Summary
Burada, hastalarda fonksiyonel olarak bir Ommaya rezervuarı andıran bir murine ksinograft modelini tarif ediyoruz. Murine Ommaya'yı evrensel olarak ölümcül leptomeningeal hastalık için yeni terapötikleri incelemek için geliştirdik.
Abstract
Leptomeningeal hastalık (LMD), serebral omurilik sıvısına (CSF) nadir görülen bir merkezi sinir sistemi (CNS) metastazı türüdür. LMD'ye neden olan en yaygın kanserler meme ve akciğer kanserleri ve melanomdur. LMD tanısı alan hastaların prognozu çok zayıftır ve genellikle sadece birkaç hafta veya ay hayatta kalırlar. LMD'ye karşı sistemik tedavinin etkinliğinin olmamasının olası bir nedeni, koroid pleksus boyunca bozulmamış ve nispeten geçirimsiz bir kan-beyin bariyeri (BBB) veya kan-CSF bariyeri nedeniyle CSF'de terapötik olarak etkili ilaç konsantrasyonlarının elde edilememesidir. Bu nedenle, ilaçların intratekal veya intraventriküler olarak doğrudan uygulanması bu engelleri aşabilir. Bu grup, terapötiklerin (yani ilaçlar, antikorlar ve hücresel tedaviler) kronik olarak etkili bir şekilde verilmesini ve CSF'deki ilaç konsantrasyonlarını ve hedef modülasyonu belirlemek için (farelerde tümör mikroçevrasyonu hedeflendiğinde) CSF'nin tekrarlanan örneklemesine izin veren bir model geliştirmiştir. Model, klinik olarak kullanılan manyetik rezonans görüntüleme uyumlu Ommaya rezervuarının murine eşdeğeridir. Kafatasına yapıştırılmış olan bu model "Murine Ommaya" olarak belirlenmiştir. Kavram terapötik bir kanıt olarak, insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 antikor (klon 7.16.4), insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2-pozitif meme kanserinden LMD'li fareleri tedavi etmek için Murine Ommaya aracılığıyla CSF'ye teslim edildi. Murine Ommaya, minyatür bir erişim portu kullanarak ilaç teslimatının verimliliğini arttırır ve fazla ilacın yanlış kullanımını önler; moleküler ve immünolojik çalışmalar için CSF örneklemesi ile müdahale etmez. Murine Ommaya, LMD'nin deneysel modellerinde yeni terapötikleri test etmek için yararlıdır.
Introduction
Leptomeningeal hastalık (LMD), tümör hücrelerinin CSF'ye erişip beyin ve omurilik yüzeyine sızdığı CNS'nin agresif bir geç evre metastazıdır1. LMD'ye neden olan en yaygın kanserler meme ve akciğerin yanı sıra melanom2. LMD, baş ağrısı, kraniyal sinir felci, sert boyun ve radyülopatiler gibi bir dizi nörolojik semptom ve belirti ile sonuçlanır. LMD'li hastalar için prognoz genellikle çok zayıftır (ortalama sağkalım haftalar içinde ölçülür) ve evrensel olarak ölümcüldür3, 4,5,6,7. Cerrahi, radyasyon ve sistemik kemoterapi ile tedavi palyatiftir. LMD için sistemik tedavi, koroid pleksus1boyunca sağlam bir BBB veya kan-CSF bariyeri boyunca CSF'ye yetersiz ilaç penetrasyonu nedeniyle başarısız olabilir.
Bu nedenle, kanser terapötiklerinin (örneğin, kontrol noktası inhibitörleri ve hücresel tedaviler de dahil olmak üzere ilaçlar ve antikor bazlı tedaviler) doğrudan CSF'ye uygulanması bu sınırlamayı aşabilir8. Hastalardan CSF'ye erişmek ve örneklemek, kafa derisinin altına yerleştirilen bir Ommaya rezervuarı aracılığıyla mümkündür. Bu cihaz, kanser ajanlarının (örneğin metotreksat ve trastuzumab) yanı sıra tanı çalışmaları için CSF örneklemesi (örneğin, LMD'nin sitolojik tanısı tedaviye yanıtları izlemek için) spinal tap yapmadan verilmesine izin verir. Klinik olarak kullanılanları taklit etmek için bir murine Ommaya rezervuarı tasarlanmıştır. Rezervuar, erişen bir bağlantı noktası ve ara parçanın montajını ve cihazın ilaç çalışması süresince kalıcı olarak bozulmadan kalmasını sağlayan fare cannülasyon tekniğinin değiştirilmesini gerektirir. Bu cihaz "Murine Ommaya" olarak belirlenmiştir.
