Summary
È stato sviluppato un sistema di analisi ad alto rendimento in vitro altamente accurato per valutare i farmaci antitumorali utilizzando organoidi tumorali derivati dal paziente (DOP), simili ai tessuti tumorali ma inadatti per sistemi di analisi ad alta produttività in vitro con piastre a 96 pozzetti e 384 pozzetti.
Abstract
Si prevede che gli organoidi tumorali derivati dal paziente (DOP) siano un modello di cancro preclinico con una migliore riproducibilità della malattia rispetto ai modelli tradizionali di coltura cellulare. Le DOP sono state generate con successo da una varietà di tumori umani per ricapitolare l'architettura e la funzione del tessuto tumorale in modo accurato ed efficiente. Tuttavia, le DOP non sono adatte per un sistema di analisi ad alto rendimento in vitro (HTS) o per l'analisi cellulare che utilizza piastre a 96 pozzetti o 384 pozzetti quando si valutano i farmaci antitumorali perché sono di dimensioni eterogenee e formano grandi cluster in coltura. Queste colture e saggi utilizzano matrici extracellulari, come Matrigel, per creare impalcature di tessuto tumorale. Pertanto, le DOP hanno un basso rendimento e costi elevati, ed è stato difficile sviluppare un sistema di analisi adatto. Per affrontare questo problema, è stato istituito un HTS più semplice e accurato utilizzando le DOP per valutare la potenza dei farmaci antitumorali e dell'immunoterapia. È stato creato un HTS in vitro che utilizza DOP stabilite da tumori solidi coltivati in piastre a 384 pozzetti. È stato inoltre sviluppato un HTS per la valutazione dell'attività di citotossicità cellulare anticorpo-dipendente per rappresentare la risposta immunitaria utilizzando DOP coltivate in piastre a 96 pozzetti.
Introduction
Le linee cellulari tumorali umane sono ampiamente accettate per studiare la biologia del cancro e valutare gli agenti antitumorali. Tuttavia, queste linee cellulari non conservano necessariamente le caratteristiche originali del loro tessuto sorgente perché la loro morfologia, mutazione genica e profilo di espressione genica possono cambiare durante la coltura per lunghi periodi. Inoltre, la maggior parte di queste linee cellulari sono coltivate in un monostrato o utilizzate come xenotrapianti murini, nessuno dei quali rappresenta fisicamente il tessuto tumorale1,2. Pertanto, l'efficacia clinica degli agenti antitumorali potrebbe non essere la stessa di quella osservata nelle linee cellulari tumorali. Pertanto, sono stati sviluppati sistemi in vitro, come saggi ex vivo che utilizzano xenotrapianti tumorali derivati dal paziente o organoidi tumorali derivati dal paziente (DOP) e modelli di sferoidi tumorali che riproducono accuratamente la struttura e la funzione dei tessuti tumorali. Prove crescenti suggeriscono che questi modelli predicono la risposta dei pazienti agli agenti antitumorali essendo direttamente paragonabili al corrispondente tessuto tumorale. Questi sistemi in vitro sono stati stabiliti per diversi tipi di tessuto tumorale e sono stati sviluppati anche sistemi di analisi ad alto rendimento associati (HTS) per lo screening farmacologico3,4,5,6,7. Colture organoidi ex vivo eterogenee di tumori primari ottenuti da pazienti o xenotrapianti tumorali derivati da pazienti hanno guadagnato notevole trazione negli ultimi anni a causa della loro facilità di coltura e capacità di mantenere la complessità delle cellule nel tessuto stromale8,9,10. Questi modelli dovrebbero migliorare la comprensione della biologia del cancro e facilitare la valutazione dell'efficacia del farmaco in vitro.
