek Şekil 4). Hücre yapışıklığı doza bağımlıydı, hücreler 0,05 μM veya daha az konsantrasyonda CMO'larla etiketlendiğinde DNA desenine minimum hücre yapışıklığı ve 2,5 μM ve daha yüksek konsantrasyonda yüksek doluluk. Bu nedenle, çoğu deneyde 2 μM Evrensel Çapa + Adaptör Teli çözeltisi ve 2 μM Evrensel Bağlantı çözeltisi kullandık. Cam yüzeyde kullanılan DNA miktarının29 azalması veya Adaptör Teli ile yüzey teli arasındaki uyumsuzlıkların artması durumunda hücre yapışmasının da azalması beklenir. Bağdaştırıcı Zinciri sıra tasarımı hakkında daha fazla bilgi Ek Dosya 2 'de verilmiştir. CPG tekrarı olmayan Adaptör Telleri kullanılarak CMO etiketlemesi, fare TLR9'u ifade eden HEK hücrelerinde TLR9'u uyarmadı ( Ek Şekil5).
Revize edilen protokolün tekrarlanabilir ve verimli DNA programlı hücre yapışıklık sağladığına dair çeşitli gösteriler sunuyoruz. Örneğin, CMO'larla etiketlenmiş insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC' ler) DNA kalıplarına yüksek verimlilikle yapışmıştır. CMO etiketli HUVEC'ler ve LMO etiketli HUVEC'ler (Şekil 5A). CMO-DPAC kullanılarak desenlenen hücreler canlılıklarını ve işlevlerini korudu. CMO'larla etiketlenmiş hücreler canlılığı değerlendirmek için calcein ve ethidium homodimer ileboyanmıştır (Ek Şekil 6). Etiketsiz kontrol hücrelerine kıyasla canlılık farklılıkları küçüktü (%94'e karşı %97). CMO-DPAC ile desenlenen ve Matrigel'e aktarılan tek MDCK'ler 5 günlük kültürden sonra doğru şekilde çoğalabildi ve polarize edebildi (Şekil 5B). DPAC ayrıca hücrelerin desenlerini üçüncü boyuta detaylandırmanın bir yolunu sağlar (Şekil 5C). Örneğin, tamamlayıcı CMO'larla etiketlenmiş hücrelerin alternatif katmanları tarafından çok katmanlı, çok hücreli agregalar oluşturulabilir (Şekil 5C). Bu deneyler, protokolün tekrarlanabilir olduğunu, hücre canlılığını veya işlevselliğini olumsuz etkilemediğini ve 3D ECM'de tek bir görüntüleme düzleminde başarıyla kültürlenebilen hücresel desenler sağladığını göstermektedir.
DPAC, hücre yapışıklıklarını yönlendirmek için ortogonal DNA dizileri sağlayarak, tek bir yüzeyde birden fazla hücre tipini desenlemenin bir yolu sağlar. DPAC'ın bu özelliğini uygulamak için fotolithografi ile oluşturulan DNA desenlerinin birbirine göre hizalanmış olması gerekir. Slayta biriktirilen metal güven verici işaretleyiciler, birden fazla fotokümenin hizalanmasına ve dolayısıyla aynı anda birden fazla hücre tipinin desenlenmesine izin verdi. Farklı benzersiz boyalarla boyanmış MCF10A'lar ortogonal CMO'larla etiketlenmiş ve UC Berkeley ve UCSF logolarının görselleştirilmesini oluşturmak için desenlenmiştir (Şekil 6). Bu deney, birden fazla benzersiz hücre popülasyonunun yüksek hassasiyetle ve çapraz kontaminasyon olmadan birlikte desenlenebileceğini göstermektedir.
CMO-DPAC kullanarak hücrelerin başarılı bir şekilde desenlenilmesi için yüksek kaliteli fotolithografi, hücre yüzeyinde yeterli oligo konsantrasyonu, desen üzerinde yüksek yoğunlukta hücre yoğunluğu ve yeterli yıkama gerekir. Bu adımlardan herhangi birinin başarısız olmaması nihai sonucu etkiler. Ek Şekil 2, doğru ve yanlış fotolitografinin örnek görüntülerini içerir (Ek Şekil 2A), tamamen dolu desenler oluşturmak için desen üzerinde istenen hücre yoğunluğu (Ek Şekil 2B), DPAC'ın sonraki adımları sırasında aşırı güçlü pipetleme nedeniyle desenli hücrelerin kaybı (Ek Şekil 2C) ve hücrelerin istenmeyen topaklandırılması (Ek Şekil 2D). Tablo 1, sık karşılaşılan hata noktalarının ve önerilen sorun gidermenin bir listesini içerir. Floresan tamamlayıcı oligoların kullanımı, slaytta desenli DNA'nın varlığını ve akış sitometrisi ile hücre yüzeyinde CMO'ların varlığını doğrulamak için sorun giderme aracı olarak önerilir (bkz.