Sık enjeksiyonlar9üzerinde borudaki boş alanı önceden doldurmak için fazla sıvı hacimlerinin hazırlanmasını ve sürekli infüzyon gerektiren ozmotik infüzyon pompası tekniğinin aksine, Murine Ommaya ilaç çözeltilerinin wastage'ını en aza indirir. Hamilton şırınd, minyatür erişim portsu ve otomatik enjektör kullanarak CSF'ye küçük miktarlarda (3-7 μL) herhangi bir zamanda birden fazla tek doz tedavinin etkili bir şekilde kullanılmasına izin verir. Gerçek zamanlı olarak, LMD'ye karşı test ilaçlarının etkinliği görüntüleme ile belirlenebilir. Bu yaklaşım kullanılarak, in vivo bulguları hastalar için rasyonel tedavi stratejilerine çevirmek için LMD'ye karşı çeşitli kemoterapiler, antikorlar ve hücre immünoterapileri (tek veya kombine ajanlar olarak) test edilebilir. LMD'nin hasta kaynaklı bir ksinograft (PDX) modelinin görüntüleme kapasitesini daha da geliştirmek için, Murine Ommaya'nın montaj gerektirmeyen ve kullanıma hazır manyetik rezonans görüntüleme (MRI) uyumlu bir versiyonunu geliştirmek için bir üretici ile işbirliği yapıldı. MRI yeteneği, özellikle CSF'den dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC) miktarının bazen sınırlayıcı faktör olduğu PDX modelleri için ve genellikle CCC'leri önceden etiketlemenin mümkün olmadığı durumlarda faydalıdır.
Bu makalede, fareleri LMD ile işlemek için CTC'lerin enjeksiyonu ile başlayan ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Murine Ommaya daha sonra cerrahi olarak implante edilir ve Murine Ommaya aracılığıyla birden fazla ilaç tedavisi adımı atılmıştır. Gösteri için bir kavram kanıtı olarak, klon 7.16.4 (trastuzumab'ın insan eşdeğeri) adı verilen murine insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (Her2) antikorunun10. Antikor, Her2+ meme kanseri hücrelerini Murine Ommaya (doğrudan hedefli veya intratekal tedavi) veya intraperitoneal enjeksiyon (sistemik tedavi) yoluyla hedefler. Sonuçlar, doğrudan intratekal immünoterapi alan LMD'li farelerin sistemsel olarak aynı tedavi ile tedavi edilenlerden önemli ölçüde daha uzun yaşadığını göstermiştir. Murine Ommaya yoluyla tedavi edilen farelerdeki CNS metastazları, tedavinin üçüncü haftasının üçüncü dozu ile neredeyse tamamen geriledi ve bu da genel sağkalımda iyileşmeye neden oldu.
Protocol
Protokol, Güney Florida Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IS00005974) tarafından onaylandı.
1. Fare LMD modeli oluşturmak için CSF'ye CTC enjeksiyonu
- CTC'lerin hazırlanması
- Enjeksiyon için gereken CTC sayısını hesaplayın ve steril fosfat tamponlu salinde (PBS) 1,0 ×10 4 hücre/μL'de tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın. Hücre süspansiyonu işlem boyunca buza veya 4 °C'ye yerleştirin.
NOT: Trypsinizasyon gerektiren hücre hatları kullanırken, tripsin çıkarmak için hücreleri steril PBS ile iki kez yıkadığınızdan emin olun. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre sayımı gerçekleştirin. Büyük bir kohort (>50 fare) kullanılırsa, fare başına tutarlı sayıda hücre uygulandığından emin olmak için hücreleri yeniden anlatın ve enjeksiyonlar arasındaki hücre canlılığını doğrulayın.
- Enjeksiyon için gereken CTC sayısını hesaplayın ve steril fosfat tamponlu salinde (PBS) 1,0 ×10 4 hücre/μL'de tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın. Hücre süspansiyonu işlem boyunca buza veya 4 °C'ye yerleştirin.
- Presurgical prosedür
- Fareyi deri altından 1 mg/kg buprenorfin sürekli salınımı (Bup-SR) ile enjekte edin.
NOT: Önerilen kesi alanını enjekte etmeyin; kürek kemiğinden çok uzakta bir enjeksiyon bölgesi seçin. - Fareyi% 2-3 izofluran ile uyuşturun, ta ki sağ refleks belirtisi göstermeyene kadar. Ek olarak, anestezi durumunu doğrulamak için kuyruk ve / veya pençe sıkışma refleksini kontrol edin.
- Fareyi ameliyat bölgesinden uzak bir yerde ameliyata hazırlayın. Cerrahi bölgeyi (yani kafatasının dorsal yüzeyini) kürkün kesi bölgesini kirletmesini önlemek için yeterli sınır alanı ile kırpın; daha sonra, sitenin merkezinden çevresine kadar çalışarak bölgeyi mikrop öldürücü cilt antiseptiği ile doyutun ve ardından kurumaya bırakın. Cerrahi bölgeyi kontaminasyondan korumak için steril bir örtü veya steril yapışkan destekli plastik bir örtü malzemesi uygulayın.
NOT: Aletler önceden otoklavlanacak ve ipuçları cam boncuk sterilizatörü kullanılarak hayvanlar arasında yeniden sterilize edilecektir. - Başın tüm ventral yüzeyinin kürkünü tıraş edin ve cildi steril teknik kullanarak hazırlayın.
- Stereotaktik aparatın modifiye edilmiş L şeklindeki burun konisi ile burnu oturtarak narların açık ve net kalmasını sağlayın. Her iki pinnae'nin ventral yüzeylerinde bant kullanarak, cildi burun konisine sabitlemek için hafifçe öne çekin ve boynu sabitledikten sonra yaklaşık 90 ° açıyla bükün. Anesteziyi korumak için% 1.5 izofluran uygulamak.
NOT: Uygun konumlandırma, kesi bölgesinin oksipital kemiğin kaudal sırtının kolayca tanımlanmasını sağlayacak şekilde sunulmasına neden olacaktır. - Omurganın sarnıç magnası ile düz tutulmasını sağlamak için vücudu konumlandırın ve kuyruğa hafif çekiş uygularken, sabitlemek için kuyruk tabanına bant yerleştirin.
- Fareyi deri altından 1 mg/kg buprenorfin sürekli salınımı (Bup-SR) ile enjekte edin.
- Cerrahi sarnıç magna enjeksiyonu
- Boyun tam uzatmalı ve pinnae'nin hemen arasından başlayarak, cerrahi makas uçlarını oksipital kemik boyunca hafif bir basınçla aşağı doğru çalıştırın.
NOT: Bu orta çizgi konumundayken, makas uçları sarnıç magnası üzerindeki içbükey bölgeye daldığında küçük bir çöküntü göze çarpar. - Palpatlanmış konsavitenin hemen üzerinde 3-5 mm'lik küçük bir orta hat kesiği yapın. 30 G Hamilton şırındına 1,0 ×10 4 hücre/μL'de (toplam 5,0 × 10 4 hücre)5 μL hücre süspansiyonu çekin.
- Sarnıç magnasına hafifçe bastırmak için 1-2 mm uçlu künt uçlu tokmaklar kullanın. Uçları kapalı bir konumda tanıtın ve dura üzerinde aşağı doğru basınç uygularken açın.
- Dural zar kolayca tespit edilene ve ilişkili kan damarları maruz kalan bölgede görünene kadar önceki adımda açıklanan künt diseksiyonu tekrarlayın.
NOT: Elde edilen enjeksiyon penceresi, iğne yerleştirilmesi sırasında kan damarlarının hasarsız kalmasını sağlar. - Çevredeki kasları geri çekmek için forsepsleri açık tutarken, eğimi görselleştirmek için duranın altına 30 G'lik bir koring olmayan iğne sokun. İğnenin sadece eğimin hemen ötesinde tanıtıldığından emin olun. Yavaşça bir şırınna pistonu dağıtın ve dura'nın hemen altındaki hücreleri teslim edin.
- Dura'nın altındaki enjeksiyonu gözlemlemek için eğimi düzgün bir şekilde yerleştirin. Tekniği dikkatlice uygulayın ve zarın zarar görmesini önlemek ve minimum sızıntı sağlamak için 30 G koringsiz iğneyi kullanın. Sızıntıya dikkat edilirse, pamuk uçlu bir aplikatörle hafif basınç uygulayın.
- Bir yara klipsi veya cilt yapıştırıcısının mikro damlasını uygulayarak cildi kapatın. Enjeksiyon başarıyla yapıldıktan sonra, farelerin sıcak bir battaniye üzerinde anesteziden kurtulmasına izin verin, sternal pozisyonu koruyana ve amaca yönelik hareket gösterene kadar onları sürekli olarak gözlemleyebilir.
- İlk hafta ameliyattan sonra fareleri günlük olarak izleyin. Bir fare ağrı veya sıkıntı içinde görünüyorsa, veteriner konsültasyonuna ve direktifine dayanarak 5 güne kadar her 12 ila 24 saat boyunca 10 mg / kg deri altı karprofen enjeksiyonu ile tedavi edin. Farelerin bir sonraki adıma geçmeden önce en az 48 ila 72 saat boyunca iyileşmesine ve izlenmesine izin verin.
NOT: Önceden verilen Bup-SR, 72 saate kadar dayanır, bu nedenle ek analjezikler normalde gerekli değildir. Bununla birlikte, hayvanlara gerektiğinde ek analjezik sağlanacaktır (uyuşuksa, yemek yemezse, fırfırlıysa). Cerrahi bir bölge ameliyat sonrası enfeksiyon belirtileri geliştirirse (örneğin kızarıklık, şişlik, hassasiyet, allodynia, hiperaljezi, hiperpati veya takviye) veya fare etkilenen bölgeyi koruyorsa, fareyi ötenazi edin. Kanser hücreleri CSF'ye başarıyla enjekte edilirse, LMD ve tümör ilerlemesi CNS'de 1 veya 2 hafta içinde gelişecektir (kullanılan CTC türlerine veya hücre hattına bağlı olarak) (Şekil 1).
- Boyun tam uzatmalı ve pinnae'nin hemen arasından başlayarak, cerrahi makas uçlarını oksipital kemik boyunca hafif bir basınçla aşağı doğru çalıştırın.
2. Murine Ommaya montajı ve implantasyonu
- İstasyonun hazırlanması
- İstasyon yüzeyini dezenfekte edin. Yüzeyin üzerine mavi bir kaplama yerleştirin ve Şekil 2'debelirtilen tüm sterilize edilmiş alet ve malzemeleri hazır tutun.
- Presurgical prosedür
- Analjezi (Bup-SR) uygulayın ve bölüm 1.2'de açıklandığı gibi steril tekniği koruyun.