Una serie di nuove DOP sono state recentemente create da diversi tipi di tessuto tumorale, designato come F-PDO, nell'ambito del Fukushima Translational Research Project. Le DOP formano grandi cluster cellulari con una morfologia simile a quella del tumore di origine e possono essere coltivate per più di sei mesi11. L'istologia comparativa e le analisi complete dell'espressione genica hanno mostrato che le caratteristiche delle DOP sono vicine a quelle dei loro tessuti tumorali di origine, anche dopo una crescita prolungata in condizioni di coltura. Inoltre, è stato stabilito un HTS adatto per ogni tipo di DOP in piastre a 96 pozzetti e 384 pozzetti. Questi saggi sono stati utilizzati per valutare diversi agenti e anticorpi a bersaglio molecolare. Qui, i chemioterapici standard (paclitaxel e carboplatino) utilizzati per il cancro dell'endometrio sono stati valutati utilizzando F-DOP derivate da un paziente che non rispondeva a paclitaxel e carboplatino. Di conseguenza, l'attività inibitoria della crescita cellulare di paclitaxel e carboplatino contro questa DOP era debole (IC50: >10 μM). Inoltre, ricerche precedenti hanno riportato che la sensibilità di alcune F-DOP agli agenti chemioterapici e agli agenti a bersaglio molecolare è coerente con l'efficacia clinica11,12,13. Infine, i cambiamenti nella struttura di ordine superiore delle DOP causati da agenti antitumorali sono stati analizzati utilizzando un sistema di analisi cellulare tridimensionale12,13. I risultati della valutazione degli agenti antitumorali utilizzando un HTS a base di DOP sono paragonabili ai risultati clinici ottenuti per questi agenti. Qui, viene presentato un protocollo per un HTS più semplice e accurato che può essere utilizzato per valutare la potenza degli agenti antitumorali e dell'immunoterapia utilizzando i modelli DOP.
Protocol
Tutti gli esperimenti che coinvolgono materiali di derivazione umana sono stati eseguiti ai sensi della Dichiarazione di Helsinki e approvati in anticipo dal comitato etico dell'Università di Medicina di Fukushima (numeri di approvazione 1953 e 2192; date di approvazione 18 marzo 2020 e 26 maggio 2016, rispettivamente). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti che hanno fornito i campioni clinici utilizzati in questo studio.
1. Cultura delle DOP
NOTA: le F-DOP formano cluster cellulari che presentano una varietà di morfologie eterogenee e crescono in coltura in sospensione (Figura 1). Inoltre, le F-DOP possono essere coltivate per più di 6 mesi e possono essere crioconservate per un uso futuro.
- Scongelamento delle DOP immagazzinate (giorno 0)
- Scongelamento e sementi DOP (ad esempio, RLUN007, adenocarcinoma polmonare) al giorno 0 (Figura 1). In primo luogo, aggiungere 15 mL di terreno per dop (vedi tabella dei materiali)contenente l'1% di integratore B-27 e 30 ng/mL di fattore di crescita epidermico in un tubo sterile da 50 mL per centrifuga.
- Dopo aver rimosso il flaconcino congelato dalla conservazione dell'azoto liquido, agitare delicatamente le DOP a bagnomaria a 37 °C per 2 minuti. Quindi, rimuovere la fiala dal bagno d'acqua, pulire la fiala con etanolo al 70% e quindi spostare la fiala in un armadio di sicurezza biologica.
- Trasferire il contenuto del flaconcino al tubo contenente 15 mL di supporto per le DOP. Mescolare le DOP e il mezzo pipettando delicatamente su e giù cinque volte con una pipetta di trasferimento da 3 ml. Centrifugare il tubo a 200 x g per 3 minuti a ~25 °C ed eliminare il surnatante. Risospesciare il pellet DOP in 5 mL di mezzo fresco e trasferirlo in un matraccio da25 cm 2 (vedi Tabella dei Materiali)con un delicato pipettaggio. Infine, coltivare le DOP in un incubatore a 37 °C in 5% CO2.
- Cambia il mezzo due volte a settimana (giorni 3-7). Centrifugare la sospensione DOP per far precipitare i cluster cellulari e sostituire 4 mL del mezzo (80% in volume). Risospese le cellule nel mezzo fresco.
NOTA: la maggior parte di RLUN007 viene visualizzata come cluster di celle di diametro 100-500 μm. Quando il colore del rosso fenolo nel mezzo cambia in giallo come mostrato nella Figura 1A, sostituire il mezzo più frequentemente. Se il mezzo diventa giallo il giorno successivo alla sostituzione e ogni cluster di cellule si fonde per formare cluster più grandi che hanno un diametro di > 500 μm, passa con un rapporto di divisione di 1:2. - Sottocultura (giorni 8-28) delle DOP
NOTA: Data la difficoltà di misurare effettivamente il numero di singole celle, i tempi di passaggio sono determinati in base a un'appropriata densità del cluster cellulare e alla dimensione del pellet DOP dopo centrifugazione (Figura 1B). Nel caso di RLUN007, il volume del pellet DOP raggiunge i 30 μL (densità satura in 25 cm2 palloni) circa 2 settimane dopo lo scongelamento.- Per il trasferimento da un matraccio da25 cm 2 a due palloni da25 cm 2 (P1), trasferire la sospensione DOP in un tubo per centrifuga e in una centrifuga a 200 x g per 2 minuti a circa 25 °C. Stimare il volume del pellet DOP ed scartare il surnatante. Risospendare il pellet DOP utilizzando una pipetta da 5 ml in 5 mL di terreno fresco. Pipetta delicatamente su e giù cinque volte a bassa velocità. Quindi, trasferire metà del volume della sospensione DOP (2,5 mL) in due palloni e aggiungere 2,5 mL di terreno fresco a ciascun matraccio. Colturare le cellule a 37 °C in 5% di CO2.
- Per il trasferimento da due palloni da25 cm 2 a un matraccio da 75 cm2 (P2), trasferire la sospensione DOP da due palloni in due tubi centrifughi e centrifugare la DOP a 200 x g per 2 minuti a circa 25 °C. Successivamente, stimare il volume del pellet DOP e risospesciare il pellet in 2,5 ml di mezzo fresco (per tubo). Successivamente, combinare la sospensione DOP in un tubo con quella nell'altro e trasferirla in un matraccio da 75 cm2 contenente 10 ml di mezzo fresco. Colturare le cellule a 37 °C in 5% di CO2. Trasferire le DOP sottocoltura da due palloni da 25 cm2 a un pallone da 75 cm2 circa 1 settimana dopo il primo passaggio (Figura 1C).
2. Inibizione della crescita HTS
NOTA: L'attività inibitoria della crescita degli agenti antitumorali contro le DOP viene valutata misurando il contenuto intracellulare di ATP, come mostrato nella Figura 2. Questa fase viene eseguita utilizzando un kit di analisi di vitalità cellulare disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali).
- Il giorno 0, coltivare le DOP (ad esempio, RLUN007) in palloni fino a quando non sarà disponibile un numero adeguato di cluster cellulari per il test. Un giorno prima della semina, trasferire la sospensione DOP da un matraccio da 75 cm2 a un tubo da 15 ml e centrifugare a 200 x g per 2 minuti per misurare il volume del pellet DOP. Quindi, risospesciare il pellet DOP in 15 ml di mezzo fresco e ricollocarlo in un matraccio da 75 cm2. Colturare le cellule a 37 °C in 5% di CO2.
NOTA: Il volume di pellet DOP richiesto dipende dalla velocità di diluizione di ciascuna DOP e dal numero di piastre a 384 pozzetti utilizzate per il test. Per RLUN007, è necessario un volume di pellet di 200 μL per la semina in dieci piastre da 384 pozzetti. - Il giorno 1 (24 ore dopo aver cambiato il mezzo), tritare le DOP utilizzando apparecchiature di frammentazione e dispersione cellulare (vedi Tabella dei materiali)con un portafiltro contenente un filtro a maglie da 70 μm. Quindi, diluire 15 ml della sospensione DOP di 10x. Seminare 40 μL della sospensione DOP in micropiastre sferoidi (fondo tondo) ad attacco ultra basso a 384 pozzetti (vedi Tabella dei materiali)utilizzando un distributore di sospensioni cellulari (vedi Tabella dei materiali).
NOTA: per i cluster di celle trituranti, si consiglia di utilizzare l'apparecchiatura di frammentazione e dispersione cellulare disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali). - A 24 ore dalla semina (giorno 2), trattare le DOP con 0,04 μL di soluzioni di agenti di prova a intervalli di concentrazione finale da 20 μM a 1,0 nM (10 diluizioni seriali) utilizzando un gestore di liquidi (vedi Tabella dei materiali).
- Il giorno 8 (144 ore dopo il trattamento con la sostanza in esame), aggiungere il reagente di misurazione dell'ATP intracellulare ai pozzetti di prova. Mescolare le piastre con un mixer e incubare per 10 minuti a 25 °C. Misurare il contenuto intracellulare di ATP come luminescenza utilizzando un lettore di piastre (vedi Tabella dei materiali).
- Per calcolare la vitalità cellulare, dividere la quantità di ATP nei pozzetti di prova per quella nei pozzetti di controllo contenenti il veicolo, con lo sfondo sottratto. Per calcolare il tasso di crescita in 6 giorni, dividere la quantità di ATP nei pozzetti di controllo del veicolo per quella nei pozzetti di controllo del veicolo 24 ore dopo la semina.
- Calcolare i valori di concentrazione inibitoria del 50% (IC50)e dell'area sotto la curva (AUC) dalle curve dose-risposta utilizzando un software di analisi dei dati biologici (vedi Tabella dei materiali). Il fattore Z è un parametro adimensionale che va da 1 (separazione infinita) a <0, definito come Z = 1 - (3σc+ + 3σc-) / |μc+ - μc-|, dove σc+, σc-, μc+ e μc- sono le deviazioni standard (σ) e le medie (μ) dei controlli alti (c+) e bassi (c−)14, rispettivamente.
