Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

בידוד אבות מקרוציטים עכבר

Published: May 20, 2021 doi: 10.3791/62498
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1
1Université de Strasbourg, INSERM UMR S1255, EFS Grand-EST, 2UMR-S1113 –IRFAC, Université de Strasbourg

ERRATUM NOTICE

Summary

שיטה זו מתארת את הטיהור על ידי ציטומטריית זרימה של MEP ו- MKP מעצמות הירך של העכברים, השוקה ועצמות האגן.

Abstract

מגהקריוציטים של מח עצם הם תאים פוליפלואידיים גדולים המבטיחים ייצור של טסיות דם. הם נובעים מתאי גזע hematopoietic דרך megakaryopoiesis. השלבים הסופיים של תהליך זה הם מורכבים וקלאסיים מעורבים אבות Megakaryocyte-אריתרוציטים דו-פוטנטיים (MEP) ואת אבות המגקריוציטים (MKp) החד-פעמיים. אוכלוסיות אלה מקדימות את היווצרותם של מגה-קריוציטים בתום לב, וככאלה, בידודם ואפיונם עלולים לאפשר ניתוח חזק ובלתי משוחד של היווצרות מגה-קריוציטים. פרוטוקול זה מציג בפירוט את ההליך לאיסוף תאים hematopoietic ממח עצם העכבר, העשרה של אבות hematopoietic באמצעות דלדול מגנטי ולבסוף אסטרטגיית מיון תאים המניבים אוכלוסיות MEP ו- MKP מטוהרות מאוד. ראשית, תאי מח עצם נאספים מעצם הירך, השוקה, וגם סמל הכסל, עצם המכילה מספר גבוה של אבות hematopoietic. השימוש בעצמות פסגת הכסל מגדיל באופן דרסטי את מספר התא הכולל המתקבל לעכבר ובכך תורם לשימוש אתי יותר בבעלי חיים. דלדול שושלת מגנטית היה אופטימיזציה באמצעות חרוזים מגנטיים 450 ננומטר המאפשר מיון תאים יעיל מאוד על ידי ציטומטריית זרימה. לבסוף, הפרוטוקול מציג את אסטרטגיית התיוג וההתארגנות למיון שתי אוכלוסיות אבות מגהקריוציט מטוהרות מאוד: MEP (לין-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9עמום) ו- MKP (לין- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9בהיר ). טכניקה זו קלה ליישום ומספקת מספיק חומר תאי לביצוע i) אפיון מולקולרי לידע מעמיק יותר של זהותם וביולוגיה שלהם, ii) במבחנה הבחנה assays, שיספק הבנה טובה יותר של מנגנוני ההתבגרות של megakaryocytes, או iii) במודלים במבחנה של אינטראקציה עם microenvironment שלהם.

Introduction

טסיות דם מיוצרות על ידי מגה-קריוציטים. תאים פוליפלואידיים גדולים אלה ממוקמים במח העצם ובפי כל תאי הדם הם נגזרים מתאי גזע Hematopoietic (HSC)1. המסלול הקלאסי של ייצור של megakaryocytes במח העצם מקורו HSC ומערב את הדור של אבות שונים המגבילים בהדרגה את פוטנציאל הבידול שלהם2. האב הקדמון הראשון החתום על המחויבות לשושלת המקרוציטית הוא האבות Megakaryocyte-אריתרוציט (MEP), צאצא דו-פונטי המסוגל לייצר הן תאי אריתרויד והן מגהקריוציטים3,4,5. לאחר מכן מייצר ה- MEP צאצא /מבשר חד-קומתי (MKP) שיבדל למגקריוציט בוגר המסוגל לייצר טסיות דם. המנגנונים המעורבים בדור אבות אלה, כמו גם הבידול וההתבגרות שלהם למגקריוציטים הם מורכבים ומובנים חלקית בלבד. בנוסף, ההטרוגניות של אוכלוסיית MEP במונחים של פוטנציאל בידול ורמת המחויבות המהותית של תאים אלה עדיין לא ברורה. כדי לפענח תהליכים אלה, חיוני להשיג (או לקבל גישה) אוכלוסיות מטוהרות של MEP ו- MKp עבור ניתוחים מולקולריים ותאיים בודדים עדינים.

מספר מחקרים הדגימו שילובים מסוימים של סמני פני השטח של התא לזיהוי אבות המחויבים לשושלת המגקריוציטית בעכבר6,7,8. מתוך אלה הומצאה שיטה המאפשרת טיהור של MEP ו- MKP מעכברים. שיטה זו הייתה ממוטבת כדי להשיג תאים במספר ובאיכות נאותים עבור מספר רב של בדיקות. מתוך שיקולים אתיים, וכדי לצמצם את מספר בעלי החיים המעורבים בניסויים, עוררנו לקצור את מח העצם מעצם הירך ומהשוקה, וגם מפסגת הכסל. עצם זו מכילה תדירות גבוהה ומספר אבות hematopoietic והוא רוב הזמן פגום במהלך קצירת עצם ארוכה. מוצג כאן היא שיטה מפורטת עבור אוסף אמין של עצם זו.

