Summary
Este protocolo describe un enfoque para facilitar ediciones precisas en embriones de pez cebra utilizando la tecnología CRISPR-Cas9. Se presenta una tubería de fenotipado para demostrar la aplicabilidad de estas técnicas para modelar una variante genética asociada al síndrome de QT largo.
Abstract
Las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) en modelos animales permiten una manipulación genética precisa para el estudio de fenómenos fisiológicos. El pez cebra se ha utilizado como un modelo genético eficaz para estudiar numerosas cuestiones relacionadas con la enfermedad hereditaria, el desarrollo y la toxicología a nivel de todo el órgano y el organismo. Debido al genoma del pez cebra bien anotado y mapeado, se han desarrollado numerosas herramientas para la edición de genes. Sin embargo, la eficacia de generar y la facilidad de detectar ediciones precisas utilizando CRISPR es un factor limitante. Aquí se describe un enfoque knock-in basado en CRISPR-Cas9 con la detección simple de ediciones precisas en un gen responsable de la repolarización cardíaca y asociado con el trastorno eléctrico, el síndrome de QT largo (LQTS). Este enfoque de ARN de dos guías únicas (sgRNA) elimina y reemplaza la secuencia objetivo y vincula un gen informador codificado genéticamente. La utilidad de este enfoque se demuestra mediante la descripción de mediciones fenotípicas no invasivas de la función eléctrica cardíaca en larvas de pez cebra de tipo salvaje y editadas genéticamente. Este enfoque permite el estudio eficiente de las variantes asociadas a la enfermedad en un organismo completo. Además, esta estrategia ofrece posibilidades para la inserción de secuencias exógenas de elección, como genes reporteros, ortólogos o editores de genes.
Introduction
Las estrategias de edición de genes basadas en CRISPR en modelos animales permiten el estudio de enfermedades genéticamente hereditarias, el desarrollo y la toxicología a nivel de todo el organismo 1,2,3. El pez cebra proporciona un modelo poderoso que está más cerca en numerosos aspectos fisiológicos de los humanos que los modelos celulares murinos o derivados de humanos4. Se ha utilizado una amplia gama de herramientas y estrategias genéticas en el pez cebra tanto para el cribado genético hacia adelante5 como para el inverso6. El mapeo genético integral y la anotación en el pez cebra han facilitado los enfoques de edición de genes como una técnica primaria para diseñar knockouts de genes dirigidos (KO) y knock-ins precisos (KI)7.
A pesar de esto, la generación de ediciones precisas de KI en el pez cebra está limitada por las bajas eficiencias y la dificultad de una detección precisa. Aunque las nucleasas efectoras similares a factores de transcripción (TALEN) se han utilizado y optimizado con éxito para KI8, CRISPR proporciona una estrategia mejorada de edición de genes con una orientación más simple de sgRNA. Numerosos estudios han utilizado CRISPR para generar KI precisos en peces cebra 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, aunque estas ediciones generadas a través de la reparación dirigida por homología mediada por CRISPR (HDR) tienden a ser ineficientes con bajo éxito intrínseco tasas que requieren genotipado como cribado primario 9,10,14,21. Esto demuestra la necesidad de un sistema KI CRISPR eficiente en el pez cebra, así como un sistema confiable de alto rendimiento para detectar ediciones precisas.
El objetivo de este estudio fue describir una plataforma para generar un gen cardíaco preciso KI en corazones de pez cebra con detección simple y de alto rendimiento de ediciones exitosas. Se describe un enfoque de reemplazo de exón de dos sgRNA basado en CRISPR-Cas9, que se basa en un enfoque TALEN8. Este enfoque implica la escisión de la secuencia diana utilizando guías de dos sgRNA y el reemplazo con una secuencia plantilla exógena que contiene el KI de interés, así como un gen informador intrónico codificado genéticamente (Figura 1). La integración de un reportero fluorescente codificado genéticamente dentro de la secuencia intrónica del gen objetivo permite la detección eficiente de ediciones positivas. Luego se describe una plataforma de fenotipado para evaluar la función eléctrica cardíaca en larvas de pez cebra para la caracterización no invasiva de las variantes genéticas asociadas con LQTS hereditario, un trastorno eléctrico cardíaco que predispone a los individuos a la muerte súbita cardíaca.
Estos enfoques mejorarán el acceso y el uso de las ediciones del gen KI del pez cebra para modelar enfermedades hereditarias y abordar cuestiones biológicas y fisiológicas, como el mapeo de patrones de expresión génica y la regulación del desarrollo. Dado que los corazones de pez cebra son mejores características electrofisiológicas cardíacas humanas paralelas que los modelos murinos, pueden ser particularmente atractivos como un sistema genéticamente tratable para el modelado de enfermedades cardíacas 7,22,23.