3. HTS con un sistema di prelievo e imaging cellulare per l'inibizione della crescita
NOTA: se c'è una grande deviazione (quando il coefficiente di variazione [CV] al saggio è superiore al 20%) nei dati utilizzando il protocollo 2, le DOP di una dimensione selezionata possono essere seminate in piastre a 96 pozzetti o 384 pozzetti utilizzando un sistema di prelievo e imaging cellulare (Figura 2). Il protocollo è lo stesso descritto nei passaggi 2.1 e 2.2 della sezione precedente. Questo passaggio viene eseguito utilizzando un sistema di prelievo e imaging delle celle disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali).
- Il giorno 1, impostare una micropiastra sferoidale ad attacco ultra-basso a 384 pozzetti con 40 μL di media/così come una piastra di destinazione sul sistema di prelievo e imaging cellulare.
- Riempire la camera di raccolta (vedi Tabella dei materiali)con 6 mL di terreno di coltura e centrifugare a 1.500 x g per 2 minuti per rimuovere le bolle d'aria. Aggiungere le DOP sospese nel mezzo (volume di pellet DOP, 4 μL) alla camera di prelievo e impostarle sul sistema.
- Stare in piedi la camera per almeno 1 minuto, seguita dalla dispersione, in modo che i cluster cellulari si depositino nella parte inferiore della camera; quindi, eseguire la scansione della camera.
- Impostare la dimensione del picking su 140-160 μm (area 15.386-20.000 μm2) sul sistema per la selezione automatica dei cluster di celle. Quindi, controllare la qualità dei cluster di celle selezionati sulle immagini scansionate e trasferire dieci cluster di celle per pozzo utilizzando le punte di prelievo (vedere Tabella dei materiali)nella piastra di destinazione.
- Eseguire i passaggi del protocollo dal passaggio 2.3 in poi.
4. HTS per la citotossicità cellulare anticorpo-dipendente
NOTA: Questa fase viene eseguita utilizzando un sistema disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali),che è uno strumento di misura dell'impedenza elettrica. Viene utilizzato per valutare la citolisi delle DOP mediante citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC) con anticorpi monoclonali e cellule natural killer (NK) (Figura 3). Le cellule NK sono prodotte da cellule mononucleate del sangue periferico utilizzando il kit di produzione di cellule NK (vedere Tabella dei materiali),seguendo le istruzioni del produttore.
- Misurazione dell'attività adCC
- Il giorno 0, rivestire una piastra a 96 pozzetti(vedi Tabella dei materiali) con 50 μL di soluzione di fibronectina da 10 μg/mL (0,5 μg/pozzetto) a 4 °C durante la notte.
- Il giorno 1, dopo aver rimosso la soluzione di fibronectina, aggiungere 50 μL del terreno di coltura a ciascun pozzetto per misurare l'impedenza di fondo.
- Prima della semina, aggiungere 5 mL di reagente di dissociazione per colture cellulari (vedi Tabella dei materiali)alle DOP (RLUN007: 100 μL del pellet DOP in un pallone da 75 cm2) e incubare in un incubatore a CO2 a 37 °C per 20 minuti per disperdere le DOP. Per interrompere la tripsinizzazione, aggiungere 5 ml di mezzo, centrifugare e rimuovere il reagente di dissociazione. Risciacquare le DOP con mezzo fresco e filtrare attraverso un filtro cellulare da 40 μm (vedi Tabella dei materiali).
- Contare il numero di celle utilizzando un analizzatore di vitalità cellulare (vedere Tabella dei materiali).
- Trasferire la sospensione PDO in un serbatoio e miscelare utilizzando un pipettor multicanale. Aggiungere la sospensione DOP in pozzetti a 5 x 104 celle/pozzetto in una piastra da 96 pozzetti. Ogni pozzo contiene un volume finale di 100 μL. Quindi, posizionare la piastra in un armadio di sicurezza biologica a circa 25 °C per 30 minuti.
- Trasferire la piastra allo strumento in un incubatore a CO2 a 37 °C. Registrare le variazioni nei segnali di impedenza ogni 15 minuti come indice della cella.
- Scongelare le cellule NK a bagnomaria a 37 °C lo stesso giorno della semina DOP. Trasferire le cellule dal flaconcino a un tubo da 15 mL contenente 10 mL di terreno per celle NK (vedere Tabella dei materiali)e centrifugare a 300 x g per 5 minuti a circa 25 °C. Scartare il surnatante e risospesere il pellet cellulare in 10 ml di terreno fresco. Dopo il conteggio delle cellule, regolare la densità cellulare a 1 x10 6 celle/mL e trasferirla in un pallone da 75 cm2. Coltivare le cellule NK in un incubatore a CO2 al 5% a 37 °C.
- Il giorno 2, preparare le soluzioni anticorpali (soluzione salina tamponata con fosfato) a 10 volte la concentrazione finale in piastre sterili a 96 pozzetti con fondo a V.
- Rimuovere 60 μL di mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 10 μL di trastuzumab o soluzione di cetuximab (10 μg/mL, 1 μg/mL e 0,1 μg/mL) alle DOP. Trasferire le piastre allo strumento in un'incubatrice e registrare l'indice cellulare per 1 ora.
- Trasferire la sospensione della cella NK in un tubo da 50 ml e contare il numero di cella. Centrifugare le celle a 300 x g per 5 min e regolare la densità della cella NK a 1 x10 6 celle/mL e 2 x10 6 celle/mL con il mezzo per le DOP.
- Aggiungere 50 μL di sospensione di cellule NK alle cellule effettrici (NK) in corrispondenza di un rapporto cellulare target (RLUN007) di 1:1 o 2:1. Le concentrazioni finali degli anticorpi sono 1 μg/mL, 0,1 μg/mL e 0,01 μg/mL. Tenere la piastra a circa 25 °C per 15 minuti e restituire le piastre allo strumento.
- Raccolta e analisi dei dati
- Convertire l'indice cellulare in percentuali di valori di citolisi utilizzando un software di analisi (vedere Tabella dei materiali).
- La percentuale di citolisi si riferisce alla percentuale di cellule bersaglio uccise dalle cellule NK rispetto alle cellule bersaglio (DOP) da sole come controllo. Sottrarre gli indici cellulari dei pozzetti contenenti solo cellule NK dall'indice dei pozzetti campione in ogni punto temporale. Normalizzare ogni valore all'indice cellulare immediatamente prima dell'aggiunta di anticorpi. Convertire l'indice cellulare normalizzato in citolisi percentuale utilizzando la seguente equazione: % citolisi = (1 - indice cellulare normalizzato [pozzetti campione]) / indice cellulare normalizzato (pozzetti bersaglio da soli) x 100.
Representative Results
Un HTS altamente accurato è stato sviluppato utilizzando DOP e micropiastre a 384 pozzetti per valutare gli agenti antitumorali, e lo sviluppo di un HTS per ogni DOP è stato precedentemente riportato10,11, 12,13. Le prestazioni dell'HTS sono state valutate calcolando i CV e il fattore Z. Il fattore Z è un metodo ampiamente accettato per la convalida della qualità e delle prestazioni del saggio e il test è adatto per HTS se questo valore è >0,514. I punti di Riferimento di controllo nel test della piastra a 384 pozzetti utilizzando RLUN007 hanno mostrato poca variabilità, con valori CV del 5,8% e fattori Z calcolati di 0,83, come mostrato nella Figura 4. Questi risultati indicano che questo test ha prestazioni elevate per HTS. Per studiare la sensibilità delle DOP agli agenti antitumorali utilizzando HTS, l'inibizione della crescita è stata valutata utilizzando RLUN007 trattato con otto agenti antitumorali, in particolare, inibitori del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) (afatinib, erlotinib, gefitinib, lapatinib, osimertinib e rociletinib) e paclitaxel, che sono trattamenti clinici standard per il carcinoma polmonare non a piccole cellule e mitomicina C come controllo positivo. I valori IC50 e AUC degli agenti antitumorali per ciascuna DOP sono mostrati nella Figura 4. RLUN007 ha mostrato un'elevata sensibilità (IC50 < 2 μM, AUC < 282) per tutti gli inibitori dell'EGFR e altri agenti antitumorali. Le curve sigmoidi calcolate per tutti i dati indicavano che l'attività inibitoria della crescita degli agenti antitumorali poteva essere misurata con precisione.
Il sistema di prelievo e imaging cellulare viene utilizzato quando i dati variano in modo significativo utilizzando la metodologia di cui sopra. Il sistema di prelievo e imaging cellulare, che seleziona accuratamente i cluster di cellule senza danneggiarli, consente test HTS accurati allineando le dimensioni del cluster cellulare per escludere i detriti cellulari dal sistema di analisi. Quando il sistema non è stato utilizzato, il valore CV era 26,0% e il valore del fattore Z era 0,23 (dati non mostrati). Tuttavia, i valori del fattore CV e Z sono stati migliorati rispettivamente al 6,4% e allo 0,81, utilizzando il sistema.
Per studiare la citolisi delle DOP con attività ADCC utilizzando lo strumento di misurazione dell'impedenza elettrica, che monitora il numero, la morfologia e l'attaccamento delle cellule per una lunga durata, i cambiamenti nei segnali di impedenza sono stati valutati utilizzando RLUN007 trattato con gli anticorpi (trastuzumab e cetuximab) e le cellule NK come cellule effettrici in una piastra a 96 pozzetti. Rispetto al controllo costituito solo da cellule bersaglio, la percentuale di citolisi è aumentata nel tempo. Ha raggiunto il 45% o il 75% dopo 6 ore con un rapporto E:T di 1:1(Figura 5A,C)o 2:1(Figura 5B,D)senza gli anticorpi. La citolisi cellulo-mediata NK con trastuzumab è stata di circa il 60% e il 90% con un rapporto di1:1 (Figura 5A,1 μg/mL) e 2:1(Figura 5B,1 μg/mL), rispettivamente, a 6 h. Al contrario, cetuximab ha avuto un impatto dose-dipendente sulla citolisi cellulo-mediata da NK (Figura 5C,D). Alla più alta concentrazione di cetuximab, RLUN007 sono stati distrutti al 90% e al 100% con un rapporto di 1:1 e 2:1, rispettivamente (Figura 5C, D). L'effetto di trastuzumab è stato più debole di quello di cetuximab, con solo il 60% di citotossicità. Questi risultati indicano che il sistema di analisi PDO può valutare l'attività dell'ADCC utilizzando la tecnologia basata sull'impedenza in tempo reale.
Figura 1: Punti critici per la cultura DOP. (A) Cambiamento di colore nel mezzo. (B) Misurazione della quantità di DOP dalla dimensione del pellet rivestendo un tubo di centrifuga contenente le DOP con tubi contrassegnati a livelli per 50-200 μL. (C) Densità DOP. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Riepilogo del protocollo utilizzato per creare un sistema di analisi ad alta produttività utilizzando micropiastre a 384 pozzetti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Riepilogo del protocollo per il saggio ad alto rendimento dell'attività ADCC. ADCC, citotossicità cellulare anticorpo-dipendente; NK, killer naturale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Sistema di analisi ad alto rendimento per l'inibizione della crescita con agenti antitumorali. Curva dose-risposta di RLUN007 agli agenti antitumorali. Le DOP tritate sono state seminate in lastre da 384 pozzetti. Questi sono stati trattati per 6 giorni con dieci diverse concentrazioni di agenti antitumorali (tra 10 μM e 1,5 nM). I dati rappresentano la deviazione media ± standard degli esperimenti triplicati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Saggio ad alto rendimento per l'attività ADCC. (A,B) Trastuzumab. (C,D) Cetuximab. (A,C) Un rapporto 1:1 tra RLUN007 e cellule effettrici. (B,D) Citolisi con un rapporto di RLUN007: cellule effettrici di 1:2. L'attività è stata misurata 12 ore dopo l'aggiunta delle cellule effettrici. I dati sono presentati come la deviazione media ± standard di tre campioni replicati. ADCC, citotossicità cellulare anticorpo-dipendente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
La caratteristica unica delle DOP è che non sono separate enzimaticamente in singole cellule durante la coltura o il saggio e mantengono i cluster cellulari in coltura. Pertanto, il numero di cellule non può essere contato con precisione al microscopio. Per risolvere questo problema, il numero di cellule viene determinato visivamente rivestendo un tubo centrifugo contenente le celle con tubi contrassegnati con livelli per 50-200 μL (Figura 1B). Inoltre, poiché è difficile misurare visivamente il volume di pellet di cluster cellulari coltivati in un pallone da25 cm 2, il tempo di passaggio è stato determinato utilizzando il cambiamento di colore medio da rosso a giallo e il notevole aumento di singole celle o detriti confrontati con il tempo di passaggio come indicatori (Figura 1A,C). Questo è il punto di passaggio per le DOP. La quantità di pellet DOP viene misurata visivamente dopo la centrifugazione ad ogni cambio di mezzo. Quando il volume del pellet smette di aumentare e il mezzo diventa giallo il giorno dopo la sostituzione del mezzo, il mezzo è considerato saturo di densità e viene eseguito il passaggio. Il volume del pellet è definito per ogni DOP. Se le DOP non proliferano, la quantità di mezzo viene modificata dall'80% al 50% al momento dello scambio medio e la densità delle DOP viene aumentata nella coltura.
È stato sviluppato un HTS adatto alle DOP. La sua produttività è di almeno dieci-venti piastre da 384 pozzetti eseguite utilizzando un pallone da 75 cm2 di DOP e il numero di piastre lavorate al giorno è di almeno 50. Inoltre, sono già stati riportati i risultati della valutazione di vari farmaci antitumorali da parte di HTS utilizzando DOP.
Durante l'esecuzione di HTS, l'intasamento del filtro mesh causato dalla tritatura delle F-DOP utilizzando l'apparecchiatura di frammentazione e dispersione cellulare viene affrontato inizialmente modificando la dimensione della maglia del filtro a 100 μm. Il prossimo passo è ridurre il volume della sospensione DOP applicata al recipiente di vetro. Quando si preparano soluzioni di sostanze in esame per HTS, i composti a basso peso molecolare vengono solitamente disciolti in dimetilsolfossido e gli anticorpi vengono disciolti in soluzione salina tamponata con fosfato. Il solvente appropriato viene utilizzato come sostanza in esame e i dati di controllo sono ottenuti dal solvente utilizzato.
Di seguito è riportata una descrizione di come gestire la variabilità nei dati del test. Se vi è una grande variazione nei dati nel test utilizzando piastre a 384 pozzetti, la piastra di dosaggio deve essere cambiata in un formato di piastra a 96 pozzetti. Il fattore di diluizione DELLA DOP (numero di cluster cellulari seminati) viene esaminato anche dopo la semina della piastra. Infine, il sistema di prelievo e imaging delle cellule può essere utilizzato per selezionare le dimensioni delle DOP per il test. Prima di aggiungere DOP alla camera, le singole celle e i piccoli cluster cellulari devono essere rimossi mediante centrifugazione a bassa velocità per essere in grado di riconoscere correttamente le DOP. Se singole celle o piccoli cluster di cellule sono visibili dopo l'aggiunta di DOP alla camera, è possibile eseguire più dispersioni per rimuovere le singole celle. Successivamente, sebbene il sistema di prelievo e imaging cellulare abbia una funzione che consente di mantenere la piastra calda, questa funzione non viene utilizzata a causa dell'evaporazione del terreno di coltura quando il sistema funziona per un lungo periodo di tempo. Infine, il volume dei cluster cellulari è sconosciuto perché è riconosciuto da un'immagine planare. Inoltre, se due o più DOP si sovrappongono, una singola DOP non può essere riconosciuta correttamente. Tuttavia, è possibile rimuovere i DOP indesiderati utilizzando la funzione di rimozione controllandoli sull'immagine scansionata dopo lo spostamento.
Lo strumento di misura dell'impedenza elettrica viene generalmente utilizzato per le cellule tumorali bersaglio aderenti per monitorare i cambiamenti nell'impedenza durante la proliferazione cellulare. Pertanto, non viene rilevata una modifica dell'indice cellulare delle DOP non aderenti. Nel tentativo di risolvere questo problema, è necessario indagare le condizioni di semina come la densità della DOP e il trattamento enzimatico (enzima di dissociazione cellulare e tempo di trattamento) a seconda del tipo di DOP. I pozzetti nella piastra devono anche essere rivestiti con una matrice extracellulare appropriata per la semina delle DOP. Le DOP vengono seminate senza trattamento enzimatico, a seconda del tipo di DOP. RLUN007 è stato utilizzato per misurare l'impedenza seminando le DOP su una piastra a 96 pozzetti dopo averle disperse mediante trattamento enzimatico. RLUN007 è stato trattato con il reagente di dissociazione della coltura cellulare per 20 minuti a 37 °C per disperdere le cellule e attaccarle ai pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Dato che le cellule RLUN007 dissociate formano immediatamente aggregati, è preferibile seminare sulle piastre subito dopo la filtrazione usando un colino. Dopo aver trasferito la sospensione cellulare dal tubo a un serbatoio, il serbatoio è stato delicatamente spostato da destra a sinistra due o tre volte e pipettato su e giù cinque volte prima di seminare sulla piastra. Anche la sospensione è stata mescolata con ogni aggiunta al pozzo. La piastra è stata quindi posta in un armadio di sicurezza biologica per 30 minuti (per le DOP) o 15 minuti (per le cellule NK) per consentire alle cellule di distribuirsi uniformemente nel pozzo. Il secondo punto importante è che il trattamento con anticorpi e cellule NK dovrebbe essere programmato per verificarsi prima che l'indice cellulare raggiunga un plateau e il valore non sia inferiore a 0,5. Nel caso di RLUN007, il momento ottimale per iniziare il test è 20-22 ore dopo la placcatura e il numero di cellule per la semina è 5 x 104 cellule / pozzetto.
In generale, la coltura e i saggi per gli organoidi tumorali utilizzano matrici extracellulari come Matrigel per creare scaffold di tessuto tumorale o enzimi come tripsina e collagenasi per interrompere gli organoidi3,4,5,6,7. Il vantaggio di questo metodo è che non è richiesta alcuna matrice extracellulare o trattamento enzimatico durante la coltura e il saggio (ad eccezione dei saggi che utilizzano lo strumento di misurazione dell'impedenza elettrica), il che riduce significativamente i requisiti e i costi di manodopera. Inoltre, questo metodo è relativamente facile da adattare ai sistemi di analisi HTS e ai vari sistemi di misurazione. Tuttavia, l'uso di una matrice extracellulare è auspicabile per alcuni scopi di ricerca perché può agire come un'impalcatura per le cellule e influenzare la morfogenesi, la differenziazione e l'omeostasi nei tessuti.
In questo studio, per valutare gli inibitori dell'EGFR sono state utilizzate DOP (RLUN007) con una mutazione EGFR (L858R) clinicamente sensibile agli inibitori dell'EGFR e ad alta espressione del gene EGFR (dati non mostrati). È stato dimostrato che la sensibilità di RLUN007 agli inibitori dell'EGFR era superiore a quella di altre F-DOP13 derivate dal cancro del polmone (Figura 4). Pertanto, un HTS che utilizza DOP, che mantengono le caratteristiche del tessuto tumorale, è superiore per la valutazione di potenziali agenti antitumorali e presenta opportunità per la valutazione dei farmaci e progressi nella medicina personalizzata. Sebbene hTS sia adatto per lo screening iniziale degli agenti, non riproduce il microambiente tumorale e quindi non può valutare l'efficacia dei farmaci in vivo. Pertanto, un sistema in vitro in grado di imitare il tessuto tumorale umano in vivo mediante co-coltura con cellule endoteliali vascolari e altre cellule stromali o tecnologia organ-on-a-chip in assenza di modelli animali è ora in fase di sviluppo.
Disclosures
Fujifilm Wako Bio Solutions Corporation è una consociata di Fujifilm Wako Pure Chemicals, proprietaria commerciale di supporti F-PDO e F-PDO mediante trasferimento di licenza.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare i pazienti che hanno fornito i campioni clinici utilizzati in questa ricerca. Questa ricerca è supportata da sovvenzioni del Programma di ricerca traslazionale della Prefettura di Fukushima.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well Ultra-Low Attachment Spheroid Microplate | Corning | 4516 | Plates for HTS |
| 40-µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| AdoptCell-NK kit | Kohjin Bio | 16030400 | Kit for NK cell production |
| Cancer Cell Expansion Media plus | Fujifilm Wako Pure Chemical | 032-25745 | Medium for F-PDO |
| ALyS505N-175 | Cell Science & Technology institute | 10217P10 | Medium for NK cells |
| CELL HANDLER | Yamaha Motor | - | Cell picking and imaging system |
| CellPet FT | JTEC | - | Cell fragmentation and dispersion equipment |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9683 | Cell viability luminescent assay, intracellular ATP measuring reagent |
| Echo 555 | Labcyte | - | Liquid handler |
| EnSpire | PerkinElmer | - | Plate reader |
| E-plate VIEW 96 | Agilent | 300601020 | Plates are specifically designed to perform cell-based assays with the xCELLigence RTCA System |
| Fibronectin Solution | Fujifilm Wako Pure Chemical | 063-05591 | Plate coating for xCELLigence RTCA System |
| F-PDO | Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International | - | The F-PDO can be purchased from Fujifilm Wako Pure Chemicals or Summit Pharmaceuticals International |
| Morphit software, version 6.0 | The Edge Software Consultancy | Biological data analysis software | |
| Multidrop Combi | ThermoFisher Scientific | 5840300 | Cell suspension dispenser |
| Precision Chamber | Yamaha Motor | JLE9M65W230 | Chamber for picking cell clusters using CELL HANDLER |
| Precision Tip | Yamaha Motor | JLE9M65W300 | Micro tip for picking cell clusters using CELL HANDLER |
| RLUN007 | Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International | Lung tumor derived F-PDO | |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604021 | Cell culture dissociation reagent |
| Ultra-Low Attachment 25 cm² Flask | Corning | 4616 | Culture flask for PDO |
| Ultra-Low Attachment 75 cm² Flask | Corning | 3814 | Culture flask for PDO |
| Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer System | Beckman coulter | - | Cell viability analyzer |
| xCELLigence immunotherapy software, version 2.3 | ACEA Bioscience | - | Analysis software for xCELLigence RTCA System |
| xCELLigence RTCA System | ACEA Bioscience | - | Electrical impedance measuring instrument for cytolysis |
References
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