הקריטריונים השניים של אופטימיזציה הוא לייצר אוכלוסיות תאים מטוהרות מאוד. מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) היא שיטה של בחירה על מנת להשיג אוכלוסיות מטוהרות של תאים מעניינים. עם זאת, תשואות נמוכות מגיעות כאשר אוכלוסיית התאים של עניין היא נדירה מאוד. לכן יש צורך בהליכי העשרה. בפרוטוקול זה, הליך בחירה שלילי נבחר באמצעות חרוזים מגנטיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקולים הנוגעים לבעלי חיים בוצעו בהתאם לוועדת CREMEAS לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת שטרסבורג (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). מספר היתר: E67-482-10).

1. אוסף עצמות עכבר

  1. להקריב את החיה בהתאם להנחיות המוסדיות.
    הערה: הנתונים המוצגים בכתב יד זה התקבלו מעכברים C57Bl/6 בני 8 עד 12 שבועות. מספר התאים שהושגו, ותדירות האוכלוסיות המצוטטים עשויים להשתנות בהתאם לגיל ולמתח העכבר.
  2. לרסס את הגוף עם 70% אתנול.
  3. באמצעות מספריים, לבצע 0.5-1 ס"מ פירוק של העור בניצב לעמוד השדרה ולקרוע את העור סביב כל הגוף. מוציאים את העור מהגוף התחתון ומסירים את העור.
  4. מניחים את החיה על משטח ההפצה, עם הפנים כלפי מטה. אתר את עצמות האגן על ידי הזזת האצבעות לאורך עמוד השדרה החשוף מלמעלה למטה. כדי לאתר את סמל הכסל, לזהות את הבליטה הקטנה באזור המותני ליד האחוריים (האזור הטרטרוסקופי של עצם האגן). איור 1A,B מציג ייצוג סכמטי של האנטומיה של העכבר.

Figure 1
איור 1: אנטומיה של עכבר. (A)צילום רנטגן של עכבר המציג את העצמות האחוריות. שים לב למרווח בין עצם האגן לעמוד השדרה (חץ צהוב), שבו המספריים חייבים להיות מוכנסים כדי להפריד כראוי את האחוריים מגוף העכבר (קו מקווקו צהוב). (ב)ייצוג סכמטי של עצמות עשירות במח העצם של עניין. עצמות האגן מתוארות באדום, עצם הירך בסגול, ואת השוקה בירוק. (C)ייצוג סכמטי של עצם האגן של העכבר. האיליה מתאים לחלק העשיר במח העצם של עצם האגן ומודגש באדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. מניחים את המספריים במקביל לעמוד השדרה כנגד החוליות וקרובים לבליטת פסגת הכסל. המשך לחתוך את השרירים לאורך הצד של עמוד השדרה מעל עצם האגן על ידי הזזת המספריים לאורך החוליות כל הדרך למטה לזנב.
    הערה: חלק ראשון זה של השרירים יכול להתבצע גם באמצעות להב אזמל.
  2. הניחו את המספריים מקבילים לעמוד השדרה והמשיכו לחתוך בין החוליות לפסגת הכסל, כפי שמציינים הקו המקווקו הצהוב באיור 1A. הקפד להישאר קרוב לחוליות ככל האפשר. חותכים את השרירים הנותרים כדי לנתק את האיבר מהגוף.
    הערה: צריכה להיות התנגדות מועטה עד לא קיימת.
  3. חזור על הפעולה בצד השני כדי לנתק את האיבר השני.
  4. מעבירים את הגפיים על משטח נקי ומשליכים את שאר הגוף בהתאם להנחיות המוסדיות.
  5. לחשוף את עצמות האגן, הירך, ו tibial על ידי הסרת הרקמה שמסביב ככל האפשר עם המלקחיים ואת האזמלים.
  6. המשך לפרוק בזהירות את ראש הירך מעצם האגן על ידי החזקת הקצה הדיסטלי של עצם הירך עם המלקחיים תוך חיתוך עדין של השרירים סביב הניסוח עם האזמלים. נענע את העצמות כדי להקל על הנקע.
  7. לגרד את השריר הנותר מעצם האגן לחתוך עם אזמל באמצע החלל כי החזיק את ראש הירך. האיליום נשמר מכיוון שהוא עשיר באבות המטופויים, בעוד הצד המשולש הדק מאוד של העצם מושלך, כפי שמוצג באיור 1C.
  8. הסר את שאריות הרקמות סביב האיליום עם האזמל ומניחים את העצם המנוקה PBS סטרילי בתוספת 2% סרום עגל שזה עתה נולד (PBS-2%NBCS).
  9. בעזרת מספריים, חותכים את הרגל מהרגל בקרסול.
  10. החזק את החלק התחתון של השוקה עם המלקחיים ולגרד את השריר לכיוון הברך. להשליך את השוביות לחתוך על פני הרמה tibial עם האזמל. מניחים את השוקה ב- PBS-2% NBCS סטרילי.
  11. הסר את שאריות הרקמות סביב עצם הירך עם אזמלים.
  12. החזק את הצד העליון של עצם הירך עם מלקחיים; מניחים את להב האזמל בבסיס פיקת הברך. החל כוח לכיוון פיקת הברך במקביל עצם הירך עד ניתוק פיקת הברך. מניחים את עצם הירך ב-PBS-2% סטריליים NBCS. הסרת פיקת הברך מספקת גישה נקייה להכנסת המחט לשטיפה של מח העצם.

2. דלדול מגנטי של תאים חיוביים שושלת

  1. בארון זרימה למינאר, להעביר את העצמות בצלחת פטרי סטרילית מלא PBS-2% NBCS סטרילי.
  2. עם אזמל חתוך את ראש עצם הירך.
  3. מלא מזרק 1 מ"ל עם PBS-2% NBCS סטרילי ולחבר מחט 21 G לשקע.
  4. מלא צינור פוליפרופילן 5 מ"ל עם 2 מ"ל של PBS-2% NBCS סטרילי.
  5. החזק את עצם הירך עם המלקחיים; הכנס בעדינות את המחט לחריץ שנותר לאחר הסרת פיקת הברך. החל סיבוב על המחט בעת החדרה כדי למנוע חיבור של המחט. ודא כי המחט מוכנסת לחלוטין לתוך העצם עד שיפוע.
  6. העבר את העצם עם המחט לתוך הצינור המכיל 2 מ"ל של PBS-2%NBCS. לוותר ולשאוף PBS-2%NBCS מהמזרק עד העצם ברורה.
  7. הסר את המחט מ עצם הירך ולהכניס אותו לחור בצד הנגדי שבו ראש עצם הירך היה. מחלקים ושואפים שוב את החיץ ומשליכים את העצם.
  8. עבור סמל הכסל והשוקה, להחזיק את העצם עם מלקחיים; הכנס בעדינות את המחט לצד הפתוח. החל סיבוב על המחט בעת החדרה כדי למנוע חיבור של המחט. ודא כי המחט מוכנסת לחלוטין לתוך העצם עד שיפוע. העבר את העצם עם המחט לתוך הצינור המכיל 2 מ"ל של PBS-2%NBCS. לוותר ולשאוף PBS-2%NBCS מהמזרק עד העצם ברורה. זרוק את העצמות.
    הערה: עצמות של עד שלושה עכברים ניתן לשטוף לתוך אותו צינור. תאחדו את ההשעיות של התאים.
  9. להעביר את השעיית התא המאגד דרך מכסה מסננת תא 40 מיקרומטר להציב על צינור פוליסטירן סטרילי 5 מ"ל.
  10. המשך לספור את התאים.
    הערה: ניתן לבצע ספירת תאים עם כל המוציטומטר, באמצעות Trypan Blue להערכת כדאיות, או עם כל מונה תאים אוטומטי. עכבר אחד מניב בדרך כלל 105 ± 7 x 106 תאים.
  11. קח הצידה 100 μL של השעיית התא כמו מח עצם הכולל, להוסיף 500 μL של PBS-2%NBCS ולשמור אותו על קרח עבור הליך הכתם.
  12. גלם את המתלים המסוננים על ידי צנטריפוגה ב 400 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F) ולהשליך את supernatant.
    הערה: תאי דם אדומים יכולים להיות lysed על ידי שימוש חוזר את הכדור בתמיסת ליזה מוכן טרי (1/10th ב- dH2O). דגירה במשך 5 דקות עד המתלה הופך ברור ואדום בוהק ולהוסיף 10 כרכים של PBS סטרילי. המשך לשטוף את התאים PBS-2%NBCS על ידי צנטריפוגה ב 400 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F). היזהר בעת הסרת supernatant כמו גלולה התא הוא רופף מאוד. בצע שטיפה שנייה עם PBS-2%NBCS על ידי צנטריפוגה ב 400 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F) ולהמשיך לשלב 2.13.
  13. Resuspend גלולה התא בקוקטייל נוגדנים ראשוני מוכן טרי עם יחס של 100 μL לכל 1 x 107 תאים. דגירה על קרח במשך 30-45 דקות.
נוגדן דילול
Gr-1-ביוטין 1:500
B220-ביוטין 1:500
מק-1-ביוטין 1:500
CD3-ביוטין 1:500
CD4-ביוטין 1:500
CD5-ביוטין 1:500
CD8-ביוטין 1:500
TER119-ביוטין 1:1000
CD127-ביוטין 1:500

טבלה 1.