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Protocol
Los estudios con pez cebra se realizaron de acuerdo con las políticas y procedimientos del Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Simon Fraser y el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales y se completaron bajo el protocolo # 1264K-18.
1. Diseño de componentes CRISPR para ediciones precisas
- Para diseñar las dos guías de ARNg que se utilizarán para extirpar la secuencia que contiene el sitio objetivo de KI, primero identifique el ortólogo del pez cebra para el gen de interés.
NOTA: La figura 2 proporciona una descripción general resumida de los pasos para diseñar ediciones precisas utilizando el enfoque CRISPR-Cas9 de dos sgRNA. - A continuación, utilice una herramienta de software de diseño, como CRISPOR24, que incluye la selección de Danio rerio como especie y de la enzima Cas que se utilizará.
NOTA: El gen de interés para este estudio fue zkcnh6a (Ensembl Transcript ID: ENSDART00000090809.6; UniProt Protein ID: B3DJX4), y la mutación objetivo fue el aminoácido, R56Q.- Para el enfoque de dos sgRNA, elija una ubicación de sgRNA que preceda al exón objetivo y una segunda sgRNA que se encuentre dentro del intrón inmediatamente posterior.
- Asegúrese de que los sgRNAs seleccionados tengan una alta especificidad y una baja unión prevista fuera del objetivo. Utilice las clasificaciones de CRISPOR para identificar guías con un enlace mínimo fuera del objetivo. No considere guías sin desajustes en la secuencia semilla de posibles objetivos fuera de lugar.
- Identifique los sitios potenciales fuera del objetivo más probables (según las puntuaciones CRISPOR, seleccione los tres sitios potenciales de exón principales fuera del objetivo) para el genotipado de secuenciación de Sanger basado en PCR en el paso 6.1.3.
- Una vez seleccionados los dos sgRNAs, obtener el complemento inverso para cada uno, de modo que haya cuatro oligonucleótidos a utilizar: dos oligos complementarios que preceden a la mutación y dos oligos complementarios que están aguas abajo.
- En cada uno de los cuatro oligos, agregue sitios de restricción compatibles para su incorporación en un plásmido guía de elección; para la integración en el plásmido DR274, utilice un sitio de restricción BsaI de 5' para crear un voladizo. Asegúrese de que el sitio de reconocimiento Bsa1 esté diseñado en el extremo 5' de la guía seleccionada de CRISPOR y que el sitio de reconocimiento Bsa1 esté diseñado en el extremo 5' de las hebras complementarias para garantizar la orientación correcta de las guías en el plásmido DR274 (consulte la figura 3).
- Para diseñar la plantilla exógena utilizada para HDR en pez cebra (Figura 1), elija dos fragmentos de secuencia que flanquearán el gen reportero YFP mVenus alojado en el plásmido pKHR5.
NOTA: La modificación/edición prevista se puede incluir en el fragmento ascendente o descendente.- Usando Ensembl, localice el sitio objetivo dentro de la secuencia de genes de interés, incluyendo aproximadamente la secuencia flanqueante de 2 kb (brazo de homología), que se utilizará para hacer la plantilla.
NOTA: Los brazos de homología pueden ser simétricos o asimétricos25,26 y aproximadamente 1 kb cada uno, aguas arriba y aguas abajo del sitio objetivo. - Divida la plantilla en dos segmentos que se insertarán a cada lado del gen reportero mVenus YFP (véase la figura 4). Asegúrese de que el sitio dividido está en un intrón para que la secuencia de codificación no se interrumpa.
NOTA: Si el gen está bien caracterizado, verifique las funciones funcionales en el intrón, como los sitios de empalme o las regiones reguladoras. Las regiones cercanas a los extremos 5' o 3' están más a menudo involucradas en el empalme de ARNm. - Incorporar modificaciones en la secuencia de plantillas que incluyan i) mutaciones silenciosas en el motivo adyacente del protoespaciador guía (PAM) o la secuencia de semillas (tenga en cuenta los sitios PAM alternativos a los que la enzima Cas podría apuntar) para evitar el recorte de la enzima Cas; ii) la modificación de intereses; iii) la creación de sitios de restricción endonucleasa para facilitar la clonación en el plásmido pKHR5, que contiene el gen informador YFP mVenus (ver Figura 3).
NOTA: En este estudio, el primer segmento de plantilla contenía XhoI aguas arriba del sitio de mutación R56Q y SalI aguas abajo, mientras que el segundo segmento de plantilla tenía EcoRI aguas arriba de la secuencia objetivo guía y BamHI aguas abajo. Si alguno de los sitios de restricción seleccionados está presente dentro de la secuencia de plantilla, se requerirán mutaciones para silenciarlos, o se pueden usar enfoques alternativos como Gibson Assembly.
- Usando Ensembl, localice el sitio objetivo dentro de la secuencia de genes de interés, incluyendo aproximadamente la secuencia flanqueante de 2 kb (brazo de homología), que se utilizará para hacer la plantilla.
2. Preparación de componentes CRISPR para microinyección de embriones
- Prepare el Cas9 para microinyección 1 semana antes de las microinyecciones. Utilice la proteína Cas9 o prepare el ARNm de Cas9 mediante transcripción in vitro .
NOTA: En este estudio, se utilizó ARNm Cas9, ya que las eficiencias tendían a ser mayores.- Amplificar los cultivos bacterianos de la puñalada de agar bacteriano XL1 Blue disponible comercialmente (que contiene plásmido Cas9) utilizando un antibiótico apropiado como la ampicilina. Utilice 675 μL de cultivo líquido (con 325 μL de glicerol) para crear un stock de glicerol de respaldo para el almacenamiento a largo plazo a -80 °C.
- Utilice el resto del cultivo líquido para una purificación de miniprep, de acuerdo con el protocolo provisto con el kit de miniprep. Resuspender el ADN purificado final en 50 μL del tampón de elución proporcionado. Cuantifique el producto a través de un espectrofotómetro para examinar el rendimiento y la pureza.
- Linealizar 2 μg del ADN purificado mediante digestión de restricción utilizando una enzima de restricción apropiada y utilizando el tampón y el tiempo de incubación apropiados indicados para la enzima de interés.
- Purificar el plásmido linealizado utilizando un kit de purificación por PCR, resuspendiéndolo en 30 μL del tampón de elución proporcionado.
- Después de cuantificar el producto, utilícelo como plantilla para la transcripción in vitro utilizando el kit de transcripción apropiado para el promotor de interés. Siga el protocolo proporcionado y purifique a través de la precipitación de cloruro de litio27. Resuspender el ARN purificado en 10 μL deH2Olibre de nucleasa y cuantificarlo antes de almacenarlo a -20 °C para su uso en la mezcla de microinyección.
- Prepare las dos guías de sgRNA.
- Prepare el plásmido sgRNA con un andamio amplificando cultivos bacterianos de la puñalada de agar bacteriano XL1 Blue disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) de la misma manera que MLM3613 anterior (paso 2.1.1), excepto que use kanamicina en lugar de ampicilina.
- Analice los dos pares de oligonucleótidos monocatenarios complementarios (ssODN) para las guías de sgRNA diseñadas anteriormente resuspendiendo primero las ssODN en 1x tampón de recocido a una concentración de 100 μM.
- En reacciones separadas para cada uno de los dos sgRNAs, analice el par de ssODNs complementarios usando un termociclador. Mezclar 2 μg de cada par de ssODN complementario con 50 μL de tampón de recocido e incubar a 95 °C durante 2 min, luego enfriar a 25 °C durante 45 min.
- Digiera un plásmido disponible comercialmente que contiene un andamio de ARNg. Digerir 2 μg del plásmido DR274 utilizando 1 μL de BsaI, 2 μL de tampón apropiado y ddH2O a 20 μL a 37 °C durante 1 h. Confirme la linealización (opcional: purificar con un kit de purificación de PCR) mediante electroforesis en gel28.
- En dos reacciones de ligadura separadas (una para cada sgRNA), ligar los ssODN recocidos con el plásmido DR274 linealizado. Utilice una relación inserto:vector molar de 3:1, calculando la masa apropiada a través de una calculadora de ligadura en línea. Mezclar la masa requerida del inserto y el vector con 1 μL de ADN ligasa T4, 2 μL de tampón de ligadura y ddH2O a 12 μL e incubar a temperatura ambiente durante 12 h.
- Transforme 2 μL del producto ligado en células competentes apropiadas (como células 10β) utilizando enfoques estándar, y luego amplíe y purifique el producto utilizando un kit Miniprep disponible comercialmente. Opcional: crear un stock de glicerol de este producto.
- Transcribir los dos sgRNAs linealizando 2 μg de cada guía utilizando un sitio de restricción aguas abajo de 3' que esté lo más cerca posible del final de la secuencia espacial. Para el plásmido DR274, linealizar con HindIII y luego purificar la plantilla de ARN utilizando un kit de purificación de PCR, resuspendiendo en 30 μL del tampón de elución.
- Transcribir las dos guías utilizando un kit de transcripción de ARN. Siga el protocolo del fabricante y purifique a través de la precipitación de cloruro de litio27. Resuspender las dos guías de sgRNA purificadas en 10 μL deH2Olibre de nucleasa, cuantificar y almacenar a -20 °C para su uso en la mezcla de microinyección.
NOTA: El kit de transcripción de ARN no puede incorporar una tapa de 5' o una cola poli-A.
- Prepare la plantilla de reportero HDR exógena y de doble cadena.
NOTA: La plantilla se sintetiza en dos partes, una aguas arriba y otra aguas abajo del gen reportero mVenus YFP. Estos dos segmentos son construcciones sintéticas ordenadas a través de un proveedor comercial y luego ligadas en el plásmido pKHR5 (que contiene mVenus YFP) secuencialmente.- Prepare el plásmido pKHR5 amplificando cultivos bacterianos de la cepa bacteriana DH5α disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) de la misma manera que MLM3613 anterior (paso 2.1.1).
NOTA: El plásmido pKHR5 contiene la secuencia del gen reportero mVenus YFP. - Resuspenda los dos segmentos de plantilla diseñados anteriormente a 100 μM en tampón TE y luego transfórmelos en celdas 10β.
- Digerir el primer segmento plantilla (el que está aguas arriba del gen reportero YFP de mVenus) y el plásmido pKHR5 utilizando las enzimas de restricción seleccionadas en el paso 1.3.3.
NOTA: El resumen secuencial de pKHR5 es necesario debido a la proximidad de los sitios de restricción seleccionados en el MCS. - Para preparar el plásmido pKHR5 para el segmento de plantilla aguas arriba, digiera 4 μg de pKHR5 (según el paso 2.2.4) con SalI y luego purifique usando un kit de purificación por PCR. Resuspender en 30 μL deddH2Oy utilizarlo como plantilla para la segunda reacción de digestión con XhoI. Purificar el producto utilizando el kit de purificación por PCR.
- Preparar el primer segmento de plantilla digiriendo 2 μg del segmento de plantilla (paso 2.3.2), 1 μL de XhoI, 1 μL de SalI, 2 μL de tampón apropiado y ddH2O a 20 μL durante 1 h a 37 °C y purificar el producto en gel.
- Ligue el segmento de plantilla aguas arriba del paso 2.3.5 en el pKHR5 preparado utilizando las condiciones de reacción descritas en el paso 2.2.5. Transforme el producto ligado en células 10β competentes, amplifique y purifique usando un miniprep (opcional: cree un stock de glicerol de este producto).
- Utilice el producto ligado del paso 2.3.6 (que contiene el primer segmento de plantilla ligado en el plásmido pKHR5 aguas arriba del gen reportero YFP de mVenus) y digiera para prepararse para el segundo segmento de plantilla (aguas abajo del reportero mVenus). Digerir 4 μg del producto ligado (del paso 2.3.6, como en el paso 2.2.4) con BamHI, y luego purificar utilizando un kit de purificación por PCR. Resuspender en 30 μL deddH2Oy utilizarlo como plantilla para la segunda reacción de digestión con EcoRI. Purificar el producto utilizando el kit de purificación por PCR.
- Preparar el segundo segmento de plantilla digiriendo 2 μg del segmento de plantilla (paso 2.3.2), 1 μL de BamHI, 1 μL de EcoRI, 2 μL de tampón apropiado y ddH2O a 20 μL durante 1 h a 37 °C y purificar el producto en gel.
- Ligue el segmento de la plantilla aguas abajo en el pKHR5 preparado (a partir del paso 2.3.7) utilizando las condiciones de reacción descritas en el paso 2.2.5. Transforme el producto ligado en células competentes, amplifique y purifique usando un kit de miniprep. Crear un stock de glicerol de este producto final, que contiene ambos segmentos plantilla ligados a ambos lados del gen reportero mVenus YFP dentro de pKHR5.
- Prepare el plásmido pKHR5 amplificando cultivos bacterianos de la cepa bacteriana DH5α disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) de la misma manera que MLM3613 anterior (paso 2.1.1).
- Prepare la mezcla de microinyección utilizando el ARNm Cas9, dos sgRNAs y la plantilla de reportero HDR exógeno.
- Mezcle 200 ng/μL de ARNm Cas9, 100 ng/μL de cada sgRNA y 200 ng/μL de plantilla de reportero HDR exógeno en 1x tampón de inyección hasta un volumen final de 20 μL.
- Conservar la mezcla de microinyección a -20 °C y desechar la mezcla no utilizada después de tres ciclos de congelación-descongelación.
NOTA: Utilice 4 nL de esta mezcla de microinyección para microinyección en el saco vitelino de cada embrión.
3. Cría de pez cebra y microinyección de embriones
NOTA: Los protocolos para la cría del pez cebra y la microinyección de embriones unicelulares se han descrito previamente 29,30,31.
- Para la cría, use pez cebra de la cepa AB y que tenga entre 6 y 12 meses de edad. Inyecte los embriones en la etapa de una célula aproximadamente 40 minutos después de la fertilización (ver Figura 5).
NOTA: Se desconocía el sexo biológico de los embriones inyectados; El dimorfismo sexual no es evidente hasta aproximadamente los 3 meses de edad32.
4. Cribado genético reportero de larvas de pez cebra editadas por CRISPR-Cas9
- Visualice la integración de YFP en larvas de pez cebra después de la microinyección de componentes CRISPR-Cas9 para detectar ediciones HDR exitosas.
- En una placa de Petri de 25 mm, anestesiar 24 larvas de pez cebra a los 3 días después de la fertilización (dpf) en sulfonato de metano tricaína al 0,3% (MS-222, tamponado a pH 7.0-7.4 con HEPES e hidróxido de sodio) hasta que pierdan su reflejo de autoenderezamiento (típicamente 1-2 min). Una vez anestesiada, transfiera cada larva a un pocillo individual de una placa de 24 pocillos.
- Usando un microscopio capaz de detectar GFP / YFP, detectar la fluorescencia del gen reportero en los ojos de cada larva individual.
- Capture imágenes de cada larva y documente la presencia o ausencia de expresión génica reportera.
5. Fenotipado de larvas de pez cebra editadas con CRISPR-Cas9
- Después de la detección de genes reporteros, realice fenotipado cardíaco (frecuencia cardíaca, dimensiones pericárdicas, ECG) en cada larva. Fenotipo Un número igual de larvas reporteras positivas y negativas para genes.
- Use una cámara CCD (por ejemplo, blackfly USB3) y un software de grabación de video e imágenes (por ejemplo, Micromanager para ImageJ) para medir la frecuencia cardíaca y las dimensiones pericárdicas mientras las larvas están anestesiadas.
- Para medir la frecuencia cardíaca, utilizando Micromanager, cree una región de interés (ROI) para capturar el corazón y excluir otras estructuras.
- Importe el vídeo a ImageJ como una secuencia de imágenes y asegúrese de que se introduce el número correcto de fotogramas en Número de imágenes.
- Una vez abierto el archivo, utilice la herramienta de selección de rectángulos para dibujar un ROI dentro del corazón pero excluyendo otros elementos móviles, y guarde el ROI en el administrador de ROI (analice | herramientas | Gestor de ROI).
- Haga clic en plugins | instalar, y seleccione el algoritmo de frecuencia cardíaca para instalar el código en la carpeta predeterminada, luego seleccione el plugin en la parte inferior de la pestaña de plugins . Graba las pulsaciones por minuto (bpm) desde la ventana emergente.
NOTA: Los algoritmos de detección de imágenes se escribieron a medida para detectar la frecuencia cardíaca midiendo los cambios individuales en la densidad de píxeles asociados con la contracción sistólica ventricular. El código se puede encontrar en https://github.com/dpoburko/zFish_HR.
- Mida las dimensiones pericárdicas utilizando una herramienta gratuita como ImageJ para dibujar libremente ROI alrededor del saco pericárdico y uno de los ojos. Abra la imagen en ImageJ y utilice la herramienta de selección de polígonos para dibujar un ROI primero alrededor del saco pericárdico, guardándolo en el gestor de ROI como en el paso 5.1.2, y repita para el ojo. Seleccione estos dos ROI en la gestión de ROIr y, a continuación, haga clic en medir. Registre el área para cada uno para luego calcular el área del saco pericárdico normalizada al área de los ojos en cada larva.
- Después de las mediciones de frecuencia cardíaca y pericárdicas, registre el ECG de larvas individuales.
NOTA: Los protocolos para registrar el ECG del pez cebra se han descrito previamente33,34,35,36.
6. Genotipado de larvas de pez cebra editadas con CRISPR-Cas9
- Después de los análisis fenotípicos, realice genotipado dentro y fuera del objetivo para confirmar la edición precisa y precisa del gen HDR.
- Anestesiar cada larva de 3 dpf en MS-222 al 0,3% y clip de cola para aislar el ADNg utilizando el método HOTShot37. Incubar cada pinza caudal extirpada en 15 μL de NaOH a 25 mM a 95 °C durante 20 min. Luego, neutralizar con 1,5 μL de Tris-HCl y centrifugar a 13.800 x g durante 30 s. Retenga el sobrenadante, que contiene ADNg extraído.
- Recuperar las larvas en medios E3 y devolverlas al sistema de alojamiento si se pretende un mayor desarrollo o estudio.
- Usando el ADNg extraído como plantilla, realice la secuenciación de Sanger basada en PCR de sitios en el objetivo y potencialmente fuera del objetivo.
NOTA: Opcional: un enfoque de PCR anidado puede ser beneficioso para algunas regiones genéticas. - Asegúrese de que el diseño del cebador en el objetivo capture el sitio de mutación y el sitio de unión de sgRNA más cercano. Diseñar un cebador de secuenciación separado para detectar la transición del brazo de homología insertado y el gen objetivo para confirmar la integración en el gen de interés. Diseñar cebadores para secuenciar los tres principales sitios potenciales fuera del objetivo identificados en el paso 1.2.3.
NOTA: Los programas de software de diseño de guías a menudo sugieren cartillas para usar, pero la personalización puede ser necesaria para lograr resultados óptimos. - Compile genotipado dentro y fuera del objetivo, frecuencia cardíaca, dimensiones pericárdicas, fenotipado de ECG y datos de genes reporteros identificables para cada pez cebra.
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Representative Results
El uso exitoso de este enfoque CRISPR de reemplazo de exón de dos sgRNA se destaca por la introducción y detección simple de una edición precisa para diseñar la variante asociada a LQTS, R56Q, en el gen zkcnh6a en pez cebra. La Figura 6 muestra una larva representativa de 3 dpf inyectadas en la etapa embrionaria de una célula con componentes CRISPR como se describió anteriormente. La Figura 6A muestra la presencia de la expresión génica reportera YFP mVenus en el cristalino del ojo como un reportero positivo de la integración exitosa de la plantilla. La Figura 6B,C muestra cromatogramas de secuenciación de Sanger obtenidos de ADN genómico aislado de muestras de clip de cola de peces de tipo salvaje y gen reportero positivo, respectivamente. Se encontró que los peces reporteros con genes positivos tenían la edición precisa, G a A, que introduce la variante R56Q en zkcnh6a. El genotipado mostró una correlación del 100% entre la expresión génica del reportero YFP y la presencia de la edición precisa del gen R56Q, validando esta herramienta de detección de fluorescencia.
El fenotipado de larvas de pez cebra editadas genéticamente se realizó a 3 dpf. La Figura 7 muestra resultados representativos de larvas silvestres y R56Q editadas genéticamente. La frecuencia cardíaca se detectó mediante captura de video como se describió anteriormente. Se muestra un ejemplo de la medición de las dimensiones pericárdicas como una relación del área de los ojos (Figura 7A). La Figura 7B muestra la frecuencia cardíaca contra dimensiones pericárdicas normalizadas, destacando una tendencia de bradicardia con aumento del edema pericárdico, que se asocia con trastornos de la repolarización cardíaca en el pez cebra 8,38,39,40. La Figura 7C muestra un ejemplo representativo de registros de ECG de larvas de 3 dpf. Los intervalos estándar (QT, QRS) se midieron a partir de señales de ECG promediadas.
Figura 1: Integración de la plantilla HDR en el genoma del pez cebra. Gris oscuro, brazos homólogos; verde, los objetivos de guía de sgRNA con mutación silenciosa para prevenir el recorte de Cas9; gris claro, exón objetivo de interés; línea roja, mutación puntual; amarillo, gen reportero de mVenus YFP bajo un promotor α-cristalino; Las líneas discontinuas indican homología. Aquí, la edición precisa objetivo fue R56Q en el exón 2 del gen zkcnh6a . Abreviaturas: HDR = reparación dirigida por homología; sgRNA = ARN de guía única; YFP = proteína fluorescente amarilla; DSB = rotura de doble cadena; WT = tipo salvaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resumen de los pasos para diseñar ediciones precisas en genes de pez cebra utilizando el enfoque CRISPR-Cas9 de dos sgRNA (los números de paso de protocolo relacionados se indican entre paréntesis). Abreviaturas: sgRNA = ARN de guía única; YFP = proteína fluorescente amarilla; ADNg = ADN genómico; ECG = electrocardiograma; DPF = días después de la fertilización; MS-222 = sulfonato de metano triquinaína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Preparación de fragmentos de plantilla exógenos y guías de sgRNA. (A) Digestión secuencial y ligadura de fragmentos de plantilla aguas arriba y aguas abajo de la secuencia del gen reportero YFP de mVenus en pKHR5. (B) Recocido de pares de sgRNA complementarios con saliente de restricción para ligadura en DR274. Abreviaturas: sgRNA = ARN de guía única; YFP = proteína fluorescente amarilla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Construcción de la plantilla HDR. Gris oscuro, brazos homólogos; verde, los objetivos de guía de sgRNA con mutación silenciosa para prevenir el recorte de Cas9; gris claro, exón objetivo de interés; línea roja, mutación puntual; amarillo, gen reportero de mVenus YFP bajo un promotor α-cristalino; Línea azul oscuro, sitios de restricción añadidos. Los dos fragmentos de plantilla están integrados en el donante plásmido pKHR5. Abreviaturas: HDR = reparación dirigida por homología; sgRNA = ARN de guía única. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Microinyección de embriones unicelulares de pez cebra con componentes CRISPR-Cas9. Barra de escala = 0,5 mm. Abreviaturas: HDR = reparación dirigida por homología; sgRNA = ARN de guía única. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: La fácil detección de la fluorescencia del gen reportero YFP mVenus indica una integración positiva de la plantilla exógena HDR en el gen objetivo. (A) Ejemplo de expresión de mVenus YFP en un ojo de pez cebra (flecha) en una larva de pez cebra editada. (B) Las ediciones exitosas se confirman mediante la secuenciación de cromatogramas (izquierda, WT; derecha, edición R56Q). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Análisis fenotípico de las consecuencias cardíacas en pez cebra de 3 dpf siguiendo la edición precisa de R56Q en el gen diana zkcnh6a. (A) Detección de imágenes de dimensiones pericárdicas relativas al tamaño del ojo utilizando la herramienta polígono en ImageJ. Los límites del saco pericárdico fueron marcados por el usuario a partir de un único marco de grabación basado en los cambios en la translucidez y la pigmentación. Se muestran ejemplos de dimensiones pericárdicas normales y derrame pericárdico. Barra de escala = 0,5 mm. (B) Correlación entre las dimensiones pericárdicas (relativas a la dimensión ocular) y la frecuencia cardíaca, R2 = 0,33. (C) Ejemplo de registro de ECG de un corazón de larva de pez cebra de 3 dpf (izquierda) y complejos promediados (derecha). Frecuencia cardíaca, 131 lpm; intervalo QTc corregido por frecuencia cardíaca, 460 ms. Abreviaturas: dpf = días después de la fertilización; ECG = electrocardiograma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La ingeniería de ediciones genéticas precisas utilizando CRISPR-Cas9 se ve desafiada por la baja eficiencia de los mecanismos HDR y su detección eficiente. Aquí, se describe un enfoque de reemplazo de exones de dos sgRNA basado en CRISPR-Cas9 que produce ediciones precisas en peces cebra con detección visual directa de ediciones positivas. La eficacia de este enfoque se demuestra mediante la generación de ediciones precisas en el gen zkcnh6a . Este documento muestra cómo la función cardíaca en larvas de pez cebra editadas genéticamente puede evaluarse utilizando medidas fenotípicas no invasivas de frecuencia cardíaca, dimensiones pericárdicas y morfología del ECG. Este enfoque, desde la introducción de una edición genética hasta la evaluación fenotípica, se puede completar de principio a fin en aproximadamente 1 semana.
Los beneficios del enfoque de edición y fenotipado anterior son la facilidad del diseño de modificación de CRISPR, la amplia aplicabilidad en múltiples sistemas fisiológicos, la capacidad de insertar genes grandes o fragmentos de genes y la capacidad de rastrear efectos variantes longitudinalmente a través del desarrollo y las generaciones. El éxito de las ediciones precisas en este enfoque puede estar relacionado con la combinación del gran tamaño de la plantilla (debido al inserto del gen reportero y los brazos de homología largos), que se ha demostrado que aumenta la eficiencia de las ediciones en el pez cebra14, y la estrategia de dos guías de ARNg, que se ha utilizado eficazmente en las ediciones inducidas por TALEN del pez cebra8.
Una fortaleza particular del enfoque descrito es la capacidad de insertar genes grandes o fragmentos de genes. Esto puede ser útil, por ejemplo, para insertar ortólogos humanos41, lo que permite una caracterización y comparación más traducibles clínicamente entre ortólogos. Alternativamente, también se podrían insertar genes que codifican enzimas Cas, lo que permite una línea de pez cebra con mecanismos de edición CRISPR in vivo , proporcionando un sistema inducible. Del mismo modo, los mecanismos alternativos de CRISPR, como la edición principal, podrían integrarse y dar como resultado una línea de peces cebra que se editan fácilmente de manera precisa y eficiente.
A pesar de las ventajas de este enfoque, existen algunas limitaciones. En primer lugar, solo se han modificado un gen y un locus, y se necesitan más pruebas en otros sitios o en otros genes para evaluar cuán ampliamente aplicable es este enfoque. Debido a los largos brazos de homología requeridos, los costos de diseño de la plantilla son más altos; sin embargo, esto puede compensarse con una detección eficiente. Otra limitación es que el enfoque de detección requiere capacidad de detección de fluorescencia. Sin embargo, los requisitos ópticos son relativamente bajos y pueden construirse a medida o comprarse comercialmente a un costo razonablemente bajo. El uso de un enfoque de dos sgRNA aumenta el número de posibles eventos fuera del objetivo; sin embargo, esto es probablemente mitigado por la menor probabilidad de que las dos guías de sgRNA se recojan de una manera que facilite la incorporación de la plantilla para producir la expresión génica del reportero. Finalmente, el uso del ARNm Cas9 puede conducir a mosaicismos ya que el Cas9 no está activo hasta etapas posteriores del desarrollo. Esto podría explicarse mediante la secuenciación de tipos de tejidos particulares; Sin embargo, dado el tamaño de las larvas de pez cebra, esto es técnicamente desafiante.
En resumen, este enfoque de edición precisa de dos sgRNA CRISPR-Cas9 en pez cebra permite la detección visual simple de ediciones positivas y puede adaptarse para incorporar grandes genes de interés en cualquier locus. Combinado con medidas fenotípicas, esto permite una plataforma confiable y de alto rendimiento para estudiar variantes cardíacas clínicamente relevantes.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por una subvención del Proyecto de Investigación de los Institutos Canadienses de Salud (T.W.C.) y las subvenciones de Descubrimiento del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (T.W.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Program | |||
| CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
| ENSEMBL | European Bioinformatics Institute | ||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
| NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
| EQUIPMENT | |||
| 24-well Plate | VWR | ||
| 25 mm Petri Dish | VWR | ||
| Blackfly USB3 Camera | Teledyne FLIR | ||
| C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
| EZNA Gel Extraction Kit | Omega Biotek | ||
| MAXIscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | ||
| MaxQ 5000 Incubator | Barnstead Lab Line | ||
| Miniprep Kit | Qiagen | ||
| mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit | Invitrogen | ||
| ND1000 Spectrophotometer | Nanodrop | ||
| PCR Purification Kit | Qiagen | ||
| PLI 100A Picoinjector | Harvard Apparatus | ||
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | ||
| Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
| Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| ZebTec Zebrafish Housing System | Tecniplast | ||
| SERVICES | |||
| Gene Synthesis | Genewiz | ||
| Sanger Sequencing | Genewiz | ||
| REAGENTS | |||
| 10β Competent Cells | NEB | ||
| 10X PCR Buffer | Qiagen | ||
| 100 mM Nucleotide Mixture | ABM | ||
| Ampicillin | Sigma | ||
| BamHI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| BsaI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| EcoRI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Glycerol | |||
| HEPES | Sigma | ||
| HindIII Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Kanamycin | Sigma | ||
| Methylene Blue | Sigma | ||
| MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| MS-222 (Tricaine) | Sigma | ||
| pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab) | Addgene | ||
| PmeI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| SalI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma | ||
| T4 Ligase w/ buffer | Sigma | ||
| Taq Polymerase | Qiagen | ||
| TE Buffer | Sigma | ||
| Tris Hydrochloride | Sigma | ||
| XhoI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| RECIPES | |||
| Solution | Component | Supplier | |
| Annealing Buffer (pH 7.5-8.0) | 10 mM Tris | Sigma | |
| 50 mM NaCl | Sigma | ||
| 1 mM EDTA | Sigma | ||
| E3 Media (pH 7.2) | 5 mM NaCl | Sigma | |
| 0.17 mM KCl | Sigma | ||
| 0.33 mM CaCl2 | Sigma | ||
| 0.33 mM MgSO4 | Sigma | ||
| Injection Buffer (pH 7.5) | 20 mM HEPES | Sigma | |
| 150 mM KCl | Sigma |
References
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