Şekil 1: CMO-DPAC protokolüne genel bakış. İlk olarak, aldehit fonksiyonelleştirilmiş bir cam kaydırağın pozitif bir fotoresistle kaplanması, istenen desende şeffaflık maskesi ile kaplanması ve UV ışığına maruz kalmasıyla DNA desenli bir slayt oluşturulur. UV'ye maruz kalan fotoresist geliştirici ile yıkanır, aldehit kaydırağın açıkta kalan bölgelerini bırakır ve amin fonksiyonelleştirilmiş DNA'nın yüzeye bağlanmasına izin verir. Hücreler daha sonra CMO'larla etiketlenir ve yüzeyin üzerinden akar. Hücre zarındaki DNA, yüzeydeki DNA'ya melezlenerek yapışıklıkla sonuçlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hücreler adım adım bir işlemde CMO'larla etiketlenir. İlk olarak, kolesterol modifiye Universal Anchor Strand Adaptör Teli ile önceden melezlenmiştir. Ardından, Evrensel Bağlantı + Adaptör çözümü hücre süspansiyonu ile karıştırılır. Universal Anchor + Adapter kompleksindeki kolesterol hücre zarına girer. İnkübasyondan sonra, kolesterol modifiye Universal Co-Anchor Strand hücre süspansiyonuna eklenir, burada Universal Anchor Strand ile melezleşir ve hücre zarına sokulur. İkinci kolesterol molekülünün eklenmesi DNA kompleksinin net hidrofobikliğini arttırır ve membran içinde stabilize eder26. Fazla DNA yıkandıktan sonra, hücreler konsantre edilir ve desenli yüzeyin üstündeki pdms akış hücresine eklenir. Adaptör Teli'nin 3' ucu, cam slayttaki Yüzey DNA Strand ile melezleşir ve özellikle tamamlayıcı DNA ile işlevselleştirilmiş bölgelerde slayda yapışıklıkla sonuçlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Fotolithografi, sonuçta hücrelerin yerleştirilmesini belirleyecek DNA desenli slaytları oluşturmak için kullanılır. (A) Fotolithografi sürecine genel bakış. Aldehit fonksiyonelleştirilmiş bir slayt, pozitif bir fotoresist ile spin kaplıdır. UV ışığı, hücre yapışması istenen yerlerde saydam bir foto maskesi ile slayta parlar. Slayt geliştirildikten sonra, daha önce UV ışığına maruz kalan bölgeler artık aldehit gruplarına maruz kaldı. Amin fonksiyonelleştirilmiş bir DNA oligosunun 20 μM'lik çözeltisi daha sonra kaydırağa bırakılır ve desenli bölgelere yayılır. Slayt daha sonra amin ve aldehit grupları arasında Schiff bağları (C=N) oluşumunu teşvik etmek için pişirilir, geri dönüşümlü bir kurvalent bond29. PBS'de % 0.25 sodyum borohidrit ile sonraki indirgeyici aminasyon, Schiff tabanını indirgeyici aminasyon ile ikincil bir amine dönüştürür ve DNA ile slayt arasında geri dönüşü olmayan bir bağa neden oldu. Kalan fotoresist daha sonra aseton ile durulanarak çıkarılabilir. (B) Bu işlem, çok bileşenli DNA desenleri oluşturmak ve bu nedenle birden fazla hücre popülasyonu ile deneyler yapmak için tekrarlanabilir. (i) İlk oligo desenlendikten sonra, slayt tekrar fotoresist ile kaplanır ve protokol eskisi gibi ilerler. Birden fazla DNA ipliğinin desenlenmesi için, foto maskelerinin güven verici işaretleyiciler kullanılarak hizalanması gereklidir. (ii) Desenlenen her hücre türü Bağdaştırıcı Teli'nin 20 temel modüler etki alanında farklılık gösterir. Tamamlayıcı oligoların ortogonal kümeleri kullanılarak, çapraz yapışıklık olmadan birden fazla hücre tipi desenlenebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Etiketleme sırasında CMO konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak CMO etiketli hücrelerin DNA kalıplarına yapıştırılması artar. Bu deneyde, Universal Anchor + Adapter Strand (önceden melezlenmiş) ve Universal Co-Anchor eşit konsantrasyonlarda kullanılmıştır. Konsantrasyon, hücrelerin CMO etiketlemesi sırasında hücre süspansiyonundaki CMO konsantrasyonu anlamına gelir. (A) Hücre etiketlemesi sırasında CMO konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak CMO etiketli MCF10A hücreleri tarafından işgal edilen 15 μm çapında DNA lekelerinin yüzdesinin ölçülmesi. Veriler, üç deneyden standart sapma ± ortalaması olarak temsil edilir. (B) DNA desenlerinin (macenta) temsili görüntüleri ve farklı CMO konsantrasyonlarında MCF10As (siyan) yapışmıştır. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: CMO-DPAC, daha sonra kültür için üç boyutlu bir hidrojele gömülebilen ve/veya çok katmanlı yapılar oluşturmak için katmanlı iki boyutlu hücre desenleri oluşturmak için kullanılabilir. (A)CMO etiketli insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC' ler) ile LMO etiketli HUVEC'ler arasında doğrudan karşılaştırma doğrusal bir DNA modeline yapışmıştır. Her iki hücre etiketleme yöntemi de DNA deseninin yaklaşık %100 doluluğuna neden olur. (B) H2B-RFP'yi ifade eden Tek Madin-Darby Köpek Böbrek hücreleri (MDCK'ler) 200 μm aralıklı 15 μm çapında noktalara desenlendi ve daha sonra Matrigel'e gömüldü. 