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Cancer Research

रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनॉइड का उपयोग करके विट्रो परख में उच्च-थ्रूपुट

Published: June 14, 2021 doi: 10.3791/62668
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 2, 2, 3, 2, 2
1FUJIFILM Wako Bio Solutions Corporation, 2Medical-Industrial Translational Research Center, Fukushima Medical University, 3Department of Bioregulation and Pharmacological Medicine, Fukushima Medical University

Summary

एक बेहद सटीक इन विट्रो हाई-थ्रूपुट परख प्रणाली को कैंसर के ऊतकों के समान रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनॉइड (पीडीओ) का उपयोग करके कैंसर रोधी दवाओं का मूल्यांकन करने के लिए विकसित किया गया था, लेकिन 96-अच्छी तरह से और 384-अच्छी प्लेटों के साथ इन विट्रो हाई-थ्रूपुट परख प्रणालियों के लिए अनुपयुक्त हैं।

Abstract

रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनॉइड (पीडीओ) को पारंपरिक सेल कल्चर मॉडल की तुलना में रोग की बेहतर प्रजनन क्षमता के साथ एक प्रीक्लीनिकल कैंसर मॉडल होने की उम्मीद है। पीडीओ को ट्यूमर ऊतक के वास्तुकला और कार्य को सही और कुशलता से पुनः प्राप्त करने के लिए विभिन्न प्रकार के मानव ट्यूमर से सफलतापूर्वक उत्पन्न किया गया है। हालांकि, पीडीओ एंटीकैंसर दवाओं का मूल्यांकन करते समय 96-अच्छी तरह से या 384-अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग करके इन विट्रो हाई-थ्रूपुट परख प्रणाली (एचटीएस) या सेल विश्लेषण के लिए अनुपयुक्त हैं क्योंकि वे आकार में विषम हैं और संस्कृति में बड़े समूह बनाते हैं। ये संस्कृतियां और परख ट्यूमर ऊतक मचान बनाने के लिए मैट्रिक्स जैसे एक्सपेरि़लर मैट्रिस का उपयोग करते हैं। इसलिए, पीडीओ के पास कम थ्रूपुट और उच्च लागत है, और एक उपयुक्त परख प्रणाली विकसित करना मुश्किल हो गया है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, एंटीकैंसर दवाओं और इम्यूनोथेरेपी की शक्ति का मूल्यांकन करने के लिए पीडीओ का उपयोग करके एक सरल और अधिक सटीक एचटीएस स्थापित किया गया था। एक इन विट्रो एचटीएस बनाया गया था जो 384-वेल प्लेटों में सुसंस्कृत ठोस ट्यूमर से स्थापित पीडीओ का उपयोग करता है। 96-वेल प्लेटों में सुसंस्कृत पीडीओ का उपयोग करके प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करने के लिए एंटीबॉडी-निर्भर सेलुलर साइटोटॉक्सिकिटी गतिविधि के मूल्यांकन के लिए एक एचटीएस भी विकसित किया गया था।

Introduction

मानव कैंसर सेल लाइनों को व्यापक रूप से कैंसर के जीव विज्ञान का अध्ययन करने और कैंसर रोधी एजेंटों का मूल्यांकन करने के लिए स्वीकार किया जाता है। हालांकि, ये सेल लाइनें जरूरी नहीं कि उनके स्रोत ऊतक की मूल विशेषताओं को संरक्षित करें क्योंकि उनकी आकृति विज्ञान, जीन उत्परिवर्तन और जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल लंबी अवधि में संस्कृति के दौरान बदल सकती है। इसके अलावा, इनमें से अधिकांश सेल लाइनों को मोनोलेयर में सुसंस्कृत किया जाता है या मुरीन ज़ेनोग्रॉफ्ट के रूप में उपयोग किया जाता है, जिनमें से कोई भी शारीरिक रूप से ट्यूमर ऊतक1,2का प्रतिनिधित्व नहीं करता है। इस प्रकार, कैंसर रोधी एजेंटों की नैदानिक प्रभावकारिता कैंसर सेल लाइनों में देखी गई वैसी नहीं हो सकती है। इसलिए, इन विट्रो सिस्टम, जैसे कि रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ज़ेनोग्राफेफ्ट या रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनॉइड (पीडीओ) और ट्यूमर स्फेरोइड मॉडल का उपयोग करके पूर्व वीवो परख विकसित की गई है। बढ़ते सबूत पता चलता है कि इन मॉडलों को सीधे इसी कैंसर के ऊतकों के लिए तुलनीय जा रहा द्वारा कैंसर रोधी एजेंटों के लिए रोगियों की प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी । ये इन इन विट्रो सिस्टम विभिन्न ट्यूमर ऊतक प्रकारों के लिए स्थापित किए गए हैं, और दवा स्क्रीनिंग के लिए संबद्ध उच्च-थ्रूपुट परख प्रणाली (एचटीएस) भी विकसित की गई है3,4,5,6,7। रोगियों या रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ज़ेनोग्राफ्ट से प्राप्त प्राथमिक ट्यूमर की विषम पूर्व वीवो ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों ने हाल के वर्षों में संस्कृति की आसानी और स्ट्रोमल ऊतक8, 9, 10में कोशिकाओं की जटिलता को बनाए रखने की क्षमता के कारण काफीकर्षणप्राप्त किया है। इन मॉडलों से कैंसर के जीव विज्ञान की समझ में वृद्धि होने और विट्रो मेंदवा प्रभावकारिता के मूल्यांकन में मदद मिलने की उम्मीद है ।