  1. קח הצידה 10 μL של השעיית התא לתוך צינור פוליסטירן סטרילי 5 מ"ל שכותרתו שבר לין-Pos. הוסף 90 μL של PBS-2%NBCS ולשמור אותו על קרח עבור הליך הכתמה.
  2. המשך לשטוף את התאים פעמיים עם PBS-2%NBCS סטרילי על ידי צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F). הקפד לעשות את הכביסה האחרונה בצינור פוליפרופילן סטרילי 5 מ"ל.
  3. במהלך שלבי הכביסה, הכינו את החרוזים לדלדול המגנטי.
    1. resuspend החרוזים בקסנה על ידי מערבולת ביסודיות במשך 30 s.
    2. העבר נפח של חרוזים המתאימים לשני חרוזים לכל תא יעד לתוך צינור פוליפרופילן 5 מ"ל.
    3. לשטוף את החרוזים פעמיים עם PBS-2%NBCS על ידי הצבת הצינור על המגנט והסרת חיץ הכביסה באמצעות פיפטה פסטר זכוכית סטרילית.
    4. resuspend החרוזים ב 500 μL של PBS-2NBCS סטרילי%.
  4. Resuspend הכדור של תאים מסומנים ב 250 μL של חרוזים ומערבבים בעדינות במשך 5 דקות על קרח. הוסיפו 2 מ"ל של PBS-2% סטריליים של NBCS וערבבו בעדינות. אל תנער את הצינור.
  5. מניחים את הצינור על המגנט למשך 2 דקות.
  6. ממשיכים לאסוף את השבר הלא מגנטי עם פיפטה פסטר זכוכית סטרילית ולהוסיף אותו על 250 μL הנותרים של חרוזים מגנטיים. לאטום את הצינור עם parafilm.
  7. מניחים את הצינור על רולר צינור במשך 20 דקות ב 4 °C (70 °F).
  8. הוסיפו 2 מ"ל של PBS-2% סטריליים של NBCS וערבבו בעדינות. אל תנער את הצינור.
  9. מניחים את הצינור במגנט למשך 2 דקות.
  10. המשך לאסוף את השבר הלא מגנטי לתוך צינור פוליפרופילן סטרילי 5 מ"ל שכותרתו לין-שלילי שבר עם פיפטת פסטר זכוכית סטרילית.
  11. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F) ולהסיר את supernatant.
  12. resuspend התאים הלא מגנטיים ב 500 μL של PBS-2% NBCS סטרילי.
  13. המשך לספור את התאים.
    הערה: עכבר אחד מניב בדרך כלל 3.9 ± 1.1 x 106 תאים. כתמי שושלת אופייניים מלפני ופוסט-דלדול מוצגים באיור 2B.

3. מיון תאים של אבות megakaryocyte על ידי cytometry זרימה

  1. קח את הצינורות שכותרתם מח עצם כולל, שבר לין-פו, ושבר לין שלילי.
  2. המשך לפצל את התוכן של הצינור מח עצם סה"כ באופן שווה לתוך שישה צינורות פוליסטירן סטרילי 5 מ"ל. תייג את הצינורות עם המספרים 1-6.
  3. המשך לתייג את שבר לין-פו של הצינור עם המספר 7.
  4. המשך לפצל את התוכן של שבר לין-שלילי הצינור כדלקמן.
    1. העבר 50 μL לתוך צינור פוליסטירן סטרילי 5 מ"ל המכיל 250 μL של PBS-2%NBCS סטרילי. לאחר מכן, לפצל את התוכן שלה באופן שווה לתוך 3 צינורות פוליסטירן 5 מ"ל סטרילי. תייג את הצינורות האלה עם המספרים 8-10.
    2. 450 μL הנותרים של השעיית תא לין-שלילי שבר מתאים לצינור עם המספר 11.
  5. הוסף את הנוגדנים לצינורות כמתואר בטבלה 2.
צינור תווית קוקטייל נוגדנים
סה"כ מח עצם
1 פקד לא נגוע
2 שליטה מוכתמת בודדת CD45-FITC (1/200)
3 שליטה מוכתמת בודדת CD45-PE (1/200)
4 שליטה מוכתמת בודדת TER119-נגמ"ש (1/200)
5 שליטה מוכתמת בודדת CD45-PECy7 (1/200)
6 שליטה מוכתמת בודדת CD45-APC-Cy7 ביוטין (1/200)
שבר לין-קופה
7 שליטה מוכתמת בודדת שליטה מוכתמת אחת. סטרפטבידין-נגמ"ש-סיי7 (1/500)
שבר לין-שלילי
8 בקרת FITC FMO c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) +
CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + סטרפטבידין-APC-Cy7 (1/500)
9 בקרת FMO PE CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + סטרפטאבידין-APC-Cy7 (1/500)
10 בקרת FMO PECy7 CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) +
CD16/32-PE (1/200) + סטרפטבידין-APC-Cy7 (1/500)
11 שפופרת חיובית למיון CD9-FITC (1/200) + c-kit-APC (1/200) + Sca-1-PE (1/200) +
CD16/32-PE (1/200) + CD150-PECy7 (1/200) + סטרפטבידין-APC-Cy7 (1/500)

טבלה 2.