120 saatlik kültürden sonra, ortaya çıkan epitel kistleri E-cadherin, aktin ve kollajen IV için sabitlendi ve lekelendi. Beyaz kutudaki küresel, ayrıntılı olarak gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 50 μm. (C) Çok katmanlı hücresel yapılar, tamamlayıcı Adaptör Telleri ile ayrı hücre popülasyonları etiketlenerek ve her yeni hücre ilavesinin ondan önceki hücre katmanına yapışması için sırayla desenlenerek oluşturulabilir. (i) Çok katmanlı yapılar oluşturmak için hücre popülasyonlarının sıralı desenleme şeması. (ii) Bu işlem kullanılarak MCF10As'ın üç katmanlı hücre toplamları (boyalar kullanılarak görselleştirilmiştir) oluşturulmuştur. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Çapraz kontaminasyon veya yapışıklık kaybı olmadan birden fazla hücre tipi desenlenebilir. Birden fazla amin modifiye DNA oligosu aldehit kaydırağı üzerine sırayla desenlendi ve metal güven verici belirteçler kullanılarak hizalandı. Üç MCF10A popülasyonu (siyan, macenta, sarı) tamamlayıcı CMO'larla etiketlenmiş benzersiz boyalarla boyanmış ve slayt üzerine desenlenmiştir, bu da UC Berkeley ve UCSF logolarının bir görüntüsüyle sonuçlanmıştır. Ölçek çubuğu 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Tezgah üstü fotolithografi kurulumunun örnek görüntüleri. (A) Spin kaplamadan önce pozitif fotoresist ile kaplı spin kaplayıcı üzerinde kaydırın. (B) Saydamlık foto maskesi resmi. (C) Pozlama sırasında fotomask fotoresist kaplı slayt ile cam disk arasına sıkıştırıldı. (D) UV lambası için gövde, yeniden amaçlanan bir keskinlik kabından yapıldı. (E) Geliştirici çözümüne dalmış slayt. (F) Geliştirilmiş slayt. (G) Amin modifiye DNA çözeltisi slaytın desenli bölgelerine yayılır. (H) PDMS akış hücreleri slaydın desenli bölgelerinin üzerine yerleştirilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 2: Bu protokolün yaygın hatalarına bazı örnekler. (A) (i) UV maruziyeti öncesi az pişirme veya maruz kalma sonrası aşırı gelişen özellikler, pürüzlü kenarlara sahip ve boyutu düzensiz olabilecek özelliklere neden olabilir. (ii) Özelliklerin etrafında temiz kenarları, düzgün unsur boyutu ve desende belirgin çatlaklar olmayan doğru fotopatlanmış bir slayt örneği. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) Hücre yoğunluğu desen verimliliği için kritik öneme sahiptir. Mikroskop altında desenin üstündeki hücreleri gözlemlerken, soldaki örnek görüntünün kanıt ettiği gibi hücreler arasında birkaç boşluk bulunmalıdır. Ölçek çubuğu = 50 μm. (C) Desenli hücreler, aşırı güçlü pipetlemeden kaynaklanan sıvı kuvvetlerine duyarlı olabilir ve bu da desenli hücrelere zarar verebilir ve yerinden çıkabilir. Alttaki bir hücre birden çok hücrenin yapısını desteklediğinden, çok katmanlı hücre toplamları özellikle savunmasızdır. (i) Matrigel'e başarıyla katıştırılmış bir dizi hücre toplamı. (ii) Viskoz Matrigel'in çok kuvvetli bir şekilde pipetlemesi sonucu yerinden çıkan hücre agregaları ızgarası. (D) Hücrelerin topaklandırılması, özellikle epitel hücrelerde meydana gelebilir. Bu kümeler genellikle homotipiktir, ancak hücreler özellikle yapışkansa heterotipik (farklı türde zaten desenlenmiş hücrelere yapışan hücreler) olabilir. Görüntüde, üç farklı MCF10A popülasyonunun üç farklı tek hücreli dna lekelerinden (15 μm) oluşan bir diziye desenli olduğu gösterilmiştir. Dna lekelerin çoğunda 2-4 hücre takılıdır. Topaklama, EDTA tedavisi veya desenlemeden önce kümeler filtrelenerek çözülebilir. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 3: Çakışan fotopatternler, konsantrasyonda her iki oligonun da varlığıyla sonuçlanır. İki ortogonal amin modifiye oligo sırayla fotopatterned edildi, önce dikey bir çizgi (Strand 1), ardından üst üste binen yatay bir çizgi (Strand 2). Oligolar daha sonra floresan tamamlayıcı oligos ile hibridizasyon ile görselleştirildi. (A) Strand 1'in floresan görüntüsü. (B) Strand 1 floresan profilinin çakışmayı kapsayan 100 μm dikey çizgi üzerinde nicelemesi. (C) Strand 2'nin floresan görüntüsü. (D) Strand 2'nin floresan profilinin çakışmayı kapsayan 100 μm yatay çizgi üzerinde nicelemesi. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 4: CMO etiketleme konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak hücre yüzeyindeki DNA komplekslerinin nicelemesi. HUVEC'ler farklı konsantrasyonlarda CMO çözeltisi ile etiketlendi, yıkandı ve daha sonra floresan tamamlayıcı bir iplikçikle inkübe edildi. Bir MESF (Eşdeğer Çözünür Florokrom Molekülleri) mikrosfer kiti, nicel akış sitometrisi yapmak ve etiketleme sırasında CMO konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak hücre yüzeyindeki DNA komplekslerinin sayısını tahmin etmek için kullanılmıştır. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 5: CMO etiketleme TLR9 yanıtını uyarmaz. CMO etiketlemesinin TLR9'un DNA algılama mekanizmasını tetikleyip tetiklemeyeceğini ve bunun Adapter Strand dizisindeki CPG'lerden etkilenip etkilenmeyeceğini görmek için bir deney gerçekleştirildi. Fare TLR9'u ifade eden HEK hücreleri, ODN 1826 (CPG içeren bir TLR9 agonist), CMO Universal Anchor + Universal Co-Anchor + Adapter'in 0,2 μM'si ile bir gecede inkübe edildi. ODN 1826 (CMO-CpG) ile aynı diziyi içeren iplikçik veya benzer bir dizi içeren ancak CPG'lerin GPC'lerle (CMO-GpC) değiştirilmesiyle CMO Universal Anchor + Universal Co-Anchor + Adapter Strand. TLR9 stimülasyonu SEAP (salgılanan embriyonik alkali fosfataz) üretimine neden olacaktır. SEAP salgısı kolorimetrik bir test (absorbans) ile ölçüldü. Tedavi koşulları sadece PBS ile tedavi edilen dinlenme hücreleri ile karşılaştırıldı. CMO-GPC ile inkübasyon TLR9 ekspresyonunu uyarmadı. CMO-CpG ile inkübasyon dinlenme hücrelerinden biraz daha yüksek, ancak ODN-1826'dan çok daha düşüktü. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 6: CMO etiketleme işleminden sonra hücrelerin uygulanabilirliği. Protokolün canlılığı nasıl etkilediğini değerlendirmek için HUVEC'ler dört popülasyona ayrıldı: biri 1 saat boyunca buzda kaldı, biri PBS ile sahte etiketlendi, ancak aksi takdirde tüm santrifüj ve yıkama adımlarından geçirildi, biri CMO'larla etiketlendi ve kümeleri çıkarmak için 40 μm filtreden geçirildi. Hücreler daha sonra canlı ve ölü hücrelerin sayısını değerlendirmek için calcein ve ethidium homodimer ile boyandı. Tüm tedaviler buz kontrolünden (Tukey post-hoc analizi ile tek yönlü ANOVA) önemli ölçüde azalmış canlılıkla sonuçlandı, ancak CMO etiketlemesi için ortanca canlılık (filtrelemeli veya filtresiz) yaklaşık% 94 idi. Üç bağımsız deneyden toplanan veriler. * = s < 0.05. = p < 0.0001 Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
| Sonuç | Olası Nedenler | Önerilen Düzeltmeler |
| Fotolithografi – özellikleri çatladı | Tutarsız veya yetersiz yumuşak pişirme | Yumuşak pişirme süresini 3 dakikaya kadar artırın; plakanın gerçek sıcaklığını doğrulayın ve gerektiğinde sıcaklığı artırın |
| Fotolithografi – özellikler keskin değildir veya içinde fotoresist kalır | Az geliştirme | Slaytın geliştirici çözümünde harcadığı süreyi artırın; nazik ajitasyon dahil etmek |
| Fotolithography – slayt boyunca tutarsız özellikler | UV ışığı ortalanamayabilir veya doğru şekilde odaklanamayabilir | Düzgün yoğunlukta kolimlenmiş ışık sağlamak için UV ışık kurulumunu ayarlayın |
| Hücreler yüksek verimli desenli noktalara yapışmıyor | Yüzeyde yeterli DNA yok | Slaytı floresan tamamlayıcı oligolarla melezleyerek ve ardından mikroskop altında görüntüleme yaparak DNA'nın yüzeyde mevcut olduğunu onaylayın |
| Hücreler CMO ile yetersiz etiketlenmiş | Hücre süspansiyonu için floresan tamamlayıcı oligolar ekleyin ve akış sitometrisi ile floresan onaylayın | |
| Desen üzerinde yeterli hücre yok | HÜCRELERI konsantre etmek için PDMS akış hücresinden, santrifüjden yıkayarak hücreleri toplayın ve daha düşük hacimde yeniden askıya alın | |
| Hücre süspansiyonunda çok fazla CMO kaldı, slaytta DNA ile melezleme | Başka bir yıkama adımı ekleyin. Her yıkamada mümkün olduğunca fazla süpernatant çıkardığınızdan emin olun. | |
| Zaman ve sıcaklık nedeniyle CMO'nun çok fazla içselleştirilmesi | Hücreleri CMO ile etiketledikten sonra hızlı bir şekilde çalışın; hücreleri tutmak ve buz üzerinde kaymak ve buz gibi reaktifler kullanmak | |
| Hücreler kümeler | Trypsinization sırasında hücreler yeterince ayrılmadı | Hücre yıkama sırasında PBS + % 0.04 EDTA kullanın; son yıkamadan önce hücre süspansiyonu 35 μm filtreden geçirin |
| Hücreler özellikle yapışmayan | Belirli bir alandaysa - slayttaki çizikler, PDMS akış hücrelerinin yanlış hizalanması veya DNA'nın desen bölgesi dışına dökülmesinden kaynaklanıyor olabilir | Çizilmeleri önle, PDMS akış hücrelerini desen bölgesine hizalamaya dikkat edin |
| Hücreler her yere yapışıyorsa - yetersiz engelleme veya yıkama | Hücreleri desenledikten sonra daha fazla yıkama ekleyin; yıkamalar sırasında daha güçlü bir şekilde pipet; hücre desenlemesini başlatmadan önce daha uzun süre %1 BSA ile blok; su damlacığı temas açısını ölçerek slaytı silanize etme (isteğe bağlı adım 3) veya silanizasyonun başarılı olduğunu onaylayın | |
| Akış hücresi içinde kabarcıklar oluşur | Pipetleme hataları, plazma oksidasyonu sırasında oluşturulan düzensiz hidrofilik yüzey | Kabarcıklar küçükse, akış hücresinin girişine PBS ekleyin ve yıkanabilirler. Kabarcıklar daha büyükse, PDMS akış hücresine yumuşak basınç uygulayın, kabarcıkları girişe veya çıkışa doğru itin. |