उपन्यास पीडीओ की एक श्रृंखला हाल ही में फुकुशिमा ट्रांसलेशनल रिसर्च प्रोजेक्ट के तहत एफ-पीडीओ के रूप में नामित विभिन्न प्रकार के ट्यूमर ऊतकों से बनाई गई थी । पीडीओ बड़े सेल क्लस्टर बनाते हैं , जिनमें स्रोत ट्यूमर के समान आकृति विज्ञान होता है और इसे छहमहीनेसे अधिक समय तक सुसंस्कृत किया जा सकता है । तुलनात्मक हिस्टोलॉजी और व्यापक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषणों से पता चला है कि पीडीओ की विशेषताएं संस्कृति की स्थितियों के तहत लंबे समय तक विकास के बाद भी उनके स्रोत ट्यूमर ऊतकों के करीब हैं । इसके अलावा, 96-वेल और 384-वेल प्लेटों में प्रत्येक प्रकार के पीडो के लिए एक उपयुक्त एचटीएस स्थापित किया गया था। इन परख का उपयोग कई आणविक लक्षित एजेंटों और एंटीबॉडी का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। यहां, एंडोमेट्रियल कैंसर के लिए उपयोग किए जाने वाले मानक कीमोथेरेपी (पैकिटैक्सेल और कार्बोप्लैटिन) का मूल्यांकन एक रोगी से प्राप्त एफ-पीडीओ का उपयोग करके किया गया था, जिन्होंने paclitaxel और कार्बोप्लैटिन का जवाब नहीं दिया था। तदनुसार, इस पीडीओ के खिलाफ paclitaxel और कार्बोप्लैटिन की सेल विकास निरोधात्मक गतिविधि कमजोर थी (आईसी50:>10 माइक्रोनएम)। इसके अलावा, पिछले शोध में बताया गया है कि कीमोथैरेपी एजेंटों और आणविक लक्षित एजेंटों के लिए कुछ एफ-पीडीओ की संवेदनशीलता नैदानिक प्रभावकारिता11,12, 13के अनुरूप है। अंत में, कैंसर रोधी एजेंटों के कारण पीडीओ की उच्च-क्रम संरचना में परिवर्तनों का विश्लेषण त्रि-आयामी कोशिका विश्लेषण प्रणाली12,13का उपयोग करके किया गया था। पीडो-आधारित एचटीएस का उपयोग करके कैंसर रोधी एजेंटों के मूल्यांकन के परिणाम इन एजेंटों के लिए प्राप्त नैदानिक परिणामों के साथ तुलनीय हैं। यहां, एक प्रोटोकॉल एक सरल और अधिक सटीक एचटीएस के लिए प्रस्तुत किया जाता है जिसका उपयोग पीडो मॉडल का उपयोग करके एंटीकैंसर एजेंटों और इम्यूनोथेरेपी की शक्ति का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।

Protocol

मानव-व्युत्पन्न सामग्रियों से जुड़े सभी प्रयोग हेलसिंकी की घोषणा के तहत किए गए थे और फुकुशिमा मेडिकल यूनिवर्सिटी की आचार समिति (अनुमोदन संख्या १९५३ और २१९२; अनुमोदन तिथियां क्रमशः 18 मार्च, २०२०, और 26 मई, २०१६) द्वारा पहले से अनुमोदित किए गए थे । लिखित सूचित सहमति उन सभी रोगियों से प्राप्त की गई थी जिन्होंने इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले नैदानिक नमूने प्रदान किए थे।

1. पीडीओ की संस्कृति

नोट: एफ-पीडीओ सेल क्लस्टर बनाते हैं जो विभिन्न प्रकार के विषम मॉर्फोलोजी प्रदर्शित करते हैं और निलंबन संस्कृति(चित्रा 1) में बढ़ते हैं। इसके अलावा, एफ-पीडीओ को 6 महीने से अधिक समय तक सुसंस्कृत किया जा सकता है और भविष्य के उपयोग के लिए क्रायोप्रीड किया जा सकता है।

  1. संग्रहीत पीडीओ का विगलन (0 दिन)
    1. गल और बीज पीडीओ (जैसे, RLUN007, फेफड़े adenocarcinoma) दिन 0(चित्रा 1)पर ) । सबसे पहले, पीडीओ के लिए माध्यम के 15 एमएल जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें) जिसमें बी-27 पूरक का 1% और एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर का 30 एनजी/एमएल एक बाँझ 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में शामिल है।
    2. तरल नाइट्रोजन भंडारण से जमे हुए शीशी को हटाने के बाद, धीरे से 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में पीडीओ आंदोलन। इसके बाद, पानी के स्नान से शीशी निकालें, 70% इथेनॉल के साथ शीशी को मिटा दें, और फिर शीशी को जैविक सुरक्षा कैबिनेट में ले जाएं।
    3. शीशी की सामग्री को पीडीओ के लिए माध्यम के 15 एमएल युक्त ट्यूब में स्थानांतरित करें। पीडीओ और माध्यम को धीरे-धीरे 3 एमएल ट्रांसफर पिपेट के साथ पांच बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं। अपकेंद्रित्र 200 x ग्राम पर 3 मिनट के लिए ~ 25 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब और सुपरनैंट त्यागें। ताजा माध्यम के 5 एमएल में पीडो गोली को फिर से खर्च करें और कोमल पिपटिंग के साथ 25 सेमी2 फ्लास्क (सामग्री की तालिकादेखें) में स्थानांतरित करें। अंत में, 5% सीओ2में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में पीडीओ संस्कृति।
  2. प्रति सप्ताह दो बार माध्यम बदलें (दिन 3-7)। सेल क्लस्टर को उपजी करने के लिए पीडो निलंबन को सेंट्रलाइज करें, और माध्यम के 4 एमएल (80% वॉल्यूम) को बदल दें। कोशिकाओं को ताजा माध्यम में पुनर्व्यापित करें।
    नोट: RLUN007 के बहुमत सेल समूहों के रूप में दिखाई देते हैं जो व्यास में 100-500 माइक्रोन हैं। जब मध्यम में फिनॉल लाल रंग का रंग पीला हो जाता है जैसा कि चित्र 1 एमें दिखाया गया है, तो माध्यम को अधिक बार बदलें। यदि प्रतिस्थापन के बाद दिन में मध्यम पीला हो जाता है, और प्रत्येक सेल क्लस्टर बड़े समूहों को बनाने के लिए विलीन हो जाता है जो व्यास में > 500 माइक्रोन हैं, 1:2 के विभाजन अनुपात में पारित होते हैं।
  3. पीडीओ की उपसंस्कृति (दिन 8-28)
    नोट: वास्तव में एकल कोशिकाओं की संख्या को मापने की कठिनाई को देखते हुए, पारित होने का समय एक उपयुक्त सेल क्लस्टर घनत्व और अपकेंद्रित्र(चित्रा 1B)के बाद पीडीओ गोली के आकार के आधार पर निर्धारित किया जाता है । RLUN007 के मामले में, पीडो गोली की मात्रा विगलन के लगभग 2 सप्ताह बाद 30 माइक्रोल (25 सेमी2 फ्लास्क में संतृप्त घनत्व) तक पहुंच जाती है।
    1. एक 25 सेमी2 फ्लास्क से दो 25 सेमी2 फ्लास्क (पी 1) तक स्थानांतरण के लिए, पीडो निलंबन को लगभग 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर एक अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र में स्थानांतरित करें। पीडो गोली की मात्रा का अनुमान लगाएं, और सुपरनेट को त्यागें। ताजा माध्यम के 5 एमएल में 5 एमएल पिपेट का उपयोग करके पीडो पेलेट को फिर से रीसुस्पेंड करें। पिपेट धीरे से ऊपर और नीचे कम गति से पांच बार । फिर, पीडो सस्पेंशन (2.5 एमएल) की मात्रा का आधा हिस्सा दो फ्लास्क में स्थानांतरित करें, और प्रत्येक फ्लास्क में 2.5 एमएल ताजा माध्यम जोड़ें। संस्कृति 5% सीओ2में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं।
    2. दो 25 सेमी2 फ्लास्क से एक 75 सेमी2 फ्लास्क (पी 2) के हस्तांतरण के लिए, पीडो निलंबन को दो फ्लास्क से दो सेंट्रलीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें और पीडो को लगभग 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। इसके बाद, पीडो पेलेट की मात्रा का अनुमान लगाएं और ताजा माध्यम (प्रति ट्यूब) के 2.5 एमएल में गोली को फिर से खर्च करें। इसके बाद पीडो सस्पेंशन को एक ट्यूब में मिलाकर दूसरे में मिलाकर 75 सेमी2 फ्लास्क में ट्रांसफर करें जिसमें 10 एमएल फ्रेश मीडियम होता है । संस्कृति 5% सीओ2में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं। उप सुसंस्कृत पीडीओ को दो 25 सेमी2 फ्लास्क से एक 75 सेमी2 फ्लास्क में स्थानांतरित करें लगभग 1 सप्ताह पहले पारित होने के बाद(चित्रा 1C)।