  1. דגירה על קרח במשך 30-45 דקות בחושך.
  2. לשטוף את התאים עם PBS-2%NBCS סטרילי על ידי צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F).
  3. resuspend כדורי התא כדלקמן.
    1. עבור הצינורות 1 עד 10, resuspend הכדור ב 300 μL של PBS-2%NBCS סטרילי בתוספת 7AAD (2.5 מיקרוגרם / מ"ל סופי) (PBS-7AAD).
      אזהרה: 7AAD הוא intercalant DNA ולכן יש לטפל עם PPE מתאים (כפפות).
    2. עבור צינור 11, resuspend הכדור ב PBS-7AAD סטרילי בריכוז מרבי של 5 x 106 תאים למ"ל ונפח מינימלי של 1 מ"ל.
  4. הכן שני צינורות איסוף פוליפרופילן שכותרתם MEP ו- MKP המכילים 2 מ"ל של PBS-2%NBCS.
    הערה: לחלופין, ניתן לאסוף תאים למאגר תמזה בינוני או תאי של תרבית בהתאם ליישום הבא עבור התאים ממוינים. השימוש בצינורות פוליסטירן אינו מומלץ בגלל הפרעה אפשרית עם טיפות טעונות המכילות את התאים של עניין.
  5. שמור את כל הצינורות על קרח בחושך.
  6. המשך לגדר סדרן התאים.
    1. השתמש בצינורות 1-7 כדי להגדיר מתח ופיצוי, צינורות 7-10 כדי לקבוע את שערי המיון עבור אוכלוסיות התאים של עניין צינור 11 למיון תאים.
  7. הצעדים הראשונים של אסטרטגיית הג'טינג נועדו להוציא מהניתוח מכפילים ותאים מתים, כמתואר באיור 3. זהה תאים יחידים קיימא ולהציג SSC-לעומת Lin-APC-Cy7 נקודה plot כדי לאשר את היעילות של דלדול שושלת היוחז. מתוך תאי Lin- שער מוגדר לבחור תאים חיוביים עבור c-kit ושלילי או עמום עבור Sca-1 ו- CD16/32. התוויית נקודות של ביטוי CD9 לעומת CD150 עבור התאים שנבחרו מאפשרת זיהוי של ארבע אוכלוסיות.
    הערה: תאי MEP ו- MKp שניהם חיוביים עבור CD150. ניתן להגדיר שלוש רמות ביטוי עבור CD9 (שלילה, עמום וגבוה). MKp מבטא רמה גבוהה של CD9 ו- MEP express CD9 ברמת עוצמת פלואורסצנטיות ביניים. אוכלוסיית MEP מתאימה ללין- c-Kit+ Sca-1-CD16/32-/עמום CD150+ CD9עמום ואוכלוסיית MKP תואמת את לין- c-Kit+ Sca-1-CD16/32-/עמום CD150+ CD9בהיר. האפליה בין אוכלוסיות עמומות CD9 ו- CD9 עבור התאים החיוביים CD150 מוגדרת בהתבסס על הרמה המרבית של ביטוי CD9 באוכלוסייה השלילית CD150. עכבר אחד מניב בדרך כלל 5.3 ± 0.6 x 103 MKp ו- 27.2 ± 2.4 x 103 MEP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתוח פנוטיפי של התאים שזוהו כ- MEP ו- MKp בוצעו על ידי ציטומטריית זרימה. תאים סומנו בנוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים ל- CD41a ו- CD42c, סמנים קלאסיים של שושלות המגקריוציטיות והטסיות. שני הסמנים התבטאו בתאי אוכלוסיית הח"כים בעוד סמנים אלה עדיין לא זוהו על פני השטח של תאי אוכלוסיית MEP (איור 4Ai, 4Aii). פוליפלואידיה היא סימן היכר של מגה-קריוציטים. תוכן הדנ"א של האוכלוסיות ממוינות נותח גם והוכח כי התאים הם בעיקר 2N עבור אוכלוסיית MEP וחלק קטן של תאי MKP הם 4N, אבל ploidy גבוה יותר אינם מזוהים באופן משמעותי באוכלוסיות אלה (איור 4Aiii).

על מנת לאשר את זהותן של אוכלוסיות התאים ממוינים, בוצעו מספר בדיקות בידול כדי להעריך את יכולתן להבדיל לכיוון שושלות המקרוציטים והאריתרוידים. ראשית, בוצעו מבחנים קלונוגניים חצי מוצקים כדי לכמת אב קדמון מקרוציטי (CFU-MK) ואבות אריתרוד (BFU-E). CFU-MK זוהו הן באוכלוסיות MEP והן באוכלוסיות MKP אך לא באוכלוסייה האחרת שנבדקה(איור 4B). BFU-E לא זוהו באוכלוסיית MKP אלא זוהו באוכלוסיית MEP ואוכלוסייתהתאים העמומים CD150-CD9 (איור 4C).

ההבחנה של התאים ממוינים בוצעה גם בתרבית נוזלית בנוכחות ריכוז נמוך של ציטוקינים hematopoietic. תמונות מייצגות מתצפית מיקרוסקופית ביום השלישי של הבידולמראות כי MEP ו- MKP הפיקו בעיקר מגהקריוציטים המזוהים כתאים גדולים(איור 5Aiii, 5Aiv). Megakaryocytes זוהו באמצעות ביטוי CD41 ו- CD42c ומייצגים 53.9 ± 10.4% ו 82.0 ± 2.0% מהתאים המיוצרים מאוכלוסיות תאי MEP ו- MKP, בהתאמה (איור 5B). באופן ניכר, השפע של megakaryocytes המיוצר באמצעות סמן DNA Hoescht 33242, היה גדול יותר עבור megakaryocyte נגזר מאוכלוסיית MKP לעומת אוכלוסיית MEP מציע מצב בוגר יותר (איור 5C). לבסוף, התאים המיוצרים מכל אוכלוסייה ביוםהשלישי היו נתונים להיווצרות פרופלטלט9. נמצא כי רק התאים הנגזרים מאוכלוסיית הח"כים מסוגלים להניע פליטה במצב זה(איור 5D). זה מצביע על שלב התבגרות מתקדם יותר לאוכלוסיית הח"כים. יתר על כן, כאשר משך התרבות הוארך עד 4-5 ימים, megakaryocytes שנוצר MEP יאריך גם את המרחיבים.

