תרבות Megakaryocyte בהידרוג'ל מבוסס מתילצלולוז תלת מימדי לשיפור התבגרות התאים וחקר ההשפעה של נוקשות וכליאה
Summary
כיום ידוע כי הסביבה התלת ממדית של התאים יכולה למלא תפקיד חשוב בהתנהגותם, בהבשלתם ו/או בבידולם. פרוטוקול זה מתאר מודל תרבית תאים תלת מימדי שנועד לחקור את ההשפעה של בלימה פיזית ואילוצים מכניים על megakaryocytes.
Abstract
הסביבה 3D המוביל הן כליאה ואילוצים מכניים מזוהה יותר ויותר כגורם מכריע חשוב של התנהגות התא. לפיכך, פותחה תרבות תלת-ממד כדי לגשת טוב יותר למצב ה-in vivo. Megakaryocytes להבדיל גזע hematopoietic ותאי אבות (HSPCs) במח העצם (BM). BM היא אחת הרקמות הרכות ביותר של הגוף, מרותק בתוך העצם. העצם להיות מתרחב בצורה גרועה בסולם התא, megakaryocytes כפופים במקביל נוקשות חלשה וכליאה גבוהה. פרוטוקול זה מציג שיטה לשחזור של שושלת העכבר שלילית (Lin-) HSPCs על ידי מיון אימונו-מגנטי ואת הבידול שלהם לתוך megakaryocytes בוגר במדיום 3D המורכב methylcellulose. Methylcellulose אינו מגיב כלפי megakaryocytes ואת נוקשותו ניתן להתאים לזה של מח עצם נורמלי או מוגבר כדי לחקות מח פירוטי פתולוגי. התהליך לשחזור megakaryocytes עבור ניתוחי תאים נוספים מפורט גם בפרוטוקול. למרות הרחבת proplatelet נמנע בתוך המילייה 3D, הוא מתואר להלן כיצד resuspend megakaryocytes במדיום נוזלי לכמת את יכולתם להרחיב את הנפצים. Megakaryocytes גדל הידרוג’ל 3D יש יכולת גבוהה יותר ליצור מפיץ לעומת אלה גדלו milieu נוזלי. תרבות תלת-ממדית זו מאפשרת i) להבדיל בין אבות לכיוון megakaryocytes להגיע למצב התבגרות גבוה יותר, ii) כדי לשחזר פנוטיפים שניתן לראות ב vivo אבל ללכת מעיניו בתרבויות נוזליות קלאסיות, ו – iii) כדי ללמוד מסלולי טרנסאדוקציה המושרה על ידי רמזים מכניים המסופקים על ידי סביבה 3D.
Introduction
תאים בגוף חווים מיקרו-סביבה תלת-ממדית מורכבת והם נתונים ליחסי הגומלין בין רמזים כימיים ומכנופיזיים כולל נוקשות מהרקמה וכליאה עקב תאים שכנים ומטריצת 1,2,3. החשיבות של נוקשות וכליאה להתנהגות התא הוכרה רק בעשורים האחרונים. בשנת 2006, העבודה המכוננת של אנגלר ואח ‘4 הדגישה את החשיבות של הסביבה המכנית לבידול תאים. המחברים הדגימו כי וריאציה נוקשות מצע התא הביאה לכיוון של תאי גזע לכיוון שושלות בידול שונות. מאז, ההשפעה של רמזים מכניים על גורל התא והתנהגות הפך מוכר יותר ויותר ונלמד. למרות היותו אחד הרקמות הרכות ביותר של האורגניזם, מוח העצם יש ארגון מבני 3D כי הוא מוגבל בתוך העצם. נוקשות מח העצם, אם כי מבחינה טכנית קשה למדוד במדויק, מוערך לשקר בין 15 ל 300 Pa 5,6. בתוך הסטרומה, התאים מוגבלים זה לזה. בנוסף, רובם נודדים לכיוון כלי הסינוסואידים כדי להיכנס למחזור הדם. תנאים אלה יוצרים אילוצים מכניים נוספים על תאים סמוכים, אשר צריכים להסתגל לכוחות אלה. רמזים מכניים מייצגים פרמטר חשוב שהשלכותיו על בידול מגה-קריוציטים ויצירת פרופלטלטים נחקרו רק לאחרונה. למרות megakaryocytes יכול להבדיל במבחנה בתרבות נוזלית מסורתית, הם לא מגיעים את מידת ההתבגרות שנצפו ב vivo, בין היתר בשל היעדר רמזים מכניים מסביבה 3D 7. גידול אבות המוטמעים הידרוג’ל מביא רמזים מכניים 3D כי הם חסרים מילייה נוזלי.
הידרוג’לים היו בשימוש נרחב במשך כמה עשורים בתחום ההמטולוגי, במיוחד כדי לגדל תאים במושבה ויוצרים התקפות כדי לכמת אבות hematopoietic. עם זאת, הידרוג’לים כאלה שימשו לעתים רחוקות כדי לחקור את ההשפעה הביולוגית של הסביבה המכנית 3D על התבגרות ובידול של תאים hematopoietic. במהלך השנים האחרונות המעבדה שלנו פיתחה מודל תרבות תלת מימד באמצעות הידרוג’ל מבוסס מתיל צלולוז 8. ג’ל פיזי לא פעיל זה הוא כלי שימושי כדי לחקות את האילוצים הפיזיים של הסביבה megakaryocyte המקומית. הוא נגזר תאית על ידי החלפת שאריות הידרוקסיל (-OH) על ידי קבוצות מתאוקסיד (-OCH3). הן מידת החלפת המתיל והן ריכוז המתיל צלולוז קובעים את נוקשות ההידרוגל ברגע שהוא מתמזג. במהלך שלב הפיתוח של טכניקה זו, הוכח כי מודולוס של יאנג בטווח של 30 עד 60 Pa הוא נוקשות הג’ל האופטימלית לצמיחת megakaryocyte 9.
הפרוטוקול הבא מתאר שיטה לגדל אבות מקרוציטים עכבר בהידרוג’ל מתיל צלולוז תלת-ממדי. הוכח בעבר כי בהשוואה לתרבות נוזלית סטנדרטית, תרבות הידרוג’ל זו מגדילה את מידת הפוליטואידיזציה של מגהקריוציטים, משפרת את ההבשלה ואת הארגון התאי, ומגבירה את הקיבולת של מגהקריוציטים להרחיב את ההפצפות לאחר תפירה מחדש במדיום נוזלי 9. כתב יד זה מתאר בפירוט את הפרוטוקול לבידוד של תאי לין עצם העכבר והטבעתם בהידרוג’ל מתילצלולוז לתרבות תלת-ממדית, כמו גם לכימות יכולתם לייצר פרופלטלטים והתאוששות התאים עבור ניתוחים נוספים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעשור הקודם, המכנוביולוגיה עוררו יותר ויותר עניין בתחומים רבים של ביולוגיה. כיום מקובל להכיר בכך שהסביבה המכנית המקיפה את התאים ממלאת תפקיד בהתנהגותם, תוך הדגשת החשיבות ללמוד כיצד מגהקריוציטים חשים ומגיבים לרמזים מכניים חוץ-תאיים. זה מאתגר למדוד במדויק את נוקשות רקמת מח העצם במקום<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לפביאן פרטוי ואלישיה אגילר שפיתחו לראשונה טכניקה זו במעבדה, כמו גם דומיניק קולין (מכון צ’ארלס סאדרון – שטרסבורג) שאפיינו את המאפיינים הצמיגים של הידרוג’ל מתיל צלולוז. עבודה זו נתמכה על ידי ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) ועל ידי מענק ARN (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). ג’ולי בושר היא מקבלת פונדציה לשפוך la Recherche Médicale (מספר מענק FRM FDT202012010422).
Materials
| 18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
| 25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
| 4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
| EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
| Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
| Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
| Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
| Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
| Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |
References
- Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Wang, C., et al. Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels. Tissue Engineering Part A. , (2020).
- Doyle, A. D., Yamada, K. M. Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments. Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).
- Shin, J. -. W., et al. Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells. Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).
- Boscher, J., Guinard, I., Eckly, A., Lanza, F., Léon, C. Blood platelet formation at a glance. Journal of cell science. 133 (20), (2020).
- Aguilar, A., Boscher, J., Pertuy, F., Gachet, C., Léon, C. Three-dimensional culture in a methylcellulose-based hydrogel to study the impact of stiffness on megakaryocyte differentiation. Methods in Molecular Biology. 1812, 139-153 (2018).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128, 2022-2032 (2016).
- Hitchcock, I. S., Kaushansky, K. Thrombopoietin from beginning to end. British Journal of Haematology. 165 (2), 259-268 (2014).
- Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function. American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).
- Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R. Mechanics of intact bone marrow. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 50, 299-307 (2015).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