- Murine Ommaya'nın cerrahi implantasyonu
- Murine Ommaya enjeksiyon cihazını 25 G (0,51 mm dış çap) minyatür enjeksiyon portu ve 1 mm ara disk kullanarak monte edin. Metal kanonun yaklaşık 2,5 mm'lik kısmının sağ serebral yarımküreye nüfuz etmesini sağlamak için siyanoakrilat steril yapıştırıcı kullanın (Şekil 3A-C).
NOT: Bu laboratuvarda, her iki parçaya da (minyatür enjeksiyon portu ve ara parça) 3D ile tek bir ünite olarak basılmış MR uyumlu bir Fare Ommaya prototipi geliştirilmiştir(Şekil 3D). Tek birimli versiyon MRI ile test edildi ve montaj adımını ortadan kaldırarak zamandan tasarruf edebilir. - Sağ refleks belirtisi olmayana kadar fareyi% 2-3 izofluran ile uyuşturun. Ayrıca, anestezi durumunu doğrulamak için kuyruk ve / veya pençe sıkışma refleksini kontrol edin.
- Kürk başının tüm ventral yüzeyini tıraş edin ve cildi daha önce adım 1.2.3'te açıklandığı gibi steril tekniğe göre hazırlayın. İşlem sırasında izoflurane işlemine devam etmek için fareyi burun konisi ile stereotaktik aparatlara yerleştirin; izofluranları % 1,5'e düşürün. Başı sabitlemek için kulak çubuklarını hafifçe sıkın ve farenin gözlerini kapatmak için göz yağı uygulayın.
- Kafatasını ortaya çıkarmak için alttaki deri altı dokularının künt diseksiyonunu (3 mm) yapın. Kafatasını hidrojen peroksitle ıslatılmış pamuk uçlu aplikatör çubukları kullanarak kurutun.
- Kafatasında bir çapak deliği açın 0,5 mm posterior ve 1,1 mm yanal bregma-kafatasındaki anatomik noktanın koroner dikişinin sagittal dikiş tarafından dik olarak kesiştiği nokta (Şekil 3A)- ve dura mater'i ortaya çıkarmak için 0,9 mm'lik bir çapak deliği açın. Mikrodril kenara hareket ettirin ve bir siyanoakrilat steril yapıştırıcı kullanarak kafatasına yapıştırılmış bir enjeksiyon portu (yaklaşık 2,5 mm derinlik) yerleştirmeden önce çapak deliğini çevreleyen kemiği hafifçe puanlayın. Kesilen bir dikiş deseninde veya çanta dizesi dikişinde 4-0 emici olmayan naylon dikiş kullanarak enjeksiyon noktasının etrafındaki devlet dikişi11.
- Ameliyat sonrası fareleri ameliyat sonrası iyileşme için bireysel kafeslerde barındırır.
NOT: Murine Ommaya'nın, ameliyatla iyileşen birden fazla fare aynı kafeste barındırıldığında, muhtemelen sürekli kurcalama etkileşimleri nedeniyle çıkması mümkündür. Murine Ommaya implante farelerin, ilaç etkinliği denemesi sırasında ayrı ayrı (veya kafes başına en fazla 2 fare) barındırılmaları önerilir.
- Murine Ommaya enjeksiyon cihazını 25 G (0,51 mm dış çap) minyatür enjeksiyon portu ve 1 mm ara disk kullanarak monte edin. Metal kanonun yaklaşık 2,5 mm'lik kısmının sağ serebral yarımküreye nüfuz etmesini sağlamak için siyanoakrilat steril yapıştırıcı kullanın (Şekil 3A-C).
3. Murine Ommaya tedavisi
- Murine Ommaya kullanarak fareleri dosing
- Sağ refleks belirtileri olmayana kadar fareyi% 2-3 izofluran ile uyuşturun. Ayrıca, anestezinin bakımını onaylamak için kuyruk ve / veya pençe sıkışma refleksini kontrol edin.
- Bir bağlantı noktası enjeksiyon adaptörü ve bir Hamilton şırınnası kullanarak Murine Ommaya'ya erişin. Tostiyarı kullanarak minyatür enjeksiyon portunun üst kısmını tutun ve port enjektör adaptörünü yavaşça limanın septumuna tam olarak yerleştirin.
NOT: Port enjektörü, bağlantı noktasının septumını ölü alanı minimuma indirecek şekilde delip motorlu şırıngar pompası ile kontrollü enjeksiyona izin verir (Şekil 4A). Hedefe yönelik/yeni tedaviler anestezi altındayken 1 μL/dk akış hızında enjekte edilir. Tedavi, araştırmacının takdirine göre belirli bir süre (haftalar/aylar) boyunca belirli aralıklarla (günlük/haftalık) verilecektir.
