Hier stellen wir ein Protokoll vor, um ein dreidimensionales vereinfachtes und undifferenziertes Hautmodell unter Verwendung einer mikrobearbeiteten mikrofluidischen Plattform zu generieren. Ein paralleler Strömungsansatz ermöglicht die In-situ-Ablagerung eines Hautkompartiments für die Aussaat von Epithelzellen auf der Oberseite, die alle von Spritzenpumpen gesteuert werden.
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Methodenartikel
Generierung eines vereinfachten dreidimensionalen Skin-on-a-Chip-Modells in einer mikrobearbeiteten mikrofluidischen Plattform
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Diese Arbeit stellt eine neue, kostengünstige und zuverlässige mikrofluidische Plattform mit dem Potenzial dar, komplexe mehrschichtige Gewebe zu erzeugen. Als Proof of Concept wurde eine vereinfachte und undifferenzierte menschliche Haut modelliert, die ein dermales (stromales) und ein epidermales (epitheliales) Kompartiment enthält. Um dies zu erreichen, wurde ein vielseitiges und robustes, vinylbasiertes Gerät entwickelt, das in zwei Kammern unterteilt ist und einige der Nachteile mikrofluidischer Geräte auf Basis von Polydimethylsiloxan (PDMS) für biomedizinische Anwendungen überwindet, wie z.B. die Verwendung teurer und spezialisierter Geräte oder die Absorption kleiner, hydrophober Moleküle und Proteine. Darüber hinaus wurde eine neue Methode entwickelt, die auf parallelem Fluss basiert und die In-situ-Ablagerung sowohl des dermalen als auch des epidermalen Kompartiments ermöglicht. Das Hautkonstrukt besteht aus einer Fibrinmatrix, die menschliche primäre Fibroblasten enthält, und einer Monoschicht aus immortalisierten Keratinozyten, die oben ausgesät sind und anschließend unter dynamischen Kulturbedingungen aufrechterhalten werden. Diese neue mikrofluidische Plattform eröffnet die Möglichkeit, menschliche Hautkrankheiten zu modellieren und die Methode zu extrapolieren, um andere komplexe Gewebe zu erzeugen.
Einleitung
In jüngster Zeit wurden Fortschritte bei der Entwicklung und Produktion von In-vitro-Modellen für die menschliche Haut zur Analyse der Toxizität kosmetischer und pharmazeutischer Produkteerzielt 1. Forscher in der Pharma- und Hautpflegeindustrie haben Tiere verwendet, wobei Mäuse am häufigsten vorkommen, um ihre Produkte zu testen2,3,4,5. Das Testen von Produkten an Tieren ist jedoch nicht immer prädiktiv für das Ansprechen beim Menschen, was häufig zu Arzneimittelversagen oder nebenwirkungen beim Menschen un....
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Protokoll
1. Chipdesign und Mikrobearbeitungsparameter
- Entwerfen Sie die mikrofluidischen Chipschichten mit der Open-Source-Designsoftware FreeCAD. Die Abmessungen der Kanäle sind Tabelle 1 zu entnehmen. Fügen Sie vier Löcher mit einem Durchmesser von 2,54 mm in das Design ein, um einen maßgeschneiderten Aligner für eine korrekte Schichtüberlagerung zu verwenden.
| Länge (μm) | Breite (μm) | |
| Unterhaus | 28,400 | 800 |
| Obere Kammer | 31,000 |
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Ergebnisse
Der entworfene Chip besteht aus zwei fluidischen Kammern, die durch eine 5 μm porengroße PC-Membran getrennt sind, die das Wachstum der Zelle ermöglicht, indem sie den Durchgang wachstumsfördernder Moleküle aus der unteren Kammer ermöglicht. Die obere Kammer hält das Gewebekonstrukt, in diesem Fall eine Monoschicht aus hKCs auf einem Fibrinhydrogel, das hFBs enthält.
Die Höhe der Kanäle wird durch die Anzahl der Klebefolien bestimmt, die jedem Kanal hinzugefügt werden. Die untere Kammer besteh.......
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Diskussion
Die Motivation, diese Methode zu entwickeln, war der Wunsch, Hauterkrankungen zu modellieren und die Auswirkungen neuer und innovativer Therapien in einer Hochdurchsatzplattform zu untersuchen. Bis heute produziert dieses Labor diese dermo-epidermalen Äquivalente, indem es - entweder manuell oder mit Hilfe der 3D-Bioprinting-Technologie - das Fibringel mit Fibroblasten in eine Zellkultur-Einlegeplatte gießt und die Keratinozyten darauf aussät. Sobald die Keratinozyten den Zusammenfluss erreichen, wird die 3D-Kultur der L.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Wir danken Dr. Javier Rodríguez, Dr. María Luisa López, Carlos Matellán und Juan Francisco Rodríguez herzlich für sehr hilfreiche Anregungen, Diskussionen und/oder vorläufige Daten. Wir danken auch den Beiträgen von Sergio Férnandez, Pedro Herreros und Lara Stolzenburg zu diesem Projekt. Besonderer Dank geht an Dr. Marta García für GFP-gekennzeichnete hFBs und hKCs. Schließlich würdigen wir die hervorragende technische Unterstützung von Guillermo Vizcaíno und Angélica Corral. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das "Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid", Projekt S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. Diese Arbeit wurde auch d....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Amchafibrin | Rottafarm | Tranexamsäure | |
| Antibiotikum/Antimykotikum | Thermo Scientific HyClone | ||
| Calciumchlorid | Sigma Aldrich | ||
| Kulturplatten | Fisher | ||
| DMEM | Invitrogen Life Technologies | ||
| Doppelseitiges Klebeband Vynil | ATP Klebesysteme | GM 107CC, 12 & micro; m dick | |
| Kantenplotter | Brother | Scanncut CM900 | |
| FBS | Thermo Scientific HyClone | ||
| Fibrinogen | Sigma Aldrich | Extrahiert aus menschlichem Plasma | |
| Glasobjektträger | Thermo Scientific | ||
| GFP-Humane dermale Fibroblasten-Primär | . Geschenk von Dr. Marta Garcí eine | ||
| H2B-GFP-HaCaT-Zelllinie | ATCC | Immortalisierte Keratinozyten. Geschenk von Dr. Marta Garcí ein | |
| Live/Dead-Kit | Invitrogen | ||
| PBS | Sigma Aldrich | ||
| Polycarbonat-Membran | Merk TM | 5 µ m Porengröße | |
| Polydimethylsiloxan | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Natriumchlorid | Sigma Aldrich | ||
| Spritzen | Terumo | 5 mL | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | 10 NIH/Fläschchen | |
| Transparentes selbstklebendes Vinyl | Mactac | JT 8500 CG-RT, 95 & Mikro; m dicker | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | ||
| Schlauch | IDEX | Teflon, 1/16" Außendurchmesser, 0,020" Id |
Referenzen
- McNamee, P., et al. A tiered approach to the use of alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics: Eye irritation. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 54 (2), 197-209 (2009).
- Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U.
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Nachdrucke und Genehmigungen