2. विकास अवरोध एचटीएस

नोट: पीडीओ के खिलाफ कैंसर रोधी एजेंटों की वृद्धि निरोधात्मक गतिविधि का मूल्यांकन इंट्रासेलुलर एटीपी सामग्री को मापकर किया जाता है, जैसा कि चित्र 2में दिखाया गया है । यह कदम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल व्यवहार्यता परख किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके किया जाता है।

  1. 0 दिन पर, संस्कृति पीडीओ (उदाहरण के लिए, RLUN007) फ्लास्क में जब तक सेल समूहों की पर्याप्त संख्या परख के लिए उपलब्ध हैं । सीडिंग से एक दिन पहले पीडो सस्पेंशन को 75 सेमी2 फ्लास्क से 15 एमएल ट्यूब में ट्रांसफर करें और पीडो पैलेट वॉल्यूम को मापने के लिए 2 मिनट के लिए 200 एक्स जी पर सेंट्रलाइज करें। इसके बाद पीडो पेलेट को फ्रेश मीडियम के 15 एमएल में रीस्सपेंड करें और उसे वापस 75 सेमी2 फ्लास्क में ट्रांसफर करें। संस्कृति 5% सीओ2में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं।
    नोट: आवश्यक पीडो गोली की मात्रा प्रत्येक पीडो के कमजोर पड़ने की दर और परख के लिए उपयोग की जाने वाली 384-अच्छी प्लेटों की संख्या पर निर्भर करती है। RLUN007 के लिए, दस 384-अच्छी प्लेटों में सीडिंग के लिए सेल पैलेट वॉल्यूम का 200 माइक्रोन आवश्यक है।
  2. 1 दिन (माध्यम बदलने के बाद 24 घंटे), सेल विखंडन और फैलाव उपकरण (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके पीडीओ को 70 माइक्रोन मेश फिल्टर वाले फ़िल्टर धारक के साथ कीमा बनाता है। इसके बाद पीडो सस्पेंशन के 15 एमएल को 10x तक पतला करें। पीडो सस्पेंशन के बीज 40 माइक्रोल को सेल सस्पेंशन डिस्पेंसर (सामग्रियों की टेबलदेखें) का उपयोग करके 384-वेल अल्ट्रा-लो अटैचमेंट स्फेरॉइड (राउंड-बॉटम) माइक्रोप्लेट (सामग्रियों की टेबलदेखें) में।
    नोट: सेल समूहों कोमा बनाने के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल विखंडन और फैलाव उपकरण (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
  3. सीडिंग (दिन 2) के बाद 24 घंटे में, एक तरल हैंडलर (सामग्रीकी तालिका देखें) का उपयोग करके 20 माइक्रोन से 1.0 एनएम (10 सीरियल कमजोर पड़ने) की अंतिम एकाग्रता पर्वतमाला पर परीक्षण एजेंट समाधानों के 0.04 माइक्रोन के साथ पीडीओ का इलाज करें।
  4. 8 दिन (परीक्षण पदार्थ उपचार के बाद 144 घंटे), परीक्षण कुओं में रीएजेंट को मापने वाले इंट्रासेलुलर एटीपी जोड़ें। 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मिक्सर और इनक्यूबेट का उपयोग कर प्लेटों को मिलाएं। प्लेट रीडर का उपयोग करके इंट्रासेलुलर एटीपी सामग्री को ल्यूमिनेसेंस के रूप में मापें (सामग्री की तालिकादेखें)।
  5. कोशिका व्यवहार्यता की गणना करने के लिए, परीक्षण कुओं में एटीपी की मात्रा को उस द्वारा वाहन युक्त नियंत्रण कुओं में विभाजित करें, पृष्ठभूमि घटाया गया। 6 दिनों में वृद्धि दर की गणना करने के लिए, वाहन नियंत्रण कुओं में एटीपी की मात्रा को उसके द्वारा वाहन नियंत्रण कुओं में 24 घंटे सीडिंग के बाद विभाजित करें।
  6. जैविक डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर (सामग्रीकी तालिका देखें) का उपयोग करके खुराक-प्रतिक्रिया घटता से वक्र (AUC) मूल्यों के तहत 50% निरोधात्मक एकाग्रता(आईसी 50)और क्षेत्र की गणना करें। जेड फैक्टर एक आयामहीन पैरामीटर है जो 1 (अनंत पृथक्करण) से लेकर <0 तक है, Z = 1 के रूप में परिभाषित - (3σc + + 3σc-) / |μc+- μc-|, जहां σc +, σc-, μc +, और μc- मानक विचलन (σ) और उच्च (सी +) और कम (सी−) के औसत (μ) क्रमशः14,हैं।

3. विकास निषेध के लिए सेल पिकिंग और इमेजिंग सिस्टम के साथ एचटीएस

नोट: यदि प्रोटोकॉल 2 का उपयोग करके डेटा में एक बड़ा विचलन (जब परता पर भिन्नता [सीवी] का गुणांक 20% से अधिक है, तो चयनित आकार के पीडीओ को सेल पिकिंग और इमेजिंग सिस्टम(चित्रा 2)का उपयोग करके 96-अच्छी तरह से या 384-अच्छी तरह से प्लेटों में वरीयता दी जा सकती है। प्रोटोकॉल वही है जो पिछले खंड में चरण 2.1 और 2.2 में वर्णित है। यह कदम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल पिकिंग और इमेजिंग सिस्टम (सामग्रियों की तालिकादेखें) का उपयोग करके किया जाता है।

  1. 1 दिन, मध्यम के ४० माइक्रोल के साथ एक ३८४-अच्छी तरह से अल्ट्रा कम अटैचमेंट स्पॉयरॉइड माइक्रोप्लेट सेट करें/
  2. हवा के बुलबुले को हटाने के लिए 2 मिनट के लिए 1,500 x ग्राम पर संस्कृति माध्यम और अपकेंद्रित्र के 6 एमएल के साथ पिकिंग चैंबर (सामग्रीकी तालिका देखें) भरें। पीडीओ को माध्यम (पीडीओ पैलेट वॉल्यूम, 4 माइक्रोन) में पिकिंग चैंबर में जोड़ें और सिस्टम पर सेट करें।
  3. कम से कम 1 मिनट के लिए कक्ष खड़े हो जाओ, फैलाव के बाद, ताकि सेल समूहों कक्ष के नीचे व्यवस्थित; फिर, कक्ष की स्कैनिंग करें।
  4. सेल क्लस्टर के स्वचालित चयन के लिए सिस्टम पर 140-160 माइक्रोन (क्षेत्र 15,386-20,000 माइक्रोन2)के लिए उठा आकार निर्धारित करें। इसके बाद, स्कैन की गई छवियों पर चयनित सेल समूहों की गुणवत्ता की जांच करें और गंतव्य प्लेट में पिकिंग टिप्स (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके प्रति अच्छी तरह से दस सेल क्लस्टर स्थानांतरित करें।
  5. आगे चरण 2.3 से प्रोटोकॉल चरणों का प्रदर्शन करें।

4. एंटीबॉडी पर निर्भर सेलुलर साइटोटॉक्सिसिटी के लिए एचटीएस

नोट: यह कदम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणाली (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके किया जाता है, जो एक विद्युत बाधा मापने वाला उपकरण है। इसका उपयोग मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं(चित्र 3)के साथ एंटीबॉडी-निर्भर सेलुलर साइटोटॉक्सिकिटी (एडीसीसी) द्वारा पीडीओ के साइटोलिसिस का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है। एनके कोशिकाओं को परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से एनके सेल उत्पादन किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके उत्पादित किया जाता है, निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए।

  1. एडीसीसी गतिविधि का मापन
    1. 0 दिन पर, कोट एक ९६-अच्छी तरह से थाली (सामग्री की मेजदेखें) 10 μg के ५० μL के साथ/
    2. 1 दिन, फाइब्रोनेक्टिन समाधान को हटाने के बाद, पृष्ठभूमि बाधा को मापने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम के 50 माइक्रोन जोड़ें।
    3. सीडिंग से पहले, पीडीओ (आरएलयू007: 75 सेमी2 फ्लास्क में पीडीओ पेलेट के 100 माइक्रोन) और पीडीओ को तितर-बितर करने के लिए37 डिग्री सेल्सियस पर एक सीओ 2 इनक्यूबेटर में सेल कल्चर वियोजन रिएजेंट (सामग्रीकी तालिका देखें) के 5 एमएल जोड़ें। ट्राइप्सिनाइजेशन को रोकने के लिए, मीडियम, सेंट्रलाइज के 5 एमएल जोड़ें और डिससोजेशन रीएजेंट को हटा दें। पीडीओ को ताजा माध्यम के साथ कुल्लाएं और 40 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से फ़िल्टर करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
    4. सेल वायबिलिटी एनालाइजर (सामग्रीकी तालिका देखें) का उपयोग करके कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
    5. पीडो निलंबन को जलाशय में स्थानांतरित करें और मल्टी-चैनल पिपेटर का उपयोग करके मिलाएं। एक ९६-अच्छी थाली में 5 x 104 कोशिकाओं/अच्छी तरह से कुओं में पीडो निलंबन जोड़ें । प्रत्येक अच्छी तरह से 100 माइक्रोन की अंतिम मात्रा होती है। फिर, प्लेट को 30 मिनट के लिए लगभग 25 डिग्री सेल्सियस पर जैविक सुरक्षा कैबिनेट में रखें।
    6. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर सीओ2 इनक्यूबेटर में यंत्र में स्थानांतरित करें। बाधा में रिकॉर्ड परिवर्तन सेल सूचकांक के रूप में हर 15 मिनट संकेतों ।
    7. एनके कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में उसी दिन पीडो सीडिंग के रूप में गल लें। कोशिकाओं को शीशी से 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें एनके कोशिकाओं के लिए माध्यम का 10 एमएल (सामग्री की तालिकादेखें) और लगभग 25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। सुपरनेट को त्यागें और ताजा माध्यम के 10 एमएल में सेल पेलेट को फिर से रीसस्ट करें। सेल काउंटिंग के बाद सेल डेंसिटी को 1 x 106 सेल्स/एमएल में एडजस्ट करें और 75 सेमी2 फ्लास्क में ट्रांसफर करें। संस्कृति एनके कोशिकाओं में एक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर।
    8. दूसरे दिन, बाँझ वी-बॉटम 96-वेल प्लेटों में अंतिम एकाग्रता से 10 गुना अधिक पर एंटीबॉडी समाधान (फॉस्फेट-बफर नमकीन) तैयार करें।
    9. प्रत्येक कुएं से 60 माइक्रोन माध्यम निकालें, और पीडीओ में 10 माइक्रोन ट्रास्टुज़ुमैब या सेटुक्सीमैब समाधान (10 माइक्रोग्राम/एमएल, 1 माइक्रोग्राम/एमएल, और 0.1 माइक्रोग्राम/एमएल) जोड़ें। प्लेटों को एक इनक्यूबेटर में उपकरण पर वापस स्थानांतरित करें और सेल इंडेक्स को 1 घंटे के लिए रिकॉर्ड करें।
    10. एनके सेल सस्पेंशन को 50 एमएल ट्यूब में ट्रांसफर करें और सेल नंबर गिनें। 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें और एनके सेल घनत्व को 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल और 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल को पीडीओ के लिए माध्यम के साथ समायोजित करें।
    11. 1:1 या 2:1 के लक्ष्य (RLUN007) सेल अनुपात पर प्रभावक (एनके) कोशिकाओं में एनके सेल निलंबन के 50 μL जोड़ें। एंटीबॉडी की अंतिम सांद्रता 1 μg/mL, ०.१ μg/mL, और ०.०१ μg/mL हैं । प्लेट को 15 मिनट के लिए लगभग 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें, और प्लेटों को उपकरण में वापस करें।
  2. डेटा संग्रह और विश्लेषण
    1. विश्लेषण सॉफ्टवेयर (सामग्रीकी तालिका देखें) का उपयोग करके सेल इंडेक्स को प्रतिशत साइटोलिसिस मूल्यों में परिवर्तित करें।
    2. प्रतिशत साइटोलिसिस एक नियंत्रण के रूप में अकेले लक्ष्य कोशिकाओं (पीडीओ) बनाम एनके कोशिकाओं द्वारा मारे गए लक्ष्य कोशिकाओं के प्रतिशत को संदर्भित करता है । हर समय बिंदु पर नमूना कुओं के सूचकांक से केवल एनके कोशिकाओं युक्त कुओं के कोशिका सूचकांक घटाना। एंटीबॉडी के अलावा से तुरंत पहले सेल इंडेक्स के लिए प्रत्येक मूल्य सामान्य। सामान्यीकृत सेल इंडेक्स को निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके प्रतिशत साइटोलिसिस में परिवर्तित करें: % साइटोलिसिस = (1 - सामान्यीकृत सेल इंडेक्स [नमूना कुएं]) / सामान्यीकृत सेल इंडेक्स (लक्ष्य अकेले कुएं) x 100।