3 ila 7 μL arasındaki bir hacim en uygun olanıdır, çünkü 3 μL'< bir hacim güvenilmezdir ve 7 μL'> bir hacim çok fazla basınca neden olabilir. Hamilton şırındının büyüklüğü, her tedavi kolundaki fare sayısına bağlı olarak 10 ila 100 μL arasında değişebilir. Uygun hacmi Hamilton şırındına önceden yüklemek, şırınnanın tekrar tekrar değiştirilmesini önleyecek ve böylece hataları en aza indirecektir. Tedavi kolu başına 1 Hamilton şırındıcı ayırmak en iyisidir. - Enjeksiyon yapıldıktan sonra, Murine Ommaya'yı toparlama kullanarak port enjeksiyon adaptöründen ayırın ve yukarıda 1.3.7 adımında açıklandığı gibi anesteziden kurtulmak için fareyi kafese geri döndürün.
- Ötanazi
- Sıkıştırılmış bir tank kaynağından karbondioksit (CO2)soluyarak fareleri ötenazi edin. Rahatsızlık veya sıkıntıyı önlemek veya en aza indirmek için fareleri artan CO2 konsantrasyonlarına maruz bırakmak (yani, oda hacminin / dk'nın% 10'undan% 30'una kadar bir yer değiştirme oranı kullanılacaktır). Kardiyovasküler ve solunum hareketlerinin durmasının güvencesine kadar fareleri izleyin.
Representative Results
Farelerde, toplam CSF hacmi yaklaşık 35-40 μL'dir ve yaklaşık 350 nL / dk oranında üretilir; günde 12-13 kez döner12. Enjeksiyonun rotasını görselleştirmek amacıyla, Murine Ommaya modeli aracılığıyla% 2 Evans Blue enjekte edildi, ardından analiz için beyinleri hasat etmeden önce 15 dakika ve 30 dakika geçmesine izin verildi. Boya 15 dakika içinde ventriküllere ve beyne başarıyla sızdı. 30 dakika içinde boya omurilikte görünür hale geldi (Şekil 4).
Kavram kanıtı olarak, BALB/c farelerine luciferaz etiketli Her2+ TUBO meme kanseri hücre hattı intraisternally enjekte edildi ve Murine Ommayas implante edildi. Kanser hücrelerinin enjeksiyonundan yaklaşık 1 hafta sonra, fareler LMD geliştirmeye başladı. Bu fareler, intraperitoneal enjeksiyon yoluyla sistemik tedavi yoluyla veya Murine Ommaya(Şekil 5A)aracılığıyla intratekal olarak Her2-antikor immünoterapisi ile haftada bir kez 4 haftaya kadar tedavi edildi.
Tedavi edilmeyen fareler 19. güne kadar ölmüş olsa da, Murine Ommaya aracılığıyla intratekal tedavi alan tüm fareler hayatta kaldı(P = 0.004). 4. haftaya gelindiğinde tümörlerde tam bir gerileme gözlendi. LMD tedavisinde orta derecede başarı gösteren sistemik tedavi ile tedavi edilen farelere kıyasla, intratekal tedavi alan fareler çok daha uzun bir genel sağkalıma sahipti (Şekil 5B).
Şekil 1: Leptomeningeal hastalığı ve merkezi sinir sistemi metastazlarını incelemek için dolaşımdaki tümör hücrelerinin bir murine ksinograft modelinde sarnıç magnasına enjekte edilir. (A) CPC'lerin Hamilton şırınna kullanılarak enjekte edildiği sarnıç magnasının ve CSF erişim bölgesinin yerini gösteren bir resim. (B) Dolaşımdaki tümör hücreleri ile 2 haftalık enjeksiyondan sonra leptomeningeal hastalık ve merkezi sinir sistemi metastazları (beyin ve omurilik boyunca) gelişen farelerin temsili bir IVIS görüntüsü. Hücreler luciferaz muhabir geni ile etiketlenmişti. Salin enjekte edilen kontrol hayvanlarında tümör gelişmedi (n = 3) ve deney üç taraflı olarak gerçekleştirildi. Kısaltmalar: CTC'ler = dolaşımdaki tümör hücreleri; IVIS = in vivo görüntüleme sistemi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Farelerde Murine Ommaya implantasyonunu gerçekleştirmek için bir iş istasyonu kurulumu örneği. (1) Gaz anestezi makinesi/buharlaştırıcı. (2) Stereotaksik bir standı kaplayan steril mavi kağıt örtü. (3) Stereotaksik cihaz (stand/sahne, kulak çubukları, burun konisi). (4) Mikrodrill. (5) Işıklı büyüteç. (6) Steril salin durulama kabı ile steril pamuklu aplikatör çubukları. (7) Hidrojen peroksit. (8) Boncuk sterilizatörü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Murine Ommaya cihazının implantasyonu. (A) Kafatasındaki bregmanın yerini gösteren bir ok ve bir mikrodril kullanılarak bregmadan kafatasında bir çapak deliğinin delindiği yaklaşık mesafe (0,5 mm posterior/1,1 mm yanal) ile bir illüstrasyon. (B) Bir Murine Ommaya, kafatasına tutkal bağlanması için temel olarak metal bir kavun ve 1 mm ara parça birleştirilerek monte edilir. (C) Murine Ommayas implante edilmiş farelerin temsili görüntüleri; bu fareler, herhangi bir enjeksiyon almadan önce parlak, uyanık ve reaktif olduklarından emin olmak için izlenir. (D) Murine Ommaya implantlarının prototip manyetik rezonans görüntüleme uyumlu Murine Ommaya ve temsili beyin manyetik rezonans görüntüleme görüntülerine bir örnek. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Murine Ommaya kullanılarak intraventriküler (merkezi sinir sistemi) enjeksiyonu. (A) Murine Ommaya aracılığıyla ventrikül ve merkezi sinir sistemine erişen bir enjeksiyon görüntüsü. Fareler enjeksiyon sırasında anestezi altında kalır. Örnekte, Murine Ommaya önceden doldurulmuş bir Hamilton şırıncısına bağlı minyatür bağlantı noktasına bağlıdır. Enjeksiyonlar, 1 μL / dk infüzyon hızında ve 5-7 μL hacimde otomatik bir enjeksiyon seti kullanılarak gerçekleştirilir. Evans Blue enjekte edilen bir fare beyninin görüntüsü gösterilir. Çember, Murine Ommaya'nın nereye bağlı olduğunu gösteriyor. Beynin dış tarafında boya sızıntısı gözlenmedi. Beynin bir kesiti, lateral ventriküllerin boya ile doldurduğunu gösterir; boya beyin parenkimini etkilemedi. (B) Evans Mavi boya enjeksiyonu takip 15 ve 30 dakika sonra fare beyin görüntüleri. Boya beyne sızdı (15 dk) ve omurilikte (30 dk) dolaşmaya başladı. 5 fareden 4'ü görselleştirme için boya aldı ve 1'i kontrol görevi gördü. Deney üç taraflı olarak tekrarlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Murine Ommaya kullanılarak doğrudan hedefe yönelik immünoterapi, meme kanserine bağlı leptomeningeal hastalık farelerinin genel sağkalımını artırır. (A) BALB/c farelerine luciferaz muhabir etiketli insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2-pozitif TUBO hücreleri, bir murine meme kanseri hücre hattı enjekte edildi. Sarnıç magna enjeksiyonlarından üç gün sonra Murine Ommayas yerleştirildi. Fareler enjeksiyondan 1 hafta sonra leptomeningeal hastalık (LMD) geliştirmeye başladı. LMD fareler intraperitoneal enjeksiyon yoluyla sistemsel olarak veya doğrudan hedefli bir yaklaşım olarak intratekal (Murine Ommaya) yoluyla insan epidermal büyüme faktörü reseptör antikoru ile tedavi edildi. Enjeksiyonlar haftada bir kez 4 haftaya kadar verildi. Tedavi edilmeyen farelerle karşılaştırıldığında, immünoterapi alan fareler çok daha uzun süre hayatta kaldı. Murine Ommaya fareleri dördüncü haftaya kadar tam bir hastalık gerilemesi yaşadı ve bu fareler sonunda hastalıktan iyileşti. (B) Bu fareler ayrıca önemli ölçüde daha iyi ortanca sağkalıma sahipti (Mantel-Cox testi; P = 0.004; n = Tedavi kolu başına 5 fare) ve sistematik olarak tedavi edilen LMD farelere göre daha iyi genel sağkalım. Kısaltmalar: LMD = leptomeningeal hastalık; IP = intraperitoneal. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Burada, Murine Ommaya, LMD ve diğer CNS ile ilgili hastalıkların preklinik modellerinde kanser önleyici ajanların CSF alanına tekrar tekrar yönetilmesini sağlayan güvenilir bir model olarak tanımlanmıştır. Cihaz hala kesintisiz olarak takılıyken farelerden CSF örneği alındı. Bu doğrudan hedefli terapi ksinograft modeli, LMD için rasyonel tedavi stratejileri geliştirme ve test etme konusunda önemli bir adımdır. Sarnıç magna enjeksiyonlarından LMD gelişiminin ilk belirtisine kadar geçen süre kanser hücre tipine bağlı olarak değişmektedir. LMD ve CNS metastazları CTC aşılamadan yaklaşık 1 veya 2 hafta sonra oluşmaya başlar. Oldukça proliferatif bir kanser hücre hattı kullanılırsa, metastazın <7 gün içinde ortaya çıkması mümkündür. Bu durumda tümör büyümesine bağlı damarlanma bazen Murine Ommaya implantasyonunu zorlaştırır. Bu zorluğun bir çözümü, CSF alanına enjeksiyon için kanser hücrelerinin sayısını azaltmak ve tümör gelişiminden önce daha fazla zaman sağlamaktır. Ayrıca, bu protokol, farelerin ilk tedaviden önce ameliyattan kurtulması için yeterli zaman sağlamak için sarnıç magna enjeksiyonundan en geç 72 saat sonra Murine Ommaya'yı yerleştirmek için optimize edilmiştir. Araştırmacılar tedavi rejimini planlamadan önce ksnograft modellerinde CTC'lerin büyüme oranını hesaplamalıdır.
Daha önce açıklandığı gibi, osmotik pompa sistemi veya intraserebroventriküler (ICV) bolus enjeksiyonu gibi diğer doğrudan intraventriküler doğum yöntemleri olmasınarağmen,Murine Ommaya modelini kullanmanın çeşitli avantajları vardır. Örneğin, bir ICV bolus enjeksiyonu tek bir doğumda yapılırken, Murine Ommaya, ister tek bir ajan ister kombine tedaviler olarak verilen herhangi bir zamanda birden fazla tedavi dozuna izin verir. Ozmotik pompa, pompanın değiştirilmesi gerektiğinden önce 14, 28 veya 42 güne kadar ve bazen daha küçük bir pompaya sahip daha küçük bir fare kullanıldığında daha sık dayanacak şekilde tasarlanmıştır. Ozmotik pompanın değiştirilmesi, tümör taşıyan farelere stres katan cerrahi bir prosedür gerektirir. Cihaz bozulmadan kaldığı sürece uzun süreli deneyler için Bir Murine Ommaya değişimi gerekli değildir. Ayrıca pompanın değiştirilmesinden kaynaklanan olası değişkenliği en aza indirir9. Deneysel farelere yerleştirilen Murine Ommayas 42 günden daha uzun süre bozulmadan kaldı ve bu süre uzun ömürlü tedavi rejimlerine izin verdi.
Önceki bulgular, CSF'ye pulsatile aralıklı dozlamanın LMD'ye karşı infüzyon13ile uzun süreli bir ilaç dağıtım sürecinden daha iyi bir etkinliği olduğunu göstermektedir. Ozmotik pompa sistemini kullanarak tekrarlanan tek doz enjeksiyonları yapmak imkansızdır. Her enjeksiyondan sonra kalan sıkışmış sıvıyı temizlemenin kolay bir yolu yoktur. Ozmotik pompa ayrıca uyumlu veya tek ilaçların karışımlarını sunmakla sınırlıdır ve tipik olarak sürekli infüzyon için daha yüksek miktarlarda ilaç hazırlama gerektirir. Buna karşılık, Murine Ommaya, ölü alanı hesaba katmak zorunda kalmadan 3 ila 7 μL kadar düşük doğru mikro enjeksiyonlar için tasarlanmıştır ve araştırmacıların kullanabileceği ilaç türünde bağışıklık hücresi tedavisi de dahil olmak üzere herhangi bir sınırlama yoktur. Murine Ommaya ayrıca belirli bir örnek değerliyse reaktif atıklarını en aza indirir ve bu kaynağın kullanımını en üst düzeye çıkarır. Birden fazla doz anti-kanser tedavisi gerektiren herhangi bir tedavi rejimi için, Murine Ommaya'nın kullanımı kolaydır ve CSF'ye cerrahi olarak veya iğne ile tekrarlanan doğum yoluyla tekrar tekrar erişme alternatif yaklaşımları ile enfeksiyon veya cerrahi talihsizlik riski minimumdur. Murine Ommaya, araştırmacılara ilaç konsantrasyonlarını ve dozlama frekanslarını ayarlama ve ilgi alanı araştırmasına göre hedef modülasyonunu ve çalışma süresini değerlendirme esnekliği sağlar.
Murine Ommaya'nın bir sınırlaması, araştırmacıların cihazı daha küçük farelere yerleştirmeyi zor bulabilecekleridir. Bu nedenle, en az 8 ila 10 haftalık fareler kullanmak daha iyidir. Cihaz implantasyon adımları sırasında kafatasına sabitlenmezse ve tutkal aşınırsa veya fareler onu aşındırıcı bir şekilde kurcalamışsa, Murine Ommaya'nın tedavi denemesi sırasında çıkması mümkündür. İkinci senaryo, birden fazla fare aynı kafeste barındırıldığında daha sık ortaya çıkar. Bu nedenle, tedavi programı süresince kafes başına en fazla iki Murine Ommaya implante farenin barındırılması önerilir. Bu protokol, ara parçayı kafatası yüzeyine yapıştırmak ve Murine Ommaya'nın çıkmasını önlemek için en etkili tutkal olduğu tespit edilen aralığa siyanoakrilat steril yapıştırıcı uygulamak için değiştirildi. Sonuçlar, LMD farelerinin Murine Ommaya aracılığıyla doğrudan intratekal tedaviden yararlandığını ve genel sağkalımın arttığını göstermiştir. Tek mikroliter hacimleri BBB'yi atlayarak güvenli bir şekilde uygulanabilir, böylece ilaç hazırlama miktarı azaltılabilir. En önemlisi, Her2-antikor immünoterapi çalışmasından CNS metastazlarından iyileşen fareler sağlıklı kalmıştır.
LMD'nin PDX modeli için Murine Ommaya'nın MRI uyumlu bir sürümünü geliştirmeyi amaçlayan bir üreticiyle işbirliği. Bu prototip versiyonun dahil edilmiş bir aralayıcısı olduğundan, kafatasına daha iyi yapışmasını sağlayan bir montaj gerekmez. Bu prototipin bir sınırlaması, cihaz MRI uyumlu olmasına rağmen, cihazın yerleştirildiği yerde bir gölge oluşturması ve bu da nicelik analizleri için görüntünün görünürlüğünü azaltmasıdır. EX VIVO CTC örneklemesi sınırlayıcı bir faktör olduğunda ve prelabeling hücreleri mümkün olmadığında MRI uyumlu versiyon iyi bir alternatif araçtır. Bir LMD ksenograft modeli ve Murine Ommaya tekniğinin kombinasyonu, BBB'yi atlayarak doğrudan hedefli ilaç etkinliğini incelemek için faydalıdır. Bu in vivo çalışmalardan elde edilen sonuçlar klinik olarak LMD'li hastalar için rasyonel terapötik stratejiler tasarlamakla ilgilidir.
Disclosures
Peter Forsyth, gönderilen çalışmaların dışında Abvie Inc., Bayer, Bristol Meyers Squib, BTG, Inovio, Novocure, Tocagen ve Ziopharm danışma kurullarında görev yapmaktadır. Diğer tüm yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Acknowledgments
Michele L. Danielson, Tricia Favors-Watson ve Güney Florida Üniversitesi Karşılaştırmalı Tıp ekibinin geri kalanına teknik destekleri ve hayvanlarımızın bakımları için teşekkür ederiz. Instech Laboratories, Inc.'e MRI uyumlu bir Murine Ommaya geliştirme talebimize dayanarak bizimle birlikte çalıştıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R21 CA216756 (K.S.M. Smalley'e), Savunma Bakanlığı (DOD) W81XWH1910675 (B. Czerniecki ve P. Kalinski'ye) ve Moffitt Kanser Merkezi CBMM Yenilikçi Ödülleri (P. Forsyth ve D. Duckett'e) tarafından desteklenmektedir. Editoryal yardım, Moffitt Kanser Merkezi Bilimsel Yazma Ofisi tarafından Dr. Paul Fletcher ve Daley Drucker tarafından sağlanmıştır. Normal maaşlarının ötesinde bir tazminat verilmedi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm spacer disc | Alzet, Durect Corporation | #0008670 | Spacer disc only |
| 4-0 ethilon nylon suture | Any vendor | n/a | |
| Automatic syringe pumps | Harvard Syringe Pumps (or any vendor) | #70-4505 | Pump 11 Elite |
| Bead sterilizer | Braintree Scientific Inc. (or any vendor) | #GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Buprenorphine Sustained-Release (Bup-SR) | Zoopharm | DEA controlled | |
| Cyanoacrylate sterile adhesive | Any vendor | ||
| Gas inhalation anestehsia system | VeteEquip | #901812 | COMPAC5 |
| Hamilton microliter syringes | Hamilton | 10, 25, 50, and 100 μL | 30 G for cisterna magna injection |
| Hydrogen peroxide | Any vendor | n/a | |
| IVIS 200 imaging system | Caliper Life Sciences | n/a | |
| Magnifying glass with light | Any vendor | n/a | |
| Microdrill | Stoelting (or any vendor) | #51555M | |
| MRI imaging | Bruker | BioSpec series | Optional |
| Murine Ommaya (MRI-compatible) prototype | Instech Laboratories, Inc. | #VAB620-25MRI-3.3 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Any vendor | n/a | 0.1 mm Sterile-Filtered |
| PinPort injector | Instech Laboratories, Inc. | #PNP3M-50 | |
| PinPort | Instech Laboratories, Inc. | #1-PNP3F28-50 | |
| Rodent Surgical Instruments (Scissors, Forceps) | Roboz Surgical Instrument (or any vendor) | ||
| Stereotaxic device | Stoelting (or any vendor) | #51730M | |
| Sterile blue paper/ drape covering | Any vendor | n/a | n/a |
| Sterile cotton sticks | Any vendor | n/a |
References
- Chamberlain, M. C.
- Nayar, G., et al. Leptomeningeal disease: current diagnostic and therapeutic strategies. Oncotarget. 8 (42), 73312-73328 (2017).
- Shapiro, W. R., Johanson, C. E., Boogerd, W. Treatment modalities for leptomeningeal metastases. Seminars in Oncology. 36 (4), Suppl 2 46-54 (2009).
- Davies, M. A., et al. Prognostic factors for survival in melanoma patients with brain metastases. Cancer. 117 (8), 1687-1696 (2011).
- Znidaric, T., et al. Breast cancer patients with brain metastases or leptomeningeal disease: 10-year results of a national cohort with validation of prognostic indexes. Breast Journal. 25 (6), 1117-1125 (2019).
- Glitza, I. C., et al. Leptomeningeal disease in melanoma patients: An update to treatment, challenges, and future directions. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (4), 527-541 (2020).
- Raizer, J. J., et al. Brain and leptomeningeal metastases from cutaneous melanoma: survival outcomes based on clinical features. Neuro-oncology. 10 (2), 199-207 (2008).
- Taillibert, S., et al. Leptomeningeal metastases from solid malignancy: a review. Journal of Neurooncology. 75 (1), 85-99 (2005).
- DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. (75), e50326 (2013).
- Kodumudi, K. N., et al. Sequential anti-PD1 therapy following dendritic cell vaccination improves survival in a HER2 mammary carcinoma model and identifies a critical role for CD4 T cells in mediating the response. Frontiers in Immunology. 10, 1939 (2019).
- Dunn, L., et al.
- Simon, M. J., Iliff, J. J. Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (3), 442-451 (2016).
- Shackleford, G. M., et al. Continuous and bolus intraventricular topotecan prolong survival in a mouse model of leptomeningeal medulloblastoma. PLoS One. 14 (1), 0206394 (2019).