| Hücreler başlangıçta desene yapışır, ancak yıkamalar sırasında, diğer hücre türlerinin desenleri sırasında veya hidrojel öncüsünün eklenmesi sırasında çıkarılır | Pipetlemeden çok kuvvetli bir şekilde kopan kesme kuvvetleri, hücrelerin yüzeyden kopmalarına neden olabilir | Sonraki yıkamalar, hücre deseni turları veya hidrojel öncülleri ekleme sırasında daha nazikçe pipet. Hidrojel öncülleri viskoz olduğundan, desenin yerinden çıkma olasılığı daha yüksektir, bu nedenle ekstra dikkatli olun. Çok katmanlı yapılar en ağır olma eğilimindedir ve yerinden edilmeye daha duyarlıdır. |
| 3D transfer sırasında doku deformasyonları | Hydrogel slayt için yapışır | Temas açısı ölçümlerini kullanarak slaytın hidrofobikliğini onaylayın |
| PDMS'yi her iki kenarda da tam olarak kaldırmak için jilet kullanın, PBS'nin dokunun altında yüzmesini sağlar | ||
| Bu saf kollajen hidrojeller ile olabilir - hidrojel protein konsantrasyonunu veya bileşimini ayarlamayı düşünün | ||
| Hücreler hidrojel ile aktar olmaz ve slaytta kalır | Turbo DNA konsantrasyonunu artırın veya kuluçka süresini artırın | |
| Hidrojel yeterince sağlam değil | Söz konusu hidrojel için kuluçka süresini ve/veya jelleşme mekanizmasını artırın (örneğin kollajen için pH'ın doğru olduğundan emin olun) | |
| PDMS çıkarılırken hydrogel gözyaşları | PDMS akış hücrelerini, deneye başlamadan önce plazma oksidasyonunu kullanarak hidrofilik hale getirin, böylece ortam ekledikten sonra kolayca ayrılırlar. PDMS'yi ayırmak için çok nazikçe tokmak kullanın. |
Tablo 1: Bu protokolden kaynaklanabilecek olası hataları belirlemek ve çözmek için bir sorun giderme kılavuzu. Özellikle, hücrelerin desene zayıf yapıştırılması birçok temel nedene sahip olabilir ve bu kılavuz bu sorunların tanımlanmasına ve çözümüne yardımcı olmalıdır.
Ek dosya 1. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek dosya 2. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek dosya 3. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek dosya 4. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Discussion
Bu yazıda in vitro hücre kültürü deneyleri için hücrelerin 2D ve 3D olarak yüksek çözünürlüklü desenlemeleri için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu yöntemin daha önce yayınlanan sürümlerinden farklı olarak, burada sunulan protokol kullanılabilirliğe odaklanır: son derece özel ekipman gerektirmez ve tüm reaktifler özel sentez gerektirmek yerine satıcılardan satın alınabilir. Diğer hücre mikropatterning yöntemlerinin aksine, bu yöntem hızlı ve hücre tipi agnostiktir: hücre dışı matris proteinlerine spesifik yapışıklık gerektirmez15. CMO-DPAC tarafından desenlenen hücreler Matrigel veya kollajen gibi hücre dışı bir matris içine gömülebilir, bu da ekstrüzyon baskı tabanlı yöntemlerle şu anda mümkün olandan çok daha yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip 3D kültürlerle sonuçlanır22. CMO-DPAC, slayt başına yüzlerce ila binlerce mikroskobik özellik oluşturmak için kullanılabilir ve birçok çoğaltmanın aynı anda gerçekleştirilebilmesini sağlar.
Bu protokolün başarısındaki en önemli parametrelerden biri, desenli slaydın üstündeki akış hücrelerine eklenen hücrelerin yoğunluğudur. İdeal olarak, yoğunluk en az 25 milyon hücre / mL olmalıdır. Akış hücrelerine yüklendiğinde, hücrelerin bu yoğunluğu, desenin üzerindeki hücrelerin neredeyse yakın paketlenmiş bir monolayer ile sonuçlanır(Ek Şekil 2B). Bu yüksek hücre yoğunlukları, bir hücrenin doğrudan bir DNA noktasının üzerine yerleşme ve yapışma olasılığını en üst düzeye çıkarır. Hücre yoğunluğunu azaltmak genel desen verimliliğini azaltacaktır. Bu protokoldeki bir diğer kritik adım, CMO çözümünü eklemeden önce PBS veya serum içermeyen ortamdaki hücreleri iyice yeniden askıya almaktır. CMO'lar hücre zarlarına çok hızlı bir şekilde bölünr ve CMO çözeltisini doğrudan bir hücre peletine eklemek hücrelerin heterojen olarak etiketlenmesine neden olur. CMO çözeltisini hücre süspansiyonu ekledikten sonra, hücrelerin CMO'larla eşit şekilde etiketlenebilmesi için pipetleme ile iyice karıştırılması önemlidir. Kuluçkalardan sonra, fazla CMO'ları çoklu santrifüjleme ve yıkama adımlarıyla iyice yıkamak gerekir. Hücre süspansiyonunda bulunan aşırı serbest CMO, cam slayttaki desenli amin modifiye DNA'ya bağlanarak, süspansiyondaki CMO modifiye hücrelerin hibridizasyonunu ve yapıştırılmasını engeller. Zaman da bu protokol için önemli bir husustur. CMO'ları kullanırken mümkün olduğunca hızlı çalışmak ve CMO'ların içselleştirilmesini en aza indirmek ve hücre canlılığını en üst düzeye çıkarmak için hücreleri buzda tutmak önemlidir. Akış sitometrisi deneyleri, CMO'ların hücre yüzeyinde LMO'lar kadar uzun süre devam etmediğini ve buz üzerinde iki saatlik inkübasyonda% 25 CMO komplekslerinin kaybıile 36. Ayrıca, hücre taşıma süresi arttıkça hücrelerin canlılığı azalacaktır. Hızlı bir şekilde çalışarak, hücreleri buzda tutarak, buz gibi reaktifler kullanarak ve bazı besinleri sağlamak için serumsuz ortam kullanılarak canlılık en üst düzeye çıkarılabilir.
CMO-DPAC, hücreleri yüksek hassasiyetle desenlendirerek hücre biyolojisini incelemenin güçlü bir yolu olsa da, sınırlamaları vardır. CMO-DPAC deneyleri, özellikle deneysel karmaşıklık birden fazla hücre türü, katman veya 3B hücre kültürü ile eklenmiş olarak zor olabilir (Ek Dosya 1). Deneysel hatalar, Tablo 1'de açıklandığı gibi, bu iletişim kuralını başlatırken yaygın olabilir. Bu nedenle, denemenin başarılı olduğundan emin olmak ve daha fazla optimizasyon gerektirebilecek adımları belirlemek için kullanıcıların kalite kontrol kontrollerini (slaytta DNA'nın bulunduğunu doğrulayarak, hücrelerin DNA ile yeterince etiketlendiğini doğrulayarak (Adım 8), fazla hücrelerin iyice yıkandığını onaylamalarını vb.) öneririz. Bu yazıda ve ek dosyalarında verilen bilgilerin gerekli sorun gidermeyi kolaylaştıracağını umuyoruz.
Kolesterol, içselleştirmesi hücre metabolizması, gen ekspresyasyonu ve membran akışkanlığını etkileyebilecek biyoaktif bir moleküldür37,38. Daha önceki bir çalışmada, tek hücreli RNA dizilimi kullanılarak CMO ve LMO etiketli hücrelerin gen ekspresyözü üzerindeki etkileri karşılaştırıldı. CMO etiketli HEK hücreleri, etiketlenmemiş ve LMO etiketli hücrelere kıyasla gen ekspresyonlarınıdeğiştirmiştir 36. CMO'larla hücrelerin etiketlenmesi, kolesterol ve sphingolipid transport (GeneCards) ile bağlantılı olan AP2B1 ve kolesterol birikimini düzenleyen uzun bir kodlamayan RNA olan MALAT1 dahil olmak üzere etiketlenmemiş kontrollere göre sekiz genin diferansiyel ekspresyosu (> 1,5 kat) ile sonuçlandı39. Küçük olsa da, söz konusu deney metabolizma, membran dinamikleri veya hücrelerdeki diğer kolesterol ilişkili yolları inceliyorsa, bu transkripsiyonel yanıtlar yine de endişe verici olabilir.
Bu protokol esnektir ve her denemenin gereksinimlerini karşılayacak şekilde ayarlanabilir. CMO herhangi bir spesifik reseptör kullanmak yerine lipid zarına kendini yerleştirdiğinden, yöntem hücre tipi agnostiktir (HUVEC'ler, MCF10As, HEK'ler ve MDCK'ler burada gösterilmiştir). Kolesterol, daha önce yayınlanan LMO'larımızdan farklı bir hidrofobik çapa olmasına rağmen, şimdiye kadar benzer şekilde davrandıklarını gördük. Bu nedenle, CMO'ların daha önce LMO'larla yayınladığımız nöral kök hücreler, fibroblastlar, periferik kan mononükleer hücreleri, tümör hücreleri ve primer meme epitel hücreleri6, 23 , 27,29,36dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çok çeşitli hücre türleriyle çalışmasını bekleriz. . CMO etiketlemeSI TLR9'u uyarmaz, bu da protokolün bağışıklık hücreleriyle uyumlu olduğunu gösterir. CMO'nun membran insksiyonu, toplam hücre boyutu ve hücre glikokaloksis35'tekinegatif yük derecesi bir işlevdir. Bu nedenle, hızlı optimizasyona uygun membran kuruluş kapsamını test etmek için bir protokol (Adım 8) dahil ettik. Her hücre deseninin özel özellikleri kaçınılmaz olarak deneysel tasarıma göre değişecektir (daha fazla rehberlik için Ek Dosya 1'e bakın). DNA'yı desenleme için yukarıda açıklanan fotopatterning protokolü önerilse de, yüksek çözünürlüklü damlacık yazıcılarının kullanımı gibi amin-DNA çözeltisinin damlacıklarını mekansal olarak hapsetme yöntemi işe yaramalıdır. Desen çözünürlüğü ve minimum özellik aralığı kullanılan yönteme göre değişir. Ayrıca, bu protokolün DNA fotopatterning bölümlerini, hücreleri DNA ile etiketlemek için kullanılan diğer yöntemlerle birleştirmek de mümkündür, örneğin membran ekspresyonlu çinko parmaklara melezlenmiş DNAile 40, NHS tarafından eşleştirilmiş DNA41kullanılarak ve hücre yüzeyindeki azido siyalik asit kalıntılarını fosfin konjuge DNA42 ile reaksiyona sokarak . CMO-DPAC, hücre çiftleri arasındaki etkileşimlerin incelenmesi, sinyallerin "gönderen" hücrelerden "alıcı" hücrelere aktarılmasına bakan ortak kültür deneyleri ve yakındaki hücre dışı ipuçlarının kök hücre farklılaşması üzerindeki etkisinin araştırılması da dahil olmak üzere hücre-hücre aralıkları üzerinde sıkı kontrol gerektiren çeşitli deneylere uygulanabilir6,29 . Yöntem ayrıca üç boyutlu hücre göçlerini incelemek için kullanılabilecek mikrotissular oluşturmak için de kullanılabilir, hücrelerin dokular halinde kendi kendine düzenlenmesi23,27ve hücreler ile ECM27arasındaki dinamik etkileşim . Bu protokolün araştırmacılara kendi laboratuvarlarında yüksek çözünürlüklü DNA tabanlı hücre desenlemenin yeni uygulamalarını keşfetmek için erişilebilir bir platform sunacağını umuyoruz.
Disclosures
Z.J.G. Provenance Biosciences'da danışman ve özkaynak sahibidir.
Acknowledgments
Yazarlar, bu protokolü test ettiği için Jeremy Garcia'ya ve UCSF Biyomedikal Mikro ve Nanoteknoloji Çekirdeği'ndeki ekipmanlar hakkında eğitim verdiği için Bhushan Kharbikar'a teşekkür ediyor. Bu araştırma kısmen Savunma Bakanlığı Meme Kanseri Araştırma Programı (W81XWH-10-1-1023 ve W81XWH-13-1-0221), NIH (U01CA199315, DP2 HD080351-01, 1R01CA190843-01, 1R21EB019181-01A ve 1R21CA182375-01A1), NSF (MCB1330864) ve UCSF Hücresel Yapı Merkezi (DBI-1548297), bir NSF Bilim ve Teknoloji Merkezi. O.J.S, NSF Lisansüstü Araştırma Bursu, Siebel bursu ve P.E.O. Bursu ile finanse edildi. Z.J.G ve A.R.A. Chan-Zuckerberg BioHub araştırmacıları.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | Thermo Fisher Scientific | 155379 | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Adapter with External SM1 Threads and Internal SM3 Thread | ThorLabs | SM3A1 | |
| Aldehyde Functionalized Slides | Schott | Nexterion Slide AL | Store under dry conditions after opening. |
| All Plastic Syringes, 1 mL | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
| Amine-Modified DNA Oligo | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
| Aspheric Condenser Lens | ThorLabs | ACL7560 | |
| Borosilicate Disc, 6in Diameter X 1/2in Thick | Chemglass | CG-1906-23 | |
| Cell Culture Dishes 60x15 mm style | Corning | 353002 | |
| Cholesterol-Modified Oligo | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
| Diamond Scribe | Excelta | 475B | |
| DNA Oligonucleotide | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | |
| Isopropyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
| Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
| Methylene Chloride (Stabilized/Certified ACS) | Fisher Scientific | D37-4 | |
| MF-321 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | |
| Microposit S1813 Positive Photoresist | Kayaku Advanced Materials | n/a | |
| Ø3" Adjustable Lens Tube, 0.81" Travel | ThorLabs | SM3V10 | |
| Oven | Thermo Scientific | 51-028-112H | |
| PE-50 Compact Benchtop Plasma Cleaning System | Plasma Etch | PE-50 | |
| Photomask (custom) | CAD/Art Services | n/a | Minimum feature size guaranteed by CAD/Art Services is 10 microns. |
| Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RCT Basic Hot Plate | IKA | 3810001 | |
| Silicon Wafer (100 mm) | University Wafer | 590 | |
| Sodium Borohydride, 98%, granules | Acros Organics | 419471000 | |
| Spin Coater Kit | Instras | SCK-200 | This is a low cost option, but any spin coater that can maintain a speed of 3000 rpm will suffice. |
| SU-8 2075 | Microchem | Y111074 0500L1GL | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 4000L1PE | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 2646340 | |
| Syringe Needles | Sigma-Aldrich | Z192341 | |
| T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current | ThorLabs | LEDD1B | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl dimethylchlorosilane | Gelest | SIT8170.0 | |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 90335 | |
| Turbo DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
| Tweezers Style N7 | VWR | 100488-324 | The curved shape of these tweezers is essential for delicately picking up the PDMS flow cells containing patterned tissues. |
| UV LED (365 nm, 190 mW (Min) Mounted LED, 700 mA) | ThorLabs | M365L2 | |
| Wafer Tweezers | Agar Scientific | T5063 | |
| WHEATON Dry-Seal vacuum desiccator | Millipore Sigma | W365885 |
References
- Kreeger, P. K., Strong, L. E., Masters, K. S. Engineering approaches to study cellular decision-making. Annual Review of Biomedical Engineering. , 49-72 (2018).
- Goubko, C. a, Cao, X. Patterning multiple cell types in co-cultures: A review. Materials Science and Engineering C. 29 (6), 1855 (2009).
- Sun, W., et al.
- Liu, W. F., Chen, C. S. Cellular and multicellular form and function. Advanced Drug Delivery Reviews. 59 (13), 1319-1328 (2007).
- Duffy, R. M., Sun, Y., Feinberg, A. W. Understanding the role of ECM protein composition and geometric micropatterning for engineering human skeletal muscle. Annals of Biomedical Engineering. 44 (6), 2076-2089 (2016).
- Chen, S., et al. Interrogating cellular fate decisions with high-throughput arrays of multiplexed cellular communities. Nature Communications. 7, 10309 (2016).
- Shaya, O., et al. Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning. Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).
- Rao, N., et al. A co-culture device with a tunable stiffness to understand combinatorial cell-cell and cell-matrix interactions. Integrative Biology. 5 (11), 1344 (2013).
- Sriraghavan, V., Desai, R. A., Kwon, Y., Mrksich, M., Chen, C. S. Micropatterned dynamically adhesive substrates for cell migration. Langmuir. 26 (22), 17733-17738 (2010).
- Wong, L., Pegan, J. D., Gabela-Zuniga, B., Khine, M., McCloskey, K. E. Leaf-inspired microcontact printing vascular patterns. Biofabrication. 9 (2), 021001 (2017).
- Chen, T. H., et al. Directing tissue morphogenesis via self-assembly of vascular mesenchymal cells. Biomaterials. 33 (35), 9019-9026 (2012).
- Laurent, J., et al. Convergence of microengineering and cellular self-organization towards functional tissue manufacturing. Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 939-956 (2017).
- Lin, C., Khetani, S. R. Micropatterned co-cultures of human hepatocytes and stromal cells for the assessment of drug clearance and drug-drug interactions. Current Protocols in Toxicology. 2017, 1-23 (2017).
- Hui, E. E., Bhatia, S. N.
- D'Arcangelo, E., McGuigan, A. P. Micropatterning strategies to engineer controlled cell and tissue architecture in vitro. BioTechniques. 58 (1), 13-23 (2015).
- Martinez-Rivas, A., González-Quijano, G. K., Proa-Coronado, S., Séverac, C., Dague, E. Methods of micropatterning and manipulation of cells for biomedical applications. Micromachines. 8 (12), (2017).
- Lee, S., et al. Simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils. Journal of Visualized Experiments. (158), e60888 (2020).
- Strale, P. O., et al. Multiprotein printing by light-induced molecular adsorption. Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).
- Melero, C., et al. Light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins. Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).
- Reid, J. A., Mollica, P. M., Bruno, R. D., Sachs, P. C. Consistent and reproducible cultures of large-scale 3D mammary epithelial structures using an accessible bioprinting platform. Breast Cancer Research. , 1-13 (2018).
- Wang, Z., Lee, S. J., Cheng, H. -J., Yoo, J. J., Atala, A. 3D bioprinted functional and contractile cardiac tissue constructs. Acta Biomaterialia. 70, 48-56 (2018).
- Miri, A. K., et al. Effective bioprinting resolution in tissue model fabrication. Lab on a Chip. 19 (11), 2019-2037 (2019).
- Todhunter, M. E., et al.
- Todhunter, M. E., Weber, R. J., Farlow, J., Jee, N. Y., Gartner, Z. J. Fabrication of 3D microtissue arrays by DNA programmed assembly of cells. Current Protocols in Chemical Biology. 8 (3), 147-178 (2016).
- Csizmar, C. M., Petersburg, J. R., Wagner, C. R. Programming cell-cell interactions through non-genetic membrane engineering. Cell Chemical Biology. 25 (8), 931-940 (2018).
- Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly. Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).
- Hughes, A. J., et al. Engineered tissue folding by mechanical compaction of the mesenchyme. Developmental Cell. 44 (2), 165-178 (2018).
- Weber, R. J., et al. Rapid organoid reconstitution by chemical micromolding. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (11), 1851-1855 (2016).
- Scheideler, O. J., et al. Recapitulating complex biological signaling environments using a multiplexed, DNA-patterning approach. Science Advances. 6 (12), (2020).
- Viola, J. M., et al. Guiding cell network assembly using shape-morphing hydrogels. Advanced materials (Deerfield Beach, Fla.). , 2002195 (2020).
- Mohammad, A., Davis, M., Aprelev, A., Ferrone, F. A. Note: Professional grade microfluidics fabricated simply. Review of Scientific Instruments. 87 (10), 1-4 (2016).
- Lee, O. J., Chuah, H. S., Umar, R., Chen, S. K., Yusra, A. F. I. Construction of cost effective homebuilt spin coater for coating amylose-amylopectin thin films. Journal of Fundamental and Applied Sciences. 9 (2), 279 (2018).
- Webb, K., Hlady, V., Tresco, P. A. Relative importance of surface wettability and charged functional groups on NIH 3T3 fibroblast attachment, spreading, and cytoskeletal organization. Journal of Biomedical Materials Research. 41 (3), 422-430 (1998).
- Processing Guidelines for: SU-8 2025, SU-8 2035, SU-8 2050, SU-8 2075. Microchem SU-8 2000 Permanent Expoxy Negative Photoresist. , Available from: https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2019/09/SU-82000DataSheet2025thru2075Ver4.pdf 1-5 (2019).
- Palte, M. J., Raines, R. T. Interaction of nucleic acids with the glycocalyx. Journal of the American Chemical Society. 134 (14), 6218-6223 (2012).
- McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 16 (7), 619-626 (2019).
- Maxfield, F. R., van Meer, G. Cholesterol, the central lipid of mammalian cells. Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 422-429 (2010).
- Luo, J., Yang, H., Song, B. L. Mechanisms and regulation of cholesterol homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (4), 225-245 (2020).
- Liu, L., Tan, L., Yao, J., Yang, L. Long non-coding RNA MALAT1 regulates cholesterol accumulation in ox-LDL-induced macrophages via the microRNA-17-5p/ABCA1 axis. Molecular Medicine Reports. 21 (4), 1761-1770 (2020).
- Mali, P., Aach, J., Lee, J. H., Levner, D., Nip, L., Church, G. M. Barcoding cells using cell-surface programmable DNA-binding domains. Nature Methods. 10 (5), 403-406 (2013).
- Hsiao, S. C., et al. Direct cell surface modification with DNA for the capture of primary cells and the investigation of myotube formation on defined patterns. Langmuir. 25 (12), 6985-6991 (2009).
- Gartner, Z. J., Bertozzi, C. R. Programmed assembly of 3-dimensional microtissues with defined cellular conductivity. Proceedings of the National Academy of Sciences. (17), 1-5 (2009).