Figure 2
איור 2: דלדול מגנטי של תאי שושלת היוחזים (Lin). (A)ייצוג סכמטי של פרוטוקול הדלדול המגנטי. ראשית, תאי מח עצם לא ממוינים מסומנים בקוקטייל נוגדן נגד עכברים של חולדות בוטין. לאחר מכן, תאים דוגרים בחרוזים מגנטיים מצופים Ig נגד חולדות ולאחר מכן נתונים לדלדול המגנטי באמצעות מגנט חזק. המגנט ישמור על שבר Lin+ המגנטי המסומן על קירות הצינור, בעוד השבר הלא-מגנטי ללא תווית של לין- שלילי ייאסף בצינור חדש. (B)ניתן לזהות תאים מחויבים לשושלת היוחז באמצעות סטרפטווידין מצומד פלואורסצנטי. ניתוח אופייני של ביטוי השושלת בתאים לפני דלדול מגנטי (מח עצם כולל) ולאחר דלדול מגנטי (Lin- Fraction) N = 21. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: אסטרטגיית מיון תאים. (A) בחירת האירועים המתאימים לתאים בודדים בני קיימא. (B)בחירת אוכלוסיות MEP ו- MKP. (i)אוכלוסיית לין שלילי נבחרה מתוך אירועי תא יחיד קיימא. (ii)אבות המביעים c-kit ועם ביטוי נמוך עד ללא ביטוי של אנטיגן Sca-1 או CD16/32 נבחרים לאחר מכן. (iii)רמות הביטוי CD9 ו- CD150 מגדירות ארבע אוכלוסיות תאים. MKp מוגדרים כתקליטור CD9בהירCD150+ תאים, MEP מוגדרים כ- CD9עמוםCD150+. המגבלה הגבוהה יותר עבור ביטוי CD9 עבור אוכלוסיית CD150+ העמומהCD9 מבוססת על רמת הביטוי המרבית של CD9 עבור התקליטור150- תאים. לצורך ניתוח, CD9עמוםCD150- תאים (אבות) ו CD9-CD150- (שלילי כפול: DN) היו גם ממוינים. (C)שערי מיון תאים מבוססים על פקדי פלואורסצנטיות מינוס אחד (FMO). (i)בקרת FMO עבור שערי CD9 (ii)בקרת FMO עבור שערי CD150. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: אפיון אוכלוסיות תאי MEP ו- MKP. (A) ניתוח ציטומטריית זרימה של (i) ביטוי CD41, (ii) ביטוי CD42c ותוכן DNA (Hoechst33342) באוכלוסיות התאים D9+CD150עמום (MEP) ו- CD9+CD150בהיר (MKp). (ב)כימות CFU-MK מאוכלוסיות התאים ממוינות. CD9-CD150- (DN), CD9+CD150- (Prog), CD9+CD150עמום (MEP) ו- CD9+CD150בהיר (MKp) אוכלוסיות תאים ממוינות ומצוות בג'ל קולגן בהתאם להוראות היצרן. (ג)כימות BFU-E מאוכלוסיות התאים ממוינות. CD9-CD150- (DN), CD9+CD150- (Prog), CD9+CD150עמום (MEP) ו CD9+CD150בהיר (MKp) תאים היו ממוינים מצופים ג'ל תאית מתיל בהתאם להוראות היצרן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: פוטנציאל בידול של MEP ו-MKP. CD9-CD150-(DN), CD9+CD150-(Prog), CD9+CD150עמום(MEP) ו- CD9+CD150בהיר(MKp) אוכלוסיות תאים היו בתרבית במשך שלושה ימים ב StemSpan בינוני בתוספת SCF (7.5 ננוגרם / מ"ל), Flt-3 (5 ננוגרם / מ"ל), IL-6 (1 ng / mL) ו- TPO (10 ng / mL). (A)תמונות מייצגות צולמו על ידי מיקרוסקופיה ניגודיות פאזה. (B)אחוז CD41+CD42c+ megakaryocytes הוערך אז על ידי ציטומטריית זרימה. N = 3. (C)הרמה הפלואידית של CD41+CD42c+ megakaryocytes הוערך אז עם Hoechst על ידי ציטומטריית זרימה. N = 3. (D)תאים המיוצרים ביום 3 מ- CD9-CD150-(DN), CD9+CD150-(Prog), CD9+CD150עמום(MEP) ו- CD9+CD150 אוכלוסיות תאיםבהירים(MKp) נקצרו ותרבדו במדיום DMEM בתוספת 50 ננוגרם / מ"ל TPO, סרום עגל עוברי 10 % ו 100 U / mL hirudin. (i)שיעור המגקריוציטים היוצרים פרופלטלט בתרבות נקבע על ידי התבוננות מיקרוסקופית. מקרוציטים זוהו על סמך גודלם ו/או נוכחותם של מרחיבים. N = 2. (ii)תמונה מייצגת של מפלג הנושא מגהקריוצייט על ידי מיקרוסקופיה ניגודית פאזה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה המתוארת במאמר זה מאפשרת מיצוי וטיהור של עכבר MEP ו- MKp. פרמטר חשוב באופטימיזציה של הפרוטוקול היה להשיג מספר מספיק של תאים שיהיו תואמים לרוב ההסתה המולקולרית והתאית. הנוהג הכללי של איסוף עצמות עכבר להפקת תאים hematopoietic בדרך כלל מורכב קצירת הן עצם הירך והן השוקה של כל עכבר. עצם האגן, מקור נוסף של חומר hematopoietic, ולכן לעתים קרובות להתעלם. הסיבות לאסוף את סמל הכסל היא הידע הלקוי של האנטומיה הפנימית של שלד העכבר והעובדה שמשתמשים אוספים באופן קלאסי אחורי על ידי חיתוך על פני או קצת מעל ראש עצם הירך. בנוסף, לעתים קרובות מניחים כי תאי מח העצם לא יישטפו מעצם הסמל הכסל ביעילות בשל נוכחות של trabeculae, אשר נעדרים בחלק המרכזי של השוקה ועצם הירך. בפרוטוקול זה, שני חששות אלה מטופלים ויוצגות שיטה סטנדרטית, אמינה וחסכונית בזמן המאפשרת שטיפה נאותה של כל עצמות אחוריות, כולל עצם האגן. בפרט, השימוש בעצם הכסל מניב 105 ± 7 x 106 תאים לעכבר בעוד השיטה הקלאסית בדרך כלל מניבה 42 ± 5 x 106 תאים. יתרון מרכזי בשיטה זו הוא הירידה במספר בעלי החיים הנדרשים להשגת מספר נתון של תאי יעד, ובכך לספק תנאי ניסוי אתיים וחסכוניים יותר. הליך זה חל אפוא גם על כל מחקר הדורש השעיית תאי מח עצם כגון בידוד של תאי גזע hematopoietic10 או ניתוח של התנהגות אב hematopoietic בתנאים מוצקים למחצה11.

מיון תאים באמצעות ציטומטריית זרימה היא טכניקה רבת עוצמה עם יתרון מרכזי במונח של טוהר בהשוואה לטכניקות העשרה מגנטיות, אך התשואה של מיון תאים לאוכלוסיות נדירות יכולה להיות נמוכה יותר מאשר עבור אוכלוסיות שופעות יותר. דלדול מגנטי של תאים לא רצויים מראש היא אפוא שיטה שימושית כדי להגדיל את התדירות של התאים של עניין. כאן, הליך הדלדול המגנטי שונה מהמלצת היצרן ולוקח בחשבון את ההטרוגניות בביטוי של סמני פני השטח המשמשים להסרת התאים החיוביים של שושלת היוחן. עם הפרוטוקולים הטיפוסיים, שלב אחד, תאים חיוביים שושלת עם הביטוי הגבוה ביותר של סמני פני השטח יהיה להרוות במהירות את החרוזים המגנטיים. הם ימנעו את לכידת התאים המסומנים הנותרים על ידי תחרות ועיכוב סטרי, ובכך יפחיתו באופן משמעותי את יעילות הדלדול. כדי לטפל בבעיה זו, תוכנן דלדול מגנטי דו-שלבי המאפשר הסרה רציפה של כל התאים החיוביים לשושלת היוח השנייה, ולכן מאפשר דלדול מחמיר המתאים למיון תאים.

פרמטר קריטי נוסף להשגת דלדול יעיל הוא תנאי התיוג המתאימים של התאים החיוביים לשושלת היוחוסים הלא רצויים. לכן, טיטציה של הנוגדנים עברה אופטימיזציה ספציפית. שימוש בריכוזים גבוהים יותר של נוגדנים יגרום לרוזים מוגזמים של החרוזים המגנטיים ולדלדול לא ספציפי של תאים שליליים של שושלת היוחוס. השימוש באוכלוסיות תא MEP ו- MKP מטוהרות מאוד הוא כלי חשוב בחקר megakaryopoiesis. על מנת להדגיש את המנגנונים השולטים בתהליך זה, המחקר חקר את תפקידו של microenvironment הסלולר והראה כי אוכלוסיית תאי תאי כבד עוברי תתמוך בהבחנה של MKp10. האוכלוסייה ממוינת יכולה לשמש גם עבור ניתוחים מבוססי תאים מולקולריים או יחידים. זה יהיה רלוונטי במיוחד בהתחשב ב הרעיון המתהווה של HSC מוטה מגה-קוטבית12,13,14. הייצור של megakaryocyte ישירות מאוכלוסיית HSC ללא יצירת צאצא דו-פונטי יהיה מסלול חירום בתגובה ללחץ13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות למוניק פרוינד, קתרין זיסל וקאטי על הסיוע הטכני. עבודה זו נתמכה על ידי ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), ועל ידי גרנט ANR-17-CE14-0001-01 כדי Henri.de לה. סאל.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
21-gauge needles BD Microlance 301155
7AAD Sigma-Aldrich A9400
Antibody Gr-1-biotin eBioscience 13-5931-85 Magnetic depletion
Antibody B220-biotin eBioscience 13-0452-85 Magnetic depletion
Antibody Mac-1-biotin eBioscience 13-0112-85 Magnetic depletion
Antibody CD3e-biotin eBioscience 13-0031-85 Magnetic depletion
Antibody CD4-biotin eBioscience 13-9766-82 Magnetic depletion
Antibody CD5-biotin eBioscience 13-0051-85 Magnetic depletion
Antibody CD8a-biotin eBioscience 13-0081-85 Magnetic depletion
Antibody TER119-biotin eBioscience 13-5921-85 Magnetic depletion
Antibody CD127-biotin eBioscience 13-1271-85 Magnetic depletion
Antibody CD45-FITC eBioscience 11-0451-85 Cell sorting
Antibody CD45-PE eBioscience 12-0451-83 Cell sorting
Antibody TER119-APC eBioscience 17-5921-83 Cell sorting
Antibody CD45-PECy7 eBioscience 25-0451-82 Cell sorting
Antibody CD45-biotin eBioscience 13-0451-85 Cell sorting
Antibody CD9-FITC eBioscience 11-0091-82 Cell sorting
Antibody  c-kit-APC eBioscience 17-1171-83 Cell sorting
Antibody Sca-1-PE eBioscience 12-5981-83 Cell sorting
Antibody CD16/32-PE eBioscience 12-0161-83 Cell sorting
Antibody CD150-PECy7 eBioscience 25-1502-82 Cell sorting
Culture medium StemSpan-SFEM Stemcell technologies #09650
Dissection pad Fisher Scientific 10452395
DPBS Life Technologies 14190-094
Ethanol vWR Chemicals 83813.360
Forceps Euronexia P-120-AS
Glass pasteur pipette Dutscher 42011
Magnet :  DynaMag-5 Thermo Fisher Scientific 12303D
Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG Thermo Fisher Scientific 11035
Megacult Stemcell technologies #04970
MethoCult SF M3436 Stemcell technologies #03436
Newborn Calf Serum Dutscher 50750-500
Red Cell Lysis solution BD Bioscience 555899
Scalpels Fisher Scientific 12308009
Scissors Euronexia C-165-ASB
Sterile 1 mL syringes BD Bioscience 303172
Sterile 15mL tubes Sarstedt 62.554.502
Sterile 5mL polypropylene tubes Falcon 352063
Sterile 5mL polystyrene tubes Falcon 352054
Sterile tubes with 70µm cell strainer cap Falcon 352235
Sterile petri dish Falcon 353003
Streptavidin-APC-Cy7 BD Biosciences 554063 Cell sorting
Tube roller Benchmark Scientific R3005

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaushansky, K. Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis. Blood. 111 (3), 981-986 (2008).
  2. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).
  3. Debili, N., et al. Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow. Blood. 88 (4), 1284-1296 (1996).
  4. Forsberg, E. C., Serwold, T., Kogan, S., Weissman, I. L., Passegué, E. New evidence supporting megakaryocyte-erythrocyte potential of flk2/flt3+ multipotent hematopoietic progenitors. Cell. 126 (2), 415-426 (2006).
  5. Vannucchi, A. M., et al. Identification and characterization of a bipotent (erythroid and megakaryocytic) cell precursor from the spleen of phenylhydrazine-treated mice. Blood. 95 (8), 2559-2568 (2000).
  6. Pronk, C. J., et al. Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy. Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).
  7. Nakorn, T. N., Miyamoto, T., Weissman, I. L. Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (1), 205-210 (2003).
  8. Ng, A. P., et al. Characterization of thrombopoietin (TPO)-responsive progenitor cells in adult mouse bone marrow with in vivo megakaryocyte and erythroid potential. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2364-2369 (2012).
  9. Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
  10. Brouard, N., et al. A unique microenvironment in the developing liver supports the expansion of megakaryocyte progenitors. Blood Advances. 1 (21), 1854-1866 (2017).
  11. Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. Megakaryocyte culture in 3D methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement. Journal of Visualized Experiments:JOVE. , (2021).
  12. Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
  13. Haas, S., et al. Inflammation-driven fast-track differentiation of HSCs into the megakaryocytic lineage. Experimental Hematology. 42 (8), 14 (2014).
  14. Shin, J. Y., Hu, W., Naramura, M., Park, C. Y. High c-Kit expression identifies hematopoietic stem cells with impaired self-renewal and megakaryocytic bias. The Journal of Experimental Medicine. 211 (2), 217-231 (2014).

Tags

ביולוגיה גיליון 171

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors
Posted by JoVE Editors on 07/28/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors. A figure was updated.

Figure 2 was updated from:

Figure 2
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 2
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. Please click here to view a larger version of this figure.

בידוד אבות מקרוציטים עכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kimmerlin, Q., Tavian, M., Gachet,… More

Kimmerlin, Q., Tavian, M., Gachet, C., Lanza, F., Brouard, N. Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors. J. Vis. Exp. (171), e62498, doi:10.3791/62498 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter