Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Sv Ansikte Endokardiell kuddeberedning för planär morfogenesanalys i musembryon

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/64207
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Intercellular Signalling in Cardiovascular Development and Disease Laboratory, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), 2Ciber de Enfermedades Cardiovasculares

Summary

Klassiskt har endokardiet hos musens embryonala ventilprimordium analyserats med hjälp av transversala, koronala eller sagittala sektioner. Vårt nya tillvägagångssätt för en ansikte, tvådimensionell avbildning av endokardiet vid valvulogena regioner möjliggör plan polaritet och cellomläggningsanalys av endokardiet under ventilutveckling.

Abstract

Studien av de cellulära och molekylära mekanismerna som ligger till grund för utvecklingen av däggdjurshjärtat är avgörande för att ta itu med mänsklig medfödd hjärtsjukdom. Utvecklingen av de primitiva hjärtklaffarna involverar epitel-till-mesenkymal övergång (EMT) av endokardiella celler från de atrioventrikulära kanalerna (AVC) och utflödeskanalen (OFT) i hjärtat som svar på lokala induktiva myokardiella och endokardiella signaler. När cellerna delaminerar och invaderar den extracellulära matrisen (hjärtgelé) som ligger mellan endokardiet och myokardiet bildas de primitiva endokardiella kuddarna (EC). Denna process innebär att endokardiet måste fylla luckorna som lämnas av de delaminerade cellerna och måste omorganisera sig för att konvergera (smala) eller förlänga (förlänga) längs en axel. Aktuell forskning har involverat den plana cellpolaritetsvägen (PCP) för att reglera den subcellulära lokaliseringen av de faktorer som är involverade i denna process. Klassiskt har de inledande faserna av hjärtklaffsutveckling studerats i tvärsnitt av embryonala hjärtan eller in ex vivo AVC eller OFT explanter odlade på kollagengeler. Dessa tillvägagångssätt möjliggör analys av apico-basal polaritet men tillåter inte analys av cellbeteende inom epitelets plan eller av de morfologiska förändringarna hos migrerande celler. Här visar vi ett experimentellt tillvägagångssätt som möjliggör visualisering av endokardiet vid valvulogena regioner som ett planfält av celler. Detta experimentella tillvägagångssätt ger möjlighet att studera PCP, plan topologi och intercellulär kommunikation inom endokardiet hos OFT och AVC under ventilutveckling. Dechiffrera nya cellulära mekanismer som är involverade i hjärtklaffmorfogenes kan bidra till att förstå medfödd hjärtsjukdom i samband med endokardiella kudddefekter.

Introduction

Hjärtat är det första funktionella organet i ett däggdjursembryo. Runt embryonal dag (E) 7,5 hos möss bildar bilaterala precardiac mesodermceller hjärtmånen i ventralsidan1. Hjärtmånen innehåller två populationer av prekardiella celler som inkluderar föregångare till myokardiet och endokardiet2. Runt E8.0 smälter hjärtprekursorerna samman i mittlinjen och bildar det primitiva hjärtröret som består av två epitelvävnader, det yttre myokardiet och det inre endokardiet, som är ett specialiserat endotel åtskilt av en extracellulär matris som heter hjärtgelé. Senare, vid E8.5, genomgår hjärtröret högerslinga. Det loopade hjärtat har olika anatomiska regioner med specifika molekylära signaturer såsom utflödeskanalen (OFT), ventriklarna och atrio-ventrikulärkanalen (AVC)3. Även om hjärtröret initialt expanderar vid sin inflödessida genom tillsats av celler4, vid E9.5, resulterar intensiv hjärtproliferation i ballongbildning av kamrarna och etablering av det trabekulära nätverket5. Ventilbildning sker i AVC (framtida mitral- och tricuspidventiler) och i OFT (framtida aorta- och lungventiler).