Representative Results

एंटीकैंसर एजेंटों का मूल्यांकन करने के लिए पीडीओ और 384-वेल माइक्रोप्लेट का उपयोग करके एक बेहद सटीक एचटीएस विकसित किया गया था, और प्रत्येक पीडीओ के लिए एचटीएस के विकास की सूचना पहले10,11,12, 13थी। सीवी और जेड फैक्टर की गणना करके एचटीएस के प्रदर्शन का मूल्यांकन किया गया। Z'-factor परख गुणवत्ता और प्रदर्शन के सत्यापन के लिए एक व्यापक रूप से स्वीकार्य विधि है, और परख एचटीएस के लिए उपयुक्त है यदि यह मूल्य >0.514है। आरएलयूं007 का उपयोग करके 384-अच्छी प्लेट परख में नियंत्रण डैटम अंक ने 5.8% के सीवी मूल्यों के साथ थोड़ा परिवर्तनशीलता दिखाई और 0.83 के जेड-कारकों की गणना की, जैसा कि चित्र 4में दिखाया गया है। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि इस परख एचटीएस के लिए उच्च प्रदर्शन किया है । एचटीएस का उपयोग करके कैंसर रोधी एजेंटों को पीडीओ की संवेदनशीलता की जांच करने के लिए, आठ कैंसर रोधी एजेंटों के साथ इलाज किए गए आरएलयूएन007 का उपयोग करके विकास अवरोध का आकलन किया गया था, विशेष रूप से, एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (ईजीएफआर) अवरोधक (अफेटिनिब, एर्लोटिनिब, गेफिटिनिब, लैपटिनिब, ओसिएर्टिनिब, और क्लिटिटैक्सेल) और पीएसीलटैक्सेल, जो गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर के लिए मानक उपचार हैं, और एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में माइटोमीसिन सी। प्रत्येक पीडीओ के लिए कैंसर रोधी एजेंटों केआईसी 50 और एयूसी मूल्यों को चित्र 4में दिखाया गया है। आरएलयूएन007 ने सभी ईजीएफआर अवरोधकों और अन्य कैंसर रोधी एजेंटों के लिए उच्च संवेदनशीलता (आईसी50 < 2 माइक्रोन, एयूसी < 282) दिखाया। सिग्मॉयड घटता सभी डेटा के लिए गणना की संकेत दिया है कि कैंसर रोधी एजेंटों की वृद्धि निरोधात्मक गतिविधि सही मापा जा सकता है ।

सेल पिकिंग और इमेजिंग सिस्टम का उपयोग तब किया जाता है जब डेटा उपरोक्त पद्धति का उपयोग करके काफी भिन्न होता है। सेल पिकिंग और इमेजिंग सिस्टम, जो सेल क्लस्टर को नुकसान पहुंचाए बिना सही ढंग से चुनता है, परख प्रणाली से सेल मलबे को बाहर करने के लिए सेल क्लस्टर आकार को संरेखित करके सटीक एचटीएस परख की अनुमति देता है। जब सिस्टम का उपयोग नहीं किया गया था, तो सीवी मूल्य 26.0% था और जेड-फैक्टर मूल्य 0.23 (डेटा नहीं दिखाया गया था)। हालांकि, सिस्टम का उपयोग करके सीवी और जेड-फैक्टर मूल्यों में क्रमशः 6.4% और 0.81 में सुधार किया गया था।

विद्युत बाधा मापने वाले उपकरण का उपयोग करके एडीसीसी गतिविधि के साथ पीडीओ के साइटोलिसिस की जांच करने के लिए, जो लंबी अवधि के लिए कोशिकाओं की संख्या, आकृति विज्ञान और लगाव पर नज़र रखता है, बाधा संकेतों में परिवर्तन का आकलन किया गया था, जिसका उपयोग करके आरएलयूएन007 का उपयोग करके एंटीबॉडी (ट्रैस्टूज़ुमब और सेटुक्सीमैब) और एनके कोशिकाओं को 96-वेल प्लेट में प्रभावक कोशिकाओं के रूप में माना जाता है। केवल लक्ष्य कोशिकाओं से मिलकर नियंत्रण के साथ तुलना में, प्रतिशत साइटोलिसिस समय के साथ वृद्धि हुई । यह एंटीबॉडी के बिना ई:1 (चित्रा 5ए, सी)या 2:1(चित्रा 5B,D)के ई:टी अनुपात पर 6 घंटे के बाद45% या 75%तक पहुंच गया। ट्रास्टुजुम्ब का उपयोग करके एनके सेल-मध्यस्थता साइटोलिसिस क्रमशः 6 घंटे पर 1:1(चित्रा 5A,1 μg/mL) और 2:1(चित्रा 5B,1 μg/mL) के अनुपात में लगभग 60% और 90% था। इसके विपरीत, cetuximab एनके सेल मध्यस्थता साइटोलिस (चित्रा 5C,D)पर एक खुराक पर निर्भर प्रभाव पड़ा । cetuximab की उच्चतम एकाग्रता पर, RLUN007 क्रमशः 1:1 और 2:1 के अनुपात में 90% और 100% पर नष्ट कर दिया गया (चित्रा 5C,D). ट्रास्टुज़ुमाब का प्रभाव सेटुक्सीमैब की तुलना में कमजोर था, जिसमें केवल 60% साइटोटॉक्सिकिटी थी। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि पीडीओ परख प्रणाली वास्तविक समय बाधा आधारित प्रौद्योगिकी का उपयोग कर एडीसीसी गतिविधि का मूल्यांकन कर सकते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1:पीडीओ संस्कृति के लिए महत्वपूर्ण बिंदु। (A)माध्यम में रंग परिवर्तन। (ख)50-200 माइक्रोन(सी)पीडीओ घनत्व के स्तर पर चिह्नित ट्यूबों के साथ पीडीओ युक्त एक अपकेंद्रित्र ट्यूब को अस्तर करके गोली के आकार से पीडीओ की मात्रा का मापन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:384-वेल माइक्रोप्लेट का उपयोग करके एक उच्च-थ्रूपुट परख प्रणाली बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल का सारांश। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:एडीसीसी गतिविधि के उच्च थ्रूपुट परख के लिए प्रोटोकॉल का सारांश। एडीसीसी, एंटीबॉडी-निर्भर सेलुलर साइटोटॉक्सीसिटी; एनके, प्राकृतिक हत्यारा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:कैंसर रोधी एजेंटों के साथ विकास निषेध के लिए उच्च-थ्रूपुट परख प्रणाली। कैंसर रोधी एजेंटों को RLUN007 की खुराक-प्रतिक्रिया वक्र। कीमा बनाया हुआ पीडीओ ३८४-वेल प्लेटों में वरीयता प्राप्त थे । इनका इलाज 6 दिनों के लिए एंटीकैंसर एजेंटों (10 माइक्रोन और 1.5 एनएम के बीच) की दस अलग-अलग सांद्रता के साथ किया गया था। डेटा ट्रिपलिकेट प्रयोगों के मानक विचलन ± मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:एडीसीसी गतिविधि के लिए उच्च थ्रूपुट परख। (A,B) ट्रास्तुजुमाब। (C,D) सेटुक्सीमैब। (ए,सी) प्रभावक कोशिकाओं के लिए RLUN007 का एक 1:1 अनुपात। (B,D) RLUN007 के अनुपात के साथ साइटोलिसिस: 1:2 की प्रभावक कोशिकाएं। प्रभावक कोशिकाओं के अलावा गतिविधि को 12 घंटे मापा गया था। डेटा तीन दोहराने के नमूनों के मानक विचलन ± मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । एडीसीसी, एंटीबॉडी पर निर्भर सेलुलर साइटोटॉक्सिकिटी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

पीडीओ की अनूठी विशेषता यह है कि वे संस्कृति या परख के दौरान एक कोशिकाओं में एंजाइमेटिक रूप से अलग नहीं होते हैं और संस्कृति में कोशिका समूहों को बनाए रखते हैं। इसलिए, कोशिकाओं की संख्या को माइक्रोस्कोप के नीचे सही ढंग से नहीं गिना जा सकता है। इस समस्या को हल करने के लिए, कोशिकाओं की संख्या नेत्रहीन एक अपकेंद्रित्र ट्यूब 50-200 μL(चित्रा 1B)के लिए स्तर के साथ चिह्नित ट्यूबों के साथ कोशिकाओं युक्त अस्तर द्वारा निर्धारित किया जाता है । इसके अलावा, क्योंकि 25 सेमी2 फ्लास्क में सुसंस्कृत सेल क्लस्टर की गोली की मात्रा को मापना मुश्किल है, इसलिए पारित होने का समय लाल से पीले रंग तक मध्यम रंग परिवर्तन और संकेतकों के रूप में पासेजिंग के समय की तुलना में एकल कोशिकाओं या मलबे में उल्लेखनीय वृद्धि का उपयोग करके निर्धारित किया गया था(चित्रा 1A,सी)। यह पीडीओ के लिए पासिंग की बात है। प्रत्येक माध्यम परिवर्तन पर अपकेंद्रित्र के बाद पीडीओ छर्रों की मात्रा नेत्रहीन मापी जाती है। जब गोली की मात्रा बढ़ना बंद हो जाती है, और मध्यम प्रतिस्थापन के बाद दिन में मध्यम पीला हो जाता है, तो माध्यम को घनत्व के साथ संतृप्त माना जाता है, और पासेजिंग किया जाता है। प्रत्येक पीडो के लिए गोली की मात्रा परिभाषित की गई है। यदि पीडीओ पैदा नहीं करते हैं, तो मध्यम विनिमय के समय मध्यम की मात्रा 80% से बदलकर 50% कर दी जाती है, और संस्कृति में पीडीओ का घनत्व बढ़ जाता है।

पीडीओ के लिए उपयुक्त एचटीएस विकसित किया गया था। इसका थ्रूपुट कम से कम दस से बीस 384-अच्छी प्लेटें हैं जो पीडो के 1 75 सेमी2 फ्लास्क का उपयोग करके प्रदर्शन की जाती हैं, और प्रति दिन संसाधित प्लेटों की संख्या कम से कम 50 है। इसके अलावा पीडीओ का उपयोग करते हुए एचटीएस द्वारा विभिन्न कैंसर रोधी दवाओं के मूल्यांकन के परिणाम पहले ही सूचित किए जा चुके हैं ।

एचटीएस का प्रदर्शन करते समय, सेल विखंडन और फैलाव उपकरण का उपयोग करके एफ-पीडीओ की की कमी के कारण जाल फिल्टर की क्लोजिंग को शुरू में फिल्टर के जाल आकार को 100 माइक्रोन में बदलकर संबोधित किया जाता है। अगला कदम ग्लास पोत पर लागू पीडो निलंबन की मात्रा को कम करना है। एचटीएस के लिए परीक्षण पदार्थ समाधान तैयार करते समय, कम आणविक-वजन यौगिक आमतौर पर डाइमेथाइल सल्फोक्साइड में भंग हो जाते हैं, और एंटीबॉडी फॉस्फेट-बफर खारा में भंग हो जाते हैं। उपयुक्त सॉल्वेंट का उपयोग परीक्षण पदार्थ के रूप में किया जाता है, और नियंत्रण डेटा उपयोग किए गए सॉल्वेंट से प्राप्त किया जाता है।

निम्नलिखित परख डेटा में परिवर्तनशीलता से निपटने के तरीके का वर्णन है। यदि ३८४-अच्छी प्लेटों का उपयोग कर परीक्षण में डेटा में बड़ी भिन्नता है, तो परख प्लेट को ९६-अच्छी प्लेट प्रारूप में बदल दिया जाना चाहिए । प्लेट को सीडिंग करने के बाद पीडो तनुशन फैक्टर (वरीयता प्राप्त सेल क्लस्टर्स की संख्या) की भी जांच की जाती है। अंत में, सेल पिकिंग और इमेजिंग सिस्टम का उपयोग परख के लिए पीडीओ के आकार का चयन करने के लिए किया जा सकता है। चैंबर में पीडीओ को जोड़ने से पहले, एकल कोशिकाओं और छोटे सेल क्लस्टर को कम गति वाले अपकेंद्रित्र द्वारा हटा दिया जाना चाहिए ताकि पीडीओ को सही ढंग से पहचाना जा सके । यदि कक्ष में पीडीओ जोड़ने के बाद एकल कोशिकाएं या छोटे सेल क्लस्टर दिखाई देते हैं, तो एकल कोशिकाओं को हटाने के लिए कई फैलाव किए जा सकते हैं। इसके बाद, हालांकि सेल पिकिंग और इमेजिंग सिस्टम में एक फ़ंक्शन होता है जो प्लेट को गर्म रखने की अनुमति देता है, इस फ़ंक्शन का उपयोग संस्कृति माध्यम के वाष्पीकरण के कारण नहीं किया जाता है जब सिस्टम लंबे समय तक काम कर रहा होता है। अंत में, सेल समूहों की मात्रा अज्ञात है क्योंकि यह एक प्लैनर छवि द्वारा पहचाना जाता है। इसके अलावा, यदि दो या अधिक पीडीओ ओवरलैप करते हैं, तो एक भी पीडीओ को सही ढंग से मान्यता नहीं दी जा सकती है। हालांकि, इस कदम के बाद स्कैन की गई छवि पर उनकी जांच करके हटाने के कार्य का उपयोग करके अवांछित पीडीओ को हटाना संभव है।

विद्युत बाधा मापने के उपकरण आम तौर पर पालन लक्ष्य कैंसर कोशिकाओं के लिए कोशिका प्रसार के दौरान बाधा में परिवर्तन की निगरानी के लिए प्रयोग किया जाता है । इसलिए, गैर-पालनकारी पीडीओ के सेल इंडेक्स में बदलाव का पता नहीं चल पाता है। इस समस्या को हल करने के प्रयास में, पीडो के प्रकार के आधार पर पीडो घनत्व और एंजाइमीय उपचार (सेल वियोजन एंजाइम और उपचार समय) जैसी सीडिंग स्थितियों की जांच करना आवश्यक है। प्लेट में कुओं को पीडीओ सीडिंग के लिए एक उपयुक्त एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स के साथ भी लेपित किया जाना चाहिए। पीडीओ को पीडीओ के प्रकार के आधार पर एंजाइमेटिक उपचार के बिना वरीयता दी जाती है। RLUN007 का उपयोग एंजाइमेटिक उपचार द्वारा उन्हें फैलाने के बाद 96-अच्छी प्लेट पर पीडीओ को सीडिंग करके बाधा को मापने के लिए किया गया था। RLUN007 कोशिकाओं को तितर-बितर करने और उन्हें 96-अच्छी प्लेट के कुओं से जोड़ने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेल संस्कृति वियोजन रिएजेंट के साथ इलाज किया गया था। यह देखते हुए कि अलग RLUN007 कोशिकाओं को तुरंत समुच्चय फार्म, यह सिर्फ एक छलनी का उपयोग कर छानने के बाद प्लेटों पर बीज के लिए वांछनीय है । ट्यूब से एक जलाशय के लिए सेल निलंबन स्थानांतरित करने के बाद, जलाशय धीरे से दो से तीन बार छोड़ दिया और ऊपर और नीचे पांच बार थाली पर बोने से पहले पाइप्ड किया गया था । निलंबन भी कुएं के लिए प्रत्येक अतिरिक्त के साथ मिलाया गया था । थाली तो 30 मिनट के लिए एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में रखा गया था (पीडीओ के लिए) या 15 मिनट (एनके कोशिकाओं के लिए) कोशिकाओं को अच्छी तरह से समान रूप से वितरित करने की अनुमति है । दूसरी महत्वपूर्ण बात यह है कि एंटीबॉडी और एनके कोशिकाओं के साथ उपचार समय पर होना चाहिए इससे पहले कि सेल सूचकांक एक पठार तक पहुंचता है और मूल्य ०.५ से कम नहीं है । RLUN007 के मामले में, परख शुरू करने के लिए इष्टतम समय चढ़ाना के बाद 20-22 घंटे है, और सीडिंग के लिए सेल संख्या 5 x 104 कोशिकाओं/

सामान्य तौर पर, ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के लिए संस्कृति और परख में ट्यूमर ऊतक मचान या एंजाइम जैसे ट्राइप्सिन और कोलेजनेस जैसे ट्यूमर ऊतक मचान बनाने के लिए मैट्रिक्स जैसे एक्सपेरिमेंटीय मैट्रिस का उपयोग किया जाता है ताकि ऑर्गेनॉइड 3 ,4,5,6,7,7को बाधित किया जा सके। इस विधि का लाभ यह है कि संस्कृति और परख के दौरान कोई बाह्य मैट्रिक्स या एंजाइमेटिक उपचार की आवश्यकता नहीं है (विद्युत बाधा मापने वाले उपकरण का उपयोग करके परख के अलावा), जो श्रम आवश्यकताओं और लागतों को काफी कम कर देता है। इसके अलावा, यह विधि एचटीएस परख प्रणालियों और विभिन्न माप प्रणालियों के अनुकूल होना अपेक्षाकृत आसान है। हालांकि, एक बाह्य मैट्रिक्स का उपयोग कुछ शोध उद्देश्यों के लिए वांछनीय है क्योंकि यह कोशिकाओं के लिए एक पाड़ के रूप में कार्य कर सकता है और ऊतकों में मॉर्फोजेनेसिस, भेदभाव और होमोस्टेसिस को प्रभावित कर सकता है।

इस अध्ययन में, ईजीएफआर म्यूटेशन (एल858आर) के साथ पीडीओ (आरएलयूएन007) जो ईजीएफआर अवरोधकों के प्रति चिकित्सकीय रूप से संवेदनशील है और ईजीएफआर जीन (डेटा नहीं दिखाया गया) की उच्च अभिव्यक्ति का उपयोग ईजीएफआर अवरोधकों का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। यह दर्शाया गया था कि आरएलयूआर अवरोधकों के लिए आरएलयूआर 007 की संवेदनशीलता अन्य फेफड़ों के कैंसर से व्युत्पन्न एफ-पीडीओ13 (चित्रा 4)की तुलना में अधिक थी। इस प्रकार, पीडीओ का उपयोग करके एक एचटीएस, जो ट्यूमर ऊतक की विशेषताओं को बनाए रखता है, संभावित कैंसर रोधी एजेंटों के मूल्यांकन के लिए बेहतर है और दवा मूल्यांकन और व्यक्तिगत चिकित्सा में प्रगति के लिए अवसर प्रस्तुत करता है। हालांकि एचटीएस एजेंटों की प्रारंभिक स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है, यह ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट को पुन: पेश नहीं करता है और इस प्रकार वीवो मेंदवाओं की प्रभावकारिता का मूल्यांकन नहीं कर सकता है। इसलिए, एक इन विट्रो प्रणाली जो वीवो में मानव ट्यूमर ऊतक की नकल कर सकती है, सह-संस्कृति द्वारा वैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं और अन्य स्ट्रोमल कोशिकाओं या पशु मॉडलों के अभाव में अंग-ऑन-ए-चिप तकनीक के साथ अब विकास के तहत है ।

Disclosures

फुजीफिल्म वाको बायो सॉल्यूशंस कॉरपोरेशन लाइसेंस ट्रांसफर द्वारा एफ-पीडो और एफ-पीडो मीडिया के वाणिज्यिक मालिक फुजीफिल्म वाको प्योर केमिकल्स की सहायक कंपनी है ।

Acknowledgments

हम रोगियों को जो नैदानिक नमूनों इस शोध में इस्तेमाल प्रदान का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । यह शोध फुकुशिमा प्रांत के ट्रांसलेशनल रिसर्च प्रोग्राम से अनुदान द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well Ultra-Low Attachment Spheroid Microplate Corning 4516 Plates for HTS
40-µm Cell Strainer Corning 352340
AdoptCell-NK kit Kohjin Bio 16030400 Kit for NK cell production
Cancer Cell Expansion Media plus Fujifilm Wako Pure Chemical 032-25745 Medium for F-PDO
ALyS505N-175 Cell Science & Technology institute 10217P10 Medium for NK cells
CELL HANDLER Yamaha Motor - Cell picking and imaging system
CellPet FT JTEC - Cell fragmentation and dispersion equipment
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9683 Cell viability luminescent assay, intracellular ATP measuring reagent
Echo 555 Labcyte - Liquid handler
EnSpire PerkinElmer - Plate reader
E-plate VIEW 96 Agilent 300601020 Plates are specifically designed to perform cell-based assays with the xCELLigence RTCA System
Fibronectin Solution Fujifilm Wako Pure Chemical 063-05591 Plate coating for xCELLigence RTCA System
F-PDO Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International - The F-PDO can be purchased from Fujifilm Wako Pure Chemicals or Summit Pharmaceuticals International
Morphit software, version 6.0 The Edge Software Consultancy Biological data analysis software
Multidrop Combi ThermoFisher Scientific 5840300 Cell suspension dispenser
Precision Chamber Yamaha Motor JLE9M65W230 Chamber for picking cell clusters using CELL HANDLER
Precision Tip Yamaha Motor JLE9M65W300 Micro tip for picking cell clusters using CELL HANDLER
RLUN007 Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International Lung tumor derived F-PDO
TrypLE Express ThermoFisher Scientific 12604021 Cell culture dissociation reagent
Ultra-Low Attachment 25 cm² Flask Corning 4616 Culture flask for PDO
Ultra-Low Attachment 75 cm² Flask Corning 3814 Culture flask for PDO
Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer System Beckman coulter - Cell viability analyzer
xCELLigence immunotherapy software, version 2.3 ACEA Bioscience - Analysis software for xCELLigence RTCA System
xCELLigence RTCA System ACEA Bioscience - Electrical impedance measuring instrument for cytolysis

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References

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रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनॉइड का उपयोग करके <em>विट्रो</em> परख में उच्च-थ्रूपुट
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Higa, A., Takahashi, N., Hiyama, G., … More

Higa, A., Takahashi, N., Hiyama, G., Tamura, H., Hoshi, H., Shimomura, K., Watanabe, S., Takagi, M. High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids. J. Vis. Exp. (172), e62668, doi:10.3791/62668 (2021).

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