Endokardiet spelar avgörande roller i ventilutvecklingen. Endokardiella celler genomgår epitel-mesenkymal övergång (EMT) i AVC och OFT för att bilda endokardiella kuddar, en struktur som uppträder vid början av ventilutvecklingen. Olika signalvägar aktiverar denna process; vid E9.5 hos möss främjar NOTCH aktiverat i endokardiet som svar på myokardiell härledd BMP2 invasiv EMT av endokardiella celler i AVC- och OFT-regionerna genom aktivering av TGFβ2 och SNAIL (SNAI1), som direkt undertrycker uttrycket av vaskulär endotelkadherin (VE-cadherin), en transmembrankomponent i adherenskorsningar (AJs)6,7,8 . I OFT förmedlas aktivering av endokardiet för att initiera EMT av FGF8 och BMP4, vars uttryck aktiveras av NOTCH 9,10,11,12.

Progression av EMT involverar cellulär dynamik när celler ändrar form, bryter och gör om korsningar med sina grannar, delaminerar och börjar migrera13. Dessa förändringar inkluderar AJ-ombyggnad och gradvis demontering av 14,15, planar cellpolaritet (PCP) -signalering, förlust av apico-basal polaritet (ABP), apikal förträngning och cytoskelettorganisation 16,17. ABP avser fördelningen av proteiner längs den främre-bakre axeln hos en cell. I det utvecklande hjärtat krävs ABP-reglering i kardiomyocyter för ventrikulär utveckling18. PCP avser en polariserad fördelning av proteiner i celler över planet för en vävnad och reglerar cellulär distribution; Epitel med en stabil geometri består av hexagonformade celler, där endast tre celler konvergerar vid hörnen 19,20,21,22. Olika cellulära processer, såsom celldelning, grannutbyte eller delaminering som inträffar under epitelmorfogenes, ger en ökning av antalet celler som konvergerar på ett hörn och antalet angränsande celler som en given cell har22. Dessa cellulära beteenden relaterade till PCP kan regleras av olika signalvägar, aktindynamik eller intracellulär handel23.

De data som genereras för att studera ventilutveckling hos möss har erhållits från transversala, koronala eller sagittala sektioner av E8.5 och E9.5 embryonala hjärtan, där endokardiet visas som en linje av celler istället för som ett fält av celler - endokardiet täcker hela innerytan av hjärtröret24. Embryonala sektioner tillåter inte analys av PCP i endokardiet hos musembryon. Vår nya experimentella metod möjliggör analys av endokardiell cellfördelning, AJ-anisotropi och encellsformanalys, vilket visas i de representativa resultaten. Denna typ av data krävs för PCP-analys, tillsammans med beskrivningen av andra molekyler relaterade till PCP, som inte visas i denna rapport. Helmonterad immunofluorescens, specifik provberedning och användning av genetiskt modifierade möss möjliggör planär polaritetsanalys i endokardiet vid början av ventilutveckling hos möss.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Djurstudier godkändes av Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) etikkommitté för djurförsök och av Madrids kommun (se PROEX 155.7/20). Alla djurförsök överensstämmer med EU-direktiv 2010/63EU och rekommendation 2007/526/EG om skydd av djur som används för försök och andra vetenskapliga ändamål, antagna i spansk lag enligt Real Decreto 1201/2005.

1. Obtention av AVC och / eller OFTs (anpassad från Xiao et al. 25)

  1. Sätt upp korsningar på eftermiddagen mellan kvinnliga mTmG och manliga VE-Cadherin-Cre-ERT/+.
  2. Nästa morgon, kolla efter en vaginal plugg. Om det finns en vaginal plugg, räkna den som en halv dag (E0.5). Beroende på experimentet av intresse, räkna 8 dagar eller 9 dagar.
  3. 24 h före dissektion, sondmatning av den gravida honan oralt med 50 μl 5 mg/ml 4-OH-Tamoxifen utspädd i majsolja.
    OBS: Denna dos kommer att inducera en begränsad mängd CRE-medierad rekombination som avslöjas av närvaron av GFP-positiva kloner. Lämplig dos måste bestämmas för varje ny sats av 4-OH-Tamoxifen.
  4. Offra den gravida kvinnan vid E8.5 eller E9.5 genom cervikal dislokation.
  5. Öppna buken på de gravida mössen med sax och ta bort livmodern som innehåller embryona med sax och fina pincett.
  6. Placera livmodern i en petriskål som innehåller iskall 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 0,1% Tween-20 (PBT).
  7. Ta bort den enskilda deciduae från livmodern under ett dissekerande mikroskop och använd fina pincett.
  8. Använd fin pincett, gör ett snitt i den vita delen av decidua, det är där embryot är, ta bort det försiktigt, undvik att dra och överför embryona till en ny petriskål med färsk PBT med en P1000 med spetsen avskuren, vilket lämnar en diameter som är tillräckligt stor för att ett embryo ska kunna passera utan att gå sönder.
  9. För genotypning, ta en liten bit av äggula sac (0,5 mm2) eller en bit av svansen (från den bakre änden, räkna 5 till 10 somiter mot huvudet) och smälta den i 100 μL lämplig buffert.
  10. Under dragskåpet överför du embryona till iskall 4% paraformaldehyd (4% PFA) i sterilfiltrerad PBS i ett mikrocentrifugrör (2 ml) vid 4 °C. Fixera embryona från 2 timmar till natten (O/N) vid 4 °C på en nutator.
  11. Ta bort 4% PFA-fixeringsmedlet under dragskåpet från mikrocentrifugrören utan att vidröra embryona. Kassera PFA i en lämplig behållare.
  12. Tvätta embryona 5x i kall PBT i 10 min vardera vid rumstemperatur (RT).
  13. Ta bort hjärtat med fina pincett och överför det till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör med färsk PBT.

2. Helmonterad immunofluorescens av musens embryonala hjärta

  1. Byt ut PBT mot PBSTr (0,4% Triton X-100 i PBS) och tvätta proverna 3x, 5 min vardera, vid RT på en orbital shaker.
  2. Byt ut PBSTr med blockerande lösning (PBSTr med 10% värmeinaktiverat bovint serum). Inkubera från 2 timmar till O/N vid 4 °C i en orbitalskakapparat.
  3. Byt ut blockeringslösningen med blockerande lösning som innehåller primär antikropp vid önskad koncentration (för anti-GFP eller anti-VE-Cadherin-antikropp, använd 1:1000 utspädning). Inkubera O/N på en orbitalskakapparat vid 4 °C.
  4. Efter O/N-inkubation vid 4 °C inkubera i 1,5 timmar vid RT på en orbitalskakapparat. Detta steg är mycket viktigt för att öka signal-brusförhållandet.
  5. Ta bort och förvara den primära antikroppslösningen vid 4 °C i upp till tre framtida experiment (tillsätt natriumazid till en slutlig koncentration på 0,02 % för bästa bevarande).
  6. Tvätta embryona 3x med PBSTr i 3 min vardera.
  7. Tvätta embryona med PBSTr 3x i 30 min vardera på en orbital shaker vid 4 °C.
  8. Efter den sista tvätten, tillsätt 1 ml blockerande lösning innehållande 1:1000 fluorescenskonjugerad sekundär antikropp mot den primära antikroppsvärdarten. Tillsätt även 1:3000 DAPI till lösningen och inkubera embryona O/N på en orbital shaker vid 4 °C.
  9. Efter O/N-inkubation vid 4 °C inkubera i 1,5 timmar vid RT på en orbitalskakapparat. Detta steg är mycket viktigt för att öka signal-brusförhållandet.
  10. Tvätta embryona 3x med PBSTr i 3 min vardera.
  11. Tvätta embryona med PBSTr 3x-5x i 30 min vardera på en orbital shaker vid RT.

3. Montering av musens embryonala AVC eller OFTs

  1. Lägg hjärtan på en petriskål (35 mm) som innehåller PBS.
  2. Använd en volframtråd och fina pincett, isolera AVC eller OFT och skär dem i längdriktningen26.
  3. Förbered täckglas (22 mm x 22 mm), glidbanor (60 mm x 24 mm), pincett, en P200-pipett med lämpliga spetsar, pappershandduk och alla vattenbaserade glycerolbaserade monteringsmedier för fluorescens, utan DAPI.
  4. Använd ett liknande tillvägagångssätt som i Xiao, C. et al.25, stick två tejpremsor på en bild, åtskilda av 0,3-0,6 cm för att skapa ett 3D-rumsutrymme som gör att proverna kan bevara den ursprungliga formen utan att krossa dem.
  5. Försiktigt, och med minsta volym buffert, släpp proverna på bilden mellan bandremsorna med en skuren P200-spetspipett. Använd ett dissekerande mikroskop för att öka noggrannheten.
  6. Använd fina pincett, placera proverna med endokardiet uppåt (myokardium ner på bilden).
  7. Ta bort överflödig PBS med en pappershandduk (undvik att röra vid provet) och torka sedan proverna i 1-2 minuter vid RT så att proverna fastnar på bilden.
  8. Tillsätt 40 μl vattenbaserade monteringsmedier på vävnaden.
  9. Placera täckglaset över de två tejpbitarna och sänk det långsamt ner på vävnaden med en nål eller pincett. Undvik att skapa luftbubblor.
  10. Försegla täckglaset med en droppe nagellack på varje hörn av täckglaset.
  11. När nagellacket är torrt, rengör det överflödiga monteringsmediet från sidorna av täckglaset med hjälp av en absorberande pappershandduk. Undvik att flytta täckglaset.
  12. Tillsätt nagellack längs täckglasets kanter för att försegla det helt, vilket förhindrar avdunstning av monteringsmedier.
  13. Använd ett upprätt eller ett inverterat konfokalmikroskop och ta bilder vid 10x för allmän visning och vid 63x med 3x zoom för detaljerade bilder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Data som genereras med hjälp av detta protokoll visar att det är möjligt att utföra en ansiktsavbildning av endokardiet hos AVC. Det första målet var att analysera endokardiets cellform under bildandet av ventilerna vid en cellulär upplösning (Figur 1). För att markera enskilda endokardiella celler vid E9.5 använde vi två transgena musstammar. (1) ROSA mT/mG är en tvåfärgad fluorescerande Cre-reporterallel (tdTomato/mT och EGFP/mG) vars fluorescens detekteras vid cellmembranet. Utan Cre-medierad aktivering uttrycker transgenen tdTomato (mT). Vid Cre-medierad aktivering ersätts tdToto-uttryck med EGFP-fluorescensuttryck (mG) i specifika celler och klonala derivat27. (2) Cdh5CreERT2/+ muslinjen uttrycker tamoxifeninducerbart CRE-rekombinas (CreERT2) under reglering av den vaskulära endotelkadherinpromotorn (Cdh5), som uttrycks i det vaskulära endotelet och endokardiet i embryonala steg28. Vi korsade en hane och en hona av varje genotyp för att få embryon som bär de två transgenerna för att aktivera uttrycket av GFP i enskilda celler i endokardiet. För att uppnå detta inokulerade vi låga doser av tamoxifen för att aktivera CRE-uttryck i ett reducerat antal celler. Som ett resultat uttryckte enstaka celler, eller kloner av få celler, GFP i endokardiet (figur 1A). GFP-uttryck (figur 1A,B) i kombination med VE-Cadherin subcellulär lokalisering (figur 1C) är ett effektivt tillvägagångssätt för att studera förhållandet mellan AJ-dynamik och filopodibildning i pre-EMT-celler eftersom dessa celler utvecklar membranutsprång när AJs löser upp29. PCP-signaler kan ge anisotrop kontraktilitet på AJs, vilket producerar cellulära krafter som främjar polariserad morfogenes i epitel30. Vi fann skillnader i intensiteten av VE-Cadherin-färgning i endokardiet (figur 2), vilket indikerar att vi inte kan kassera anisotrop kontraktilitet i det embryonala endokardiet av AVC vid pre-valvulära stadier.

Det andra målet var att analysera endokardiets plana topologi under ventilutveckling (figur 2). För att definiera antalet celler som konvergerar i ett enda hörn färgade vi hela hjärtat med VE-Cadherin-antikropp vid E8.5 och E9.5 (figur 2A, B). Andra molekyler lokaliserade vid cell-cellkontakter i endokardialcellen skulle också vara användbara för detta ändamål (t.ex. β-Catenin). Vid E8.5 tenderar endokardiet hos AVC att ha en stabil epitelorganisation, och vi kunde inte upptäcka hörn som bildas av mer än fyra celler (figur 2A, C). Senare vid E9.5 hittade vi hörn som består av upp till sex celler som bildar rosettliknande strukturer (figur 2B, D), liknande den cellulära organisationen som tidigare beskrivits i epitel som genomgår aktiva cellomarrangemang31, vilket tyder på att AVC-endokardiet genomgår aktiv cellulär omläggning under ventilutveckling.

Figure 1
Figur 1: Encellsformanalys i prevalvulärt endokardium. (A) AVC från E9.5 musembryo öppnat i längdriktningen som visar spridda GFP-positiva celler. (B) GFP-uttryck i enskilda celler definierar cellform vid cellulär upplösning. (C) Helmonterad färgning av VE-Cadherin belyser AJs. Filopodier genereras i domäner i cellen som inte lokaliserar VE-Cadherin (lila pilar), och vice versa, VE-Cadherin lokaliserar i domäner i cellen som är släta och inte bildar filopodier (blå pilspetsar). v, ventral; d, dorsal. Skalstången i A är 100 μm; i B och C är 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Planar topologi och anisotropi av planarly lokaliserade proteiner kan definieras i en ansiktsbilder av endokardium vid AV-kanalen. VE-Cadherin är lokaliserad vid endokardiets cellkontakter. (A) E8.5 och (B) E9.5 AVC från embryon öppnades i längdriktningen. Förstoring i (C) och (D) gjorde det möjligt för oss att observera antalet celler som konvergerar i ett hörn. Dessutom kan vi skilja olika intensiteter i VE-Cadherin-färgningen, vilket indikerar att dess placering i AVC är anisotrop. Skalfältet i A och B är 100 μm; i C och D är 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Endokardiet är ett epitelmonolager som täcker hela den inre ytan av det embryonala hjärtröret. Under ventilutveckling genomgår endokardiella celler vid de potentiella klaffregionerna EMT, så endokardiella celler transformerar och omorganiserar deras cytoskelett för att delaminera från endokardiet mot hjärtgelén. Vi och andra har fått relevanta data om ventilutveckling i musembryon genom att analysera tvärgående sektioner av E8.5 och E9.5 embryonala hjärtan, där endokardiet visas som en rad celler 6,8,24,32. Detta tillvägagångssätt möjliggjorde analys av uttrycket av signalvägar och andra molekyler som är involverade i ventilutveckling, men det var inte möjligt att analysera rumsliga aspekter av det pre-valvulära endokardiet.

AVC- eller OFT-explanter användes främst för att studera transformerande EC på en 3D-kollagengel. Explants är användbara för EMT-kvantifiering, analys av transformationskapacitet eller testning av läkemedel efter några dagar i kultur 6,7,11,33. Dessa ex vivo-experiment möjliggör också expansion av endokardiet ovanpå kollagengelén som ett monolager, men miljöförhållandena där ex vivo hjärtexplanter odlas skiljer sig från i livmodern. Till exempel är enkelriktat blodflöde viktigt för korrekt ventilutveckling34,35 och uppnås endast i in utero, inte in ex vivo, explants.

Detta nya tillvägagångssätt gör det möjligt för oss att observera det intakta klaffade endokardiet ett ansikte under början av ventilutvecklingen utan någon miljömanipulation. Det möjliggör analys av cellfördelningen av det klaffära endokardiet, såväl som encellsformanalys före och under EMT i utero-förhållanden . Vi kan också observera och analysera intensiteten och organisationen av cell-cellkontakterna och den subcellulära fördelningen av relevanta molekyler under EMT. Denna teknik erbjuder också möjligheten att analysera subcellulära strukturer i endokardiet, aktiveringen av signalvägar med hjälp av reportergener, effekten som geninaktivering kan ha på cellulärt beteende och hur det kan påverka angränsande celler av vild typ.

För att få högkvalitativa prover är det viktigt att vara mycket försiktig när du hanterar dem, eftersom föroreningar (t.ex. mikrofibrer) som fastnar i vävnaden kan resultera i artefakter under bildtagningen. Dessutom, eftersom de är mycket små prover, är risken för att bryta hög, så man måste tvätta vävnaden (steg 1. och steg 2.) i långsamma shakers. Under byte av media med pipetter rekommenderar vi att du skär av spetsen för att förhindra att vävnaden kollapsar när den passerar genom spetsen om den absorberas av misstag. För att bli expert på denna teknik krävs en inlärningskurva, som blir längre eller kortare beroende på forskarens tidigare erfarenhet av mikromanipulation.

Att välja rätt fixerings- och fixeringstid kan vara viktigt vid användning av transgener som uttrycker fluorescerande proteiner. Den anatomiska strukturen påverkas inte av olika fixeringsmedel som etanol 70%, metanol, PFA 4% eller formalin 10%.

För motfärgning av kärnor rekommenderar vi inkubation av prover med DAPI eftersom penetration är mycket effektivare än att använda monteringsmedia med DAPI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av bidragen PID2019-104776RB-I00 och CB16/11/00399 (CIBER CV) från MCIN/AEI/10.13039/501100011033 till J. L. P. J.G.-B. finansierades av Programa de Atracción de Talento från Comunidad de Madrid (2020-5ª/BMD-19729). T.G.-C. finansierades av Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). Vi tackar CNIC Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, ICTS-ReDib, medfinansierad av MCIN/AEI /10.13039/501100011033 och FEDER "A way to make Europe" (#ICTS-2018-04-CNIC-16). Vi tackar också A. Galicien och L. Méndez för mushållning. Kostnaden för denna publikation stöddes delvis av medel från Europeiska regionala utvecklingsfonden. CNIC stöds av ISCIII, MCIN och Pro CNIC Foundation och är ett Severo Ochoa Center of Excellence (bidrag CEX2020-001041-S) finansierat av MCIN/AEI /10.13039/501100011033.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-OH-Tamoxifen Sigma Aldrich H-6278
16 % Paraformaldheyde Electron Microscopy Sciences 157-10 Dilute to 4% in water
anti-GFP Aves Labs FGP-1010
anti-VECadherin BD Biosciences 555289
Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11039
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 115-605-174
DAPI AppliChem A4099,0005
Slides Superfrost PLUS VWR 631-0108 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML
Tween 20 A4974,0500 AppliChem
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
  2. Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
  3. Ivanovitch, K., et al. outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak. PLoS Biology. 19 (5), 3001200 (2021).
  4. Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. G. Signaling pathways controlling second heart field development. Circulation Research. 104 (8), 933-942 (2009).
  5. Moorman, A. F., Christoffels, V. M. Cardiac chamber formation: Development, genes, and evolution. Physiological Reviews. 83 (4), 1223-1267 (2003).
  6. Timmerman, L. A., et al. Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation. Genes & Development. 18 (1), 99-115 (2004).
  7. Luna-Zurita, L., et al. Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).
  8. Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. L. Bmp2 and Notch cooperate to pattern the embryonic endocardium. Development. 145 (13), (2018).
  9. MacGrogan, D., Luna-Zurita, L., de la Pompa, J. L. Notch signaling in cardiac valve development and disease. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 91 (6), 449-459 (2011).
  10. de la Pompa, J. L., Epstein, J. A. Coordinating tissue interactions: Notch signaling in cardiac development and disease. Developmental Cell. 22 (2), 244-254 (2012).
  11. Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).
  12. Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation Research. 109 (2), 183-192 (2011).
  13. Amack, J. D. Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79 (2021).
  14. Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).
  15. Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).
  16. Weng, M., Wieschaus, E. Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly. Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).
  17. Weng, M., Wieschaus, E. Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning. Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).
  18. Jimenez-Amilburu, V., et al. In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation. Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).
  19. Davey, C. F., Moens, C. B. Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally. Development. 144 (2), 187-200 (2017).
  20. Grego-Bessa, J., et al. The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium. Elife. 5, 12034 (2016).
  21. Jones, C., Chen, P. Planar cell polarity signaling in vertebrates. Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).
  22. Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo. Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).
  23. Devenport, D. Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors. Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).
  24. Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop. Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).
  25. Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence. Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).
  26. Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).
  27. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  28. Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
  29. Yilmaz, M., Christofori, G. EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).
  30. Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
  31. Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis. Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).
  32. Prados, B., et al. Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity. Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).
  33. Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan. Experimental & Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).
  34. Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. Influence of blood flow on cardiac development. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).
  35. Goddard, L. M., et al. Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis. Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).

Tags

Utvecklingsbiologi nummer 185
<em>Sv Ansikte</em> Endokardiell kuddeberedning för planär morfogenesanalys i musembryon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gonzalez-Costa, T., de la Pompa, J.… More

Gonzalez-Costa, T., de la Pompa, J. L., Grego-Bessa, J. En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (185), e64207, doi:10.3791/64207 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter