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Neuroscience

न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों को कम करने के लिए प्रारंभिक प्रसवोत्तर माउस हिप्पोकैम्पस में मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न जीबीएर्जिक न्यूरॉन्स का प्रत्यारोपण

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/64272
Automatic Translation
2, 1, 1, 3, 2, 1
1Cellular Neurophysiology and Epilepsy Group, Epilepsy Centre, Department of Clinical Sciences, Lund University Hospital, 2Experimental Epilepsy Group, Epilepsy Centre, Department of Clinical Sciences, Lund University Hospital, 3Molecular Neurophysiology and Epilepsy Group, Epilepsy Center, Department of Clinical Sciences, Lund University Hospital

Summary

न्यूरोनल प्रोग्रामिंग द्वारा उत्पन्न मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न जीबीएर्जिक न्यूरॉन्स का प्रत्यारोपण न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों के लिए एक संभावित उपचार दृष्टिकोण हो सकता है। यह प्रोटोकॉल नवजात चूहों के दिमाग में मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न जीबीएर्जिक न्यूरोनल अग्रदूतों की पीढ़ी और प्रत्यारोपण का वर्णन करता है, जिससे ग्राफ्टेड न्यूरॉन्स की दीर्घकालिक जांच और उनकी चिकित्सीय क्षमता का मूल्यांकन होता है।

Abstract

निरोधात्मक इंटरन्यूरॉन की कम संख्या या शिथिलता न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों के लिए एक आम योगदानकर्ता है। इसलिए, परिवर्तित न्यूरोनल सर्किट के प्रभावों को बदलने या कम करने के लिए इंटरन्यूरॉन का उपयोग करके सेल थेरेपी एक आकर्षक चिकित्सीय एवेन्यू है। इस अंत तक, इस बारे में अधिक ज्ञान की आवश्यकता है कि मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न जीबीएर्जिक इंटरन्यूरॉन जैसी कोशिकाएं (एचडीआईएन) मेजबान सर्किटरी में समय के साथ कैसे परिपक्व, एकीकृत और कार्य करती हैं। न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों में विशेष महत्व इस बात की बेहतर समझ है कि प्रत्यारोपित कोशिकाओं में ये प्रक्रियाएं एक विकसित और परिपक्व मेजबान मस्तिष्क से प्रभावित होती हैं या नहीं। वर्तमान प्रोटोकॉल प्रतिलेखन कारकों Ascl1 और Dlx2 की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति के आधार पर मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से HDINs की एक तेज और अत्यधिक कुशल पीढ़ी का वर्णन करता है। इन न्यूरोनल अग्रदूतों को एकतरफा रूप से प्रत्यारोपित किया जाता है, विट्रो में 7 दिनों के बाद, नवजात 2-दिन के चूहों के हिप्पोकैम्पस में। प्रत्यारोपित न्यूरॉन्स कॉर्टिकल डिस्प्लेसिया-फोकल एपिलेप्सी सिंड्रोम के माउस मॉडल के इप्सी- और विपरीत हिप्पोकैम्पस में फैलते हैं और प्रत्यारोपण के बाद 9 महीने तक जीवित रहते हैं। यह दृष्टिकोण स्वस्थ और रोगग्रस्त दिमाग विकसित करने में विस्तारित समय में प्रत्यारोपित इंटरन्यूरॉन की सेलुलर पहचान, एकीकरण, कार्यक्षमता और चिकित्सीय क्षमता की जांच करने की अनुमति देता है।

Introduction

न्यूरोनल नेटवर्क की स्थापना, परिपक्वता और शोधन प्रसवकालीन और प्रारंभिक प्रसवोत्तर अवधि के दौरान होता है औरमस्तिष्क के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण समय विंडो को फिर से परिभाषित करता है। जन्म के बाद कनेक्टिविटी के उत्साह से, मस्तिष्क उन कनेक्शनों की एक अच्छी ट्यूनिंग के लिए विकसित होता है जो किशोरावस्था2 तक विस्तारित होते हैं। नतीजतन, इन अवधियों के दौरान व्यक्त जीन में परिवर्तन, साथ ही बाहरी कारक या अपमान, कई न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों के लिए एक व्यक्ति की प्रवृत्ति को परिभाषित करते हैं। अनुभूति और मोटर फ़ंक्शन में हानि समय के साथ सामने आती है, और औषधीय उपचार सीमित होते हैं, अधिकांश गंभीर दुष्प्रभावों के जोखिम के साथ लक्षणों को लक्षित करते हैं।

गामा-एमिनोब्यूट्रिक एसिड (जीएबीए) र्जिक निषेध में शिथिलता को विभिन्न न्यूरोडेवलपमेंटलविकारों 3, जैसे नाजुक एक्स सिंड्रोम, एंजेलमैन सिंड्रोम, मिर्गी, सिज़ोफ्रेनिया और ऑटिज़्म के अंतर्निहित कारण के लिए एक प्रमुख योगदानकर्ता दिखाया गया है। जीएबीए केंद्रीय तंत्रिका तंत्र का प्रमुख निरोधात्मक ट्रांसमीटर है और उत्तेजक / निरोधात्मक (ई / आई) संतुलन, न्यूरोनल फायरिंग के सिंक्रनाइज़ेशन और गणना को बनाए रखने के लिए सहायक है। जीबीएर्जिक इंटरन्यूरॉन न्यूरॉन्स की एक विषम आबादी है, जिसमें अधिक जटिल मस्तिष्क क्षेत्रों में कार्यात्मक जटिलता बढ़ रही है4 और विकास 5,6 के साथ। मानव मस्तिष्क की सीमित अंतर्जात पुनर्योजी क्षमता और कई न्यूरोलॉजिकल विकारों में इंटरन्यूरॉन डिसफंक्शन के निहितार्थ को ध्यान में रखते हुए, जीबीएर्जिक इंटरन्यूरॉन का प्रत्यारोपण पता लगाने के लिए एक आशाजनक चिकित्सीय एवेन्यू हो सकता है। इस लाइन के साथ, मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न जीबीएर्जिक इंटरन्यूरॉन जैसी कोशिकाएं (एचडीआईएन) कृंतक एलोजेनिक न्यूरोनल अग्रदूतों या अन्य स्रोतों की तुलना में इस उद्देश्य के लिए सबसे अधिक ट्रांसलेशनल और व्यवहार्य स्रोत प्रतीत होतीहैं। विभिन्न सेल स्रोतों से जीएबीएर्जिक न्यूरॉन्स उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल 8,9,10,11,12,13 उपलब्ध हैं, लेकिन एक विकासशील पैथोलॉजिकल मस्तिष्क में समय के साथ एचडीआईएन कैसे परिपक्व, एकीकृत और कार्य करते हैं, इस पर अधिक ज्ञान की आवश्यकता है। कई अध्ययनों ने कॉर्टिकल पैटर्निंग के दौरान सक्रिय जीन में परिवर्तन की पहचान की है, न्यूरोनल कनेक्टिविटी14 स्थापित की है, और शारीरिक ई / आई संतुलन15 को ट्यून किया है। संबंधित आनुवंशिक गड़बड़ी के साथ माउस मॉडल में एचडीआईएन का नवजात प्रत्यारोपण हमें मेजबान और ग्राफ्ट के बीच परस्पर क्रिया का पालन करने की अनुमति देता है, जो संभावित चिकित्सीय रणनीतियों को निर्धारित करने के लिए आवश्यक ज्ञान है।

इम्यूनोमॉड्यूलेशन का उपयोग आमतौर पर और सफलतापूर्वक जेनोग्राफ्ट प्रत्यारोपण में किया जाता है ताकि मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और अस्वीकृति 16 को ट्रिगर करने से बचाजा सके। हालांकि, इम्यूनोस्प्रेसिव दवाओं का प्रशासन, जैसे कि साइक्लोस्पोरिन ए, क्रोनिक प्रशासन के बाद गुर्दे की विषाक्तता का कारण बनता है, स्थिर प्रणालीगत सांद्रता प्राप्त करने के लिए दैनिक इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन की आवश्यकता के कारण श्रम-गहन है, जिससे पशु तनाव17 होता है, और ऑफ-टारगेट प्रभाव होते हैं जो पैथोलॉजी18 के साथ बातचीत कर सकते हैं। इसके अलावा, प्रतिरक्षा प्रणाली से समझौता व्यवहार फेनोटाइप19 को बदलने के लिए दिखाया गया है, संबंधित न्यूरोएनाटोमिकल क्षेत्रोंमें परिवर्तन के साथ 20. जीवन के पहले सप्ताह में प्रत्यारोपण को प्रत्यारोपित कोशिकाओं21,22 के अनुकूलन की अनुमति देने के लिए दिखाया गया है, जबकि अन्य ने प्रारंभिक जीवित रहने की सूचना दी है, जिसके बाद पहले प्रसवोत्तर महीने23,24 के भीतर ग्राफ्ट को अस्वीकार कर दिया गया है।

यह प्रोटोकॉल नवजात चूहों में एचडीआईएन पीढ़ी से सेल प्रत्यारोपण तक की प्रक्रियाओं का वर्णन करता है जिसके परिणामस्वरूप दीर्घकालिक ग्राफ्ट अस्तित्व होता है और शारीरिक और रोग संबंधी विकास के दौरान प्रत्यारोपित मानव इंटरन्यूरॉन की न्यूरोनल विशिष्टता, सिनैप्टिक एकीकरण, कार्य और चिकित्सीय क्षमता की जांच की अनुमति मिलती है।

Protocol

लुंड पशु अनुसंधान नैतिकता बोर्ड, नैतिक परमिट संख्या 12548-19 द्वारा सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को अनुमोदित किया गया था, और पशु प्रयोगों के लिए स्वीडिश पशु कल्याण एजेंसी के नियमों और यूरोपीय संघ के निर्देश 2010/63 / यूरोपीय संघ के साथ समझौते में आयोजित किया गया था। वर्तमान अध्ययन के लिए प्रसवोत्तर दिन (पी) 2 पर सी 57बीएल 6 / जे और कॉन्टैक्टिन से जुड़े प्रोटीन जैसे 2 (सीएनटीएनएपी 2) नॉक-आउट (केओ) चूहों, दोनों पुरुषों और महिलाओं का उपयोग किया गया था। मानव भ्रूण स्टेम सेल (एचईएससी) का उपयोग किया गया था। जानवरों और स्टेम कोशिकाओं को वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया गया था (सामग्री की तालिका देखें)।

1. एचडीआईएन अग्रदूतों की पीढ़ी

नोट: इस खंड के सभी चरण एक सेल संस्कृति हुड में किए जाते हैं। एचईएससी को स्टेम सेल कल्चर माध्यम का उपयोग करके लेपित प्लेटों पर फीडर-मुक्त कोशिकाओं के रूप में बनाए रखा गया था और उपनिवेशों के रूप में पारित किया गया था।

  1. एचईएससी से एचडीआईएन अग्रदूतों की आगे की प्रोग्रामिंग करें (चित्रा 1)।
    नोट: फॉरवर्ड प्रोग्रामिंग दृष्टिकोण गोंजालेज-रामोस एट अल.8 और यांग एट अल.9 में वर्णित प्रक्रिया पर आधारित है।
    1. टेट-ऑन प्रणाली वाले लेंटिवायरल वैक्टर के साथ एचईएससी को एक ताजा स्टेम सेल कल्चर माध्यम में ट्रांसड्यूस करें जिसमें रॉक इनहिबिटर (आरआई) का 10 एसएम होता है ( सामग्री की तालिका देखें)। इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    2. ट्रांसडक्शन के 16 घंटे बाद माध्यम को एक ताजा स्टेम सेल कल्चर माध्यम में बदलें और ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं को उसी तरह बनाए रखें जैसे गैर-ट्रांसड्यूस्ड एचईएससी।
    3. जब यह संयोजित होता है, तो सेल डिटेचमेंट समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके एचईएससी को एकल कोशिकाओं के रूप में अलग करें और उन्हें 3 x 105 कोशिकाओं / अच्छी तरह से स्टेम सेल कल्चर माध्यम में लेपित 6-वेल प्लेटों में प्लेट करें, जिसमें दिन इन विट्रो (डीआईवी) -1 पर आरआई का 10 μ एम होता है।
    4. 1 DIV पर, संवर्धन माध्यम को N2 माध्यम से प्रतिस्थापित करें जिसमें 2 g/L डॉक्सीसाइक्लिन (DOX, सामग्री की तालिका देखें) हो।
      नोट: DOX का उपयोग Ascl1 और Dlx29 की ट्रांसजीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए किया जाता है, 1 DIV से 7 DIV तक, और फिर पीने के पानी25 के अतिरिक्त विवो में जारी रहता है।
    5. 2 DIV पर, एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध चयन अवधि शुरू होती है जो 5 DIV तक चलेगी। ताजा माध्यम में प्यूरोमाइसिन (प्यूरो) और हाइग्रोमाइसिन (हाइग्रो) जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। 2 DIV, 4 DIV, और 5 DIV पर माध्यम बदलें।
      नोट: केवल एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट ले जाने वाली कोशिकाओं के अस्तित्व को सुनिश्चित करने के लिए ट्रांसड्यूस्ड और नॉन-ट्रांसड्यूस्ड एचईएससी का उपयोग करके भेदभाव प्रोटोकॉल से पहले प्यूरो और हाइग्रो की सांद्रता को अनुकूलित करें। इस प्रोटोकॉल में, 0.5 μg /mL puro और 750 μg / mL hygro का उपयोग किया गया था।
    6. 5 DIV पर, एंटीबायोटिक चयन अवधि समाप्त होती है। एन 2 माध्यम में परिवर्तन 2 ग्राम / एल डीओएक्स और 4 μM साइटोसिन β-डी-अरबिनोफ्यूरानोसाइड (आरा-सी, सामग्री की तालिका देखें) के साथ पूरक है।

Figure 1
चित्रा 1: एएससीएल 1 और डीएलएक्स 2 को अतिरंजित करके एचईएससी से एचडीआईएन अग्रदूतों की पीढ़ी। (ए) एचडीआईएन अग्रदूतों की पीढ़ी के लिए उपयोग किए जाने वाले भेदभाव प्रोटोकॉल की योजनाबद्धता। (B-E) (बी) न्यूरोनल मार्कर एमएपी 2, (सी) प्रोलिफेरेटिव मार्कर केआई 67, (डी) सामान्य परमाणु धुंधलापन, और (ई) पिछले मार्करों का एक विलय के लिए 7 डीआईवी पर एचडीआईएन अग्रदूतों का इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री। स्केल पट्टी: 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

2. प्रत्यारोपण के लिए एकल-कोशिका निलंबन की तैयारी

नोट: इस खंड में सभी चरण सेल संस्कृति हुड में किए जाते हैं। 7 DIV पर, HDIN अग्रदूतों को अलग किया जाता है और प्रत्यारोपण के लिए उपयोग किया जाता है।

  1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए कोशिकाओं की टुकड़ी करें।
    1. माध्यम को हटा दें और कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना डीपीबीएस के साथ कोशिकाओं को सावधानीपूर्वक कुल्ला करें।
    2. 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल डिटेचमेंट समाधान (सामग्री की तालिका देखें) का 400 μL जोड़ें।
      नोट: समाधान द्वारा पूरी सतह का कवरेज सुनिश्चित करें।
    3. इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें जब तक कि कोशिकाओं की सीमा चमकदार दिखने न लगे, जो सेल सतह प्रोटीन के एंजाइमैटिक क्षरण और कुएं की सतह से अलगाव का संकेत देता है।
      नोट: सेल अस्तित्व को बढ़ाने के लिए, बहुत लंबे समय तक इंतजार न करें जब सभी कोशिकाएं पूरी तरह से अलग हो जाती हैं और चारों ओर तैर रही होती हैं।
    4. फिर, एंजाइम को रोकने के लिए 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में ताजा एन 2 माध्यम के 600 μL जोड़ें, और यांत्रिक रूप से पिपेट के साथ, एकल-सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं को अलग करने में मदद करें।
    5. सेल निलंबन को एक प्लास्टिक ट्यूब (15 एमएल) में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 4 मिनट के लिए 180 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  2. कोशिकाओं का पुन: निलंबन करें।
    1. वैक्यूम सिस्टम (सावधानीपूर्वक, गोली को परेशान किए बिना) का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें और प्रत्यारोपण माध्यम में गोली को फिर से निलंबित करें जिसमें 10 μM RI, 1 μg / mL DNase, और 2 μg / μL DOX हो।
    2. एक गिनती कक्ष और एक मैनुअल सेल काउंटर का उपयोग करके निलंबन में कुल कोशिकाओं की गणना करें और मात्रा को 100,000 कोशिकाओं / μL की अंतिम एकाग्रता में समायोजित करें।
    3. सेल निलंबन को बर्फ पर एक बंद ट्यूब में अधिकतम 4 घंटे के लिए प्रत्यारोपण तक रखें।
      नोट: प्रत्यारोपण उसी दिन किया जाना चाहिए जिस दिन सेल निलंबन (7 DIV) की तैयारी होती है।

3. इंट्राहिप्पोकैम्पल सेल प्रत्यारोपण

नोट: इस खंड के सभी चरण पशु सुविधा में सेल कल्चर हुड के बाहर किए जाते हैं। मस्तिष्क में कोशिकाओं का प्रारंभिक प्रसवोत्तर प्रत्यारोपण पी 2 पर किया गया था, पी 0 को जन्म के दिन पर विचार किया गया था।

  1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए प्रत्यारोपण प्रयोग के लिए तैयार करें।
    1. सभी सर्जिकल सामग्री को ऑटोक्लेव करें या, यदि संभव न हो, तो किसी अन्य अनुमोदित विधि के साथ निष्फल करें।
    2. बिना किसी ग्लास केशिका के धारक में इंजेक्शन सिरिंज माउंट करें। सुई को पानी से धो लें।
      नोट: सुई 33 G होना चाहिए।
    3. वक्र 90 ° एक 30 ग्राम इंसुलिन सुई की नोक।
    4. सिर सपाट के साथ पिल्ला को स्थिति देने के लिए एक होममेड प्ले-डोह जैसा मंच बनाएं (चित्रा 2 ए)।
    5. सर्जरी के लिए कुछ भी तैयार करने से पहले चूहों को मां और पिल्ले के साथ पिंजरे में लाएं ताकि वे नए वातावरण में अनुकूल हो सकें।
    6. गीली बर्फ के साथ एक ट्रे और आइसोफ्लुरेन के लिए कुछ कागज के साथ एक खाली पिंजरा तैयार करें।
  2. माउस पिल्ला को एनेस्थेटाइज करें।
    1. आइसोफ्लुरेन के साथ कागज के एक टुकड़े को भिगोएं ( सामग्री की तालिका देखें) और इसे खाली पिंजरे के अंदर रखें। सावधानी से एक पिल्ला लें और इसे आइसोफ्लुरेन में भिगोए गए कागज के साथ पिंजरे में रखें।
      नोट: मां के साथ कभी भी तीन से कम पिल्ले न छोड़ें। आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया के 20-30 सेकंड से अधिक न करें, या पिल्ला मर सकता है।
    2. आंदोलन समाप्ति द्वारा संज्ञाहरण के प्रभाव को सत्यापित करें।
    3. संज्ञाहरण के तुरंत बाद, पिल्ले को गीली बर्फ की सतह पर एक गीले ऊतक पर रखें। जानवर को 3 मिनट के लिए बर्फ पर रखें जब तक कि ऊपरी अंग सफेद न हो जाएं (चित्रा 2 बी, नीला तीर)। इसमें आमतौर पर 2-3 मिनट लगते हैं।
    4. सेल निलंबन के साथ सिरिंज लोड करने के लिए इस समय का उपयोग करें। कोशिकाओं को पहले पिपेट के साथ सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें।
    5. प्यूप को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर रखें। विपरीत दिशा में कान की सलाखों का उपयोग करें (चित्रा 2 ए, मैजेंटा तीर)।
      नोट: कान की सलाखों का पिछला हिस्सा कम बिंदुदार है, और चूंकि पी 2 पिल्ले के कान नहीं होते हैं, इसलिए जानवर को चोट पहुंचाने से बचने के लिए चापलूसी पक्ष का उपयोग करें।
    6. साइड से, जांचें कि सिर सीधा है या नहीं। सिर सपाट होना चाहिए; इसके लिए समायोजित करने के लिए प्ले-डोह जैसे मंच का उपयोग करें।
      नोट: इस उम्र में पिल्ले ने अभी तक अपनी आँखें नहीं खोली हैं, इसलिए इस संबंध में कोई अतिरिक्त कदम उठाने की आवश्यकता नहीं है। पिल्ले को इस उम्र में फर नहीं होता है, इसलिए क्षेत्र के शेविंग की आवश्यकता नहीं होती है। कोई विशिष्ट दर्द उपचार नहीं दिया जाता है क्योंकि यह त्वचा के लिए एक खुला चीरा नहीं है, और इसमें कोई व्याख्यान शामिल नहीं है।
    7. पिल्ला को सर्जरी की पूरी अवधि के लिए बर्फ (टिशू पेपर के शीर्ष पर) पर कवर रखें।
      नोट: बर्फ को पिल्ला की त्वचा के सीधे संपर्क में न रखें।
  3. इंजेक्शन का प्रदर्शन करें।
    1. इथेनॉल में भिगोए गए नरम ऊतक का उपयोग करके त्वचा की सतह को साफ करें।
    2. लैम्ब्डा की पहचान करें और निर्देशांक को स्टीरियोटैक्सिक उपकरण (चित्रा 2 सी, पीले डैश्ड लाइन) के डिजिटल डिस्प्ले कंसोल पर शून्य पर सेट करें। धनु और लैम्बडॉइड सीवन आंखों द्वारा आसानी से दिखाई देते हैं, क्योंकि वे लाल रेखाओं के रूप में संवहनी होते हैं।
      नोट: यदि लैम्ब्डा की कल्पना करने में कठिनाइयों का सामना करना पड़ रहा है, तो त्वचा पर बर्फ का एक छोटा टुकड़ा रखें और इसे ठंडा होने के लिए कुछ मिनट प्रतीक्षा करें। फिर, बर्फ के टुकड़े को हटा दें, और त्वचा की सूक्ष्म सफेदी आपको कल्पना करने की अनुमति देगी।
    3. इंजेक्शन सुई को वांछित निर्देशांक में स्थानांतरित करें। वर्णित प्रोटोकॉल में, लक्षित क्षेत्र हिप्पोकैम्पस था, और निर्देशांक निम्नानुसार थे: पूर्ववर्ती-पश्चवर्ती (एपी) +0.85 और मेडियो-लेटरल (एमएल) +1.35।
    4. खोपड़ी में प्रवेश करने और एक छोटा छेद बनाने के लिए 90 ° मुड़ी हुई इंसुलिन सुई का उपयोग करें।
    5. इंजेक्शन सुई को तब तक नीचे लाएं जब तक कि यह खोपड़ी को पार न कर ले, और डोर्सो-वेंट्रल (डीवी) निर्देशांक को शून्य करें। वांछित डीवी निर्देशांक तक सुई को कम करें। वर्णित प्रोटोकॉल में, निर्देशांक DV -1.1 थे।
    6. पूर्व निर्धारित समय अंतराल के अनुसार इंजेक्शन लगाएं।
      नोट: वर्णित प्रोटोकॉल में, सटीक समय निम्नलिखित थे: (i) डीवी निर्देशांक पर जाने के बाद, 3 मिनट प्रतीक्षा करें, (ii) 5 मिनट के लिए 1 μL मात्रा इंजेक्ट करें, और (iii) सभी मात्रा को इंजेक्ट करने के बाद, 3 मिनट प्रतीक्षा करें।
    7. सुई को धीरे-धीरे मोड़ें।
  4. प्रक्रिया समाप्त करें।
    नोट: पिल्ले के अस्तित्व को सुनिश्चित करने और हाइपोथर्मिया द्वारा संज्ञाहरण से प्राप्त किसी भी क्षति से बचने के लिए सर्जरी 15 मिनट से अधिक नहीं चल सकती है।
    1. पुप को हाथों से तब तक गर्म करें जब तक कि यह मां को वापस देने से पहले हिलना शुरू न कर दे।
    2. विवो में सेल भेदभाव को जारी रखने के लिए प्रत्यारोपण से कम से कम 2 दिनों पहले और 3 सप्ताह बाद (पीटी) के लिए पीने के पानी के रूप में 0.5% सुक्रोज घोल में 1 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर डीओएक्स दें।

Figure 2
चित्र 2: पी 2 पर नवजात चूहों के पिल्लों में स्टीरियोटैक्सिक प्रत्यारोपण। (ए) पिल्ले के शरीर को स्थिति में रखने और उल्टे कान सलाखों (मैजेंटा तीर) के लिए एक प्ले-डोह जैसा मंच। (बी) सफेद सामने का पंजा (नीला तीर) उस क्षेत्र में कम रक्त प्रवाह का संकेत देता है ताकि पिल्ला हाइपोथर्मिया द्वारा संज्ञाहरण का अनुभव कर रहा हो। (सी) नरम टिशू पेपर पर पहले से ही बर्फ से ढके पिल्ले के साथ सेटअप का अवलोकन। (c#) पिल्ले के सिर का बंद-ज़ूम, जिसमें इंजेक्शन सुई पहले से ही मस्तिष्क में डाली गई थी (लैम्ब्डा और लैम्ब्डोइड सीवन का संकेत देने वाली पीली डैश्ड लाइन)। यह आंकड़ा गोंजालेज रामोस एट अल से अनुकूलित है। 27. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Representative Results

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के बाद और चित्रा 1 ए में चित्रित, एचडीआईएन अग्रदूत अभी तक 7 DIV पर प्रोलिफेरेटिव नहीं थे जैसा कि (i) सेल चक्र मार्कर Ki67 के लिए नकारात्मक विकृति और (ii) न्यूरोनल मार्करों जैसे सूक्ष्मनलिका-संबद्ध प्रोटीन 2 (एमएपी 2) (चित्रा 1 बी-ई) द्वारा परिभाषित किया गया है। यह लक्षण वर्णन सभी प्रक्रिया चरणों से गुजरने के बाद 24 घंटे के लिए बचे हुए कोशिकाओं पर किया गया था। इसके अलावा, पहले प्रकाशित जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण ने संकेत दिया कि प्लुरिपोटेंट अवस्था से न्यूरोनल फेनोटाइप में तेजी से संक्रमण 4 DIV और 7 DIV8 के आसपास होता है। कुल मिलाकर, इन परिणामों ने पोस्टमाइटोटिक कोशिकाओं की उपस्थिति और टेराटोमा गठन के लिए जोखिम की अनुपस्थिति की पुष्टि की।

इसके बाद, जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) चूहों के हिप्पोकैम्पस में प्रारंभिक प्रसवोत्तर प्रत्यारोपण के बाद एचडीआईएन अग्रदूतों के अस्तित्व का परीक्षण मानव साइटोप्लाज्मिक मार्कर एसटीईएम 121 के खिलाफ इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा किया गया था। एचडीआईएन अग्रदूतों को पी 2 पर भोले इम्यूनोसक्षम चूहों के दाहिने पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस में प्रत्यारोपित किया गया था, जिसे बाद में पी 14 और 2 महीने पीटी में बलिदान किया गया था। इसके अलावा, दोनों समय बिंदुओं पर, ग्राफ्टेड एचडीआईएन ने प्रेरण प्रतिलेखन कारकों (पूरक चित्रा 1) में से एक एएससीएल 1 को व्यक्त किया, और प्रोलिफेरेटिव नहीं थे, जैसा कि केआई 67 अभिव्यक्ति (पूरक चित्रा 2) की अनुपस्थिति से संकेत मिलता है।

महत्वपूर्ण रूप से, प्रत्यारोपित कोशिकाओं के खिलाफ कोई प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया या स्थानीय सूजन या तो पी 14 या 2 महीने के पीटी में नहीं पाई गई थी, जैसा कि आईबीए 1, सीडी 68 और गैलेक्टिन -3 (गैल 3) (चित्रा 3) का उपयोग करके पहचाने गए प्रतिक्रियाशील माइक्रोग्लिया की अनुपस्थिति से मूल्यांकन किया गया था, ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) और इंटरल्यूकिन -1 (आईएल -1) जैसे भड़काऊ साइटोकिन्स द्वारा निर्धारित एस्ट्रोग्लियोसिस की सीमा, और साइटोटॉक्सिक टी लिम्फोसाइटों (सीडी 8) की अनुपस्थिति (चित्रा 4)।

Figure 3
चित्रा 3: पी 14 पर एचडीआईएन और मेजबान ऊतक से प्रतिरक्षा अस्वीकृति को ट्रिगर किए बिना नवजात डब्ल्यूटी चूहों के हिप्पोकैम्पस में 2 महीने पीटी। मस्तिष्क के ऊतकों में आईबीए 1, सीडी 68, और गैल 3 मार्करों के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस (ए-डी) इलेक्ट्रोकोग्यूलेशन स्ट्रोक माउस मॉडल (सकारात्मक नियंत्रण, सीटीआरएल +), (ई-एच) नकारात्मक नियंत्रण जानवरों (सीटीआरएल-) में 2 महीने में और (एम-पी) पी 14, और (आई-एल) जानवर जो 2 महीने में सेल प्रत्यारोपण से गुजरे हैं और (क्यू-टी) ) पी 14। सफेद तीर ऑटोफ्लोरेसेंस के कारण सभी चैनलों पर दिखाई देने वाली रक्त वाहिकाओं के कुछ उदाहरणों को इंगित करते हैं। संक्षेप: सीटीएक्स = कॉर्टेक्स; हिप = हिप्पोकैम्पस; डीजी = डेंटेट गाइरस; सीए 1 = कॉर्नू एम्मोनिस 1. स्केल पट्टी: 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: मेजबान ऊतक से प्रतिरक्षा अस्वीकृति को ट्रिगर किए बिना नवजात डब्ल्यूटी चूहों के हिप्पोकैम्पस में 2 महीने के पीटी पर एचडीआईएन। (ए-डी) से मस्तिष्क के ऊतकों में आईएल 1, जीएफएपी और सीडी 8 मार्करों के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस एक इलेक्ट्रोकोग्यूलेशन स्ट्रोक माउस मॉडल (सकारात्मक नियंत्रण, सीटीआरएल +), (ई-एच) नकारात्मक नियंत्रण जानवरों (सीटीआरएल-) में 2 महीने में एक इस्केमिक कोर क्षेत्र की निकटता, और (आई-एल) जानवर जो 2 महीने में सेल प्रत्यारोपण से गुजर चुके हैं। संक्षेप: सीटीएक्स = कॉर्टेक्स; हिप = हिप्पोकैम्पस; डीजी = डेंटेट गाइरस। स्केल पट्टी: 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

इसी तरह, एचडीआईएन अग्रदूतों को सीएनटीएनएपी 2 केओ चूहों के हिप्पोकैम्पस में भी प्रत्यारोपित किया गया था, जो ऑटिज्म स्पेक्ट्रम विकार और कॉर्टिकल डिस्प्लेसिया-फोकल मिर्गी सिंड्रोम के लिए एक मॉडल था। Cntnap2 KO चूहों में, वास्तव में, HDINs 9 महीने तक पीटी तक जीवित रहे और इंजेक्शन साइट पर स्थानीयकृत थे, हालांकि वे डब्ल्यूटी चूहों (चित्रा 5) में देखे गए मस्तिष्क और यहां तक कि विपरीत हिप्पोकैम्पस में भी फैले हुए थे। इसके अलावा, अधिकांश ग्राफ्टेड एचडीआईएन इंटरन्यूरॉन मार्करों के लिए इम्यूनोरिएक्टिव थे, जैसा कि विट्रो 8,26 में और विवो25 में वयस्क कृन्तकों में पिछले परिणामों से अपेक्षित था।

Figure 5
चित्रा 5: 9 महीने पीटी पर Cntnap2 KO चूहों के हिप्पोकैम्पस में ग्राफ्टेड HDINs। (ए) सेल-ट्रांसप्लांट (बाएं) और शाम (दाएं) चूहों में साइटोप्लाज्मिक मानव मार्कर एसटीईएम 121 के खिलाफ इम्यूनोकैमिस्ट्री। (a1 और a2) एसटीईएम 121 सकारात्मक कोशिकाओं की बढ़ी हुई छवियां। (बी) एसटीईएम 121 (मैजेंटा) और इंटरन्यूरॉन मार्करपारवलबुमिन (पीवी) और सोमाटोस्टैटिन (एसएसटी) के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस। सफेद तीर एसटीईएम 121 और संबंधित इंटरन्यूरॉन मार्कर के लिए डबल पॉजिटिव कोशिकाओं का संकेत देते हैं। (सी) एसटीईएम 121 और पीवी के लिए ग्राफ्टेड एचडीआईएन इम्यूनोरिएक्टिव का ऑर्थोगोनल दृश्य। स्केल बार: 200 μm (A और B), 100 μm (a1 और a2), 20 μm ( a1 और a2, और C में छोटा वर्ग आवर्धन)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्र 1: नवजात डब्ल्यूटी चूहों के हिप्पोकैम्पस में 2 महीने के पीटी पर ग्राफ्टेड एचडीआईएन एएससीएल 1 व्यक्त करते हैं। सेल-प्रत्यारोपित डब्ल्यूटी चूहों में (ए) सीए 3 और (बी) डीजी में एएससीएल 1 और साइटोप्लाज्मिक मानव मार्कर एसटीईएम 121 के खिलाफ इम्यूनोफ्लोरेसेंस। (ए) एसटीईएम 121 पॉजिटिव सेल की आवर्धित छवि। सफेद तीर एसटीईएम 121 और एएससीएल 1 के लिए डबल-पॉजिटिव कोशिकाओं का संकेत देते हैं। स्केल पट्टी: 100 μm. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: नवजात डब्ल्यूटी चूहों के हिप्पोकैम्पस में 2 महीने के पीटी पर पोस्ट-माइटोटिक ग्राफ्टेड एचडीआईएन। (ए) भोले और (बी) सेल-प्रत्यारोपित डब्ल्यूटी चूहों में प्रोलिफेरेटिव मार्कर Ki67 और साइटोप्लाज्मिक मानव मार्कर एसटीईएम 121 के खिलाफ इम्यूनोफ्लोरेसेंस। (बी) एसटीईएम 121 पॉजिटिव सेल की आवर्धित छवि। पीला तीर Ki67 के लिए एक सेल सकारात्मक और STEM121 के लिए नकारात्मक इंगित करता है। सफेद तीर एसटीईएम 121 के लिए सकारात्मक और Ki67 के लिए नकारात्मक कोशिकाओं को इंगित करता है। सफेद तारांकन चिह्न एक पार्श्व वेंट्रिकल को इंगित करता है। स्केल पट्टी: 100 μm. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल विट्रो में एचडीआईएन अग्रदूतों को उत्पन्न करने के लिए एक मजबूत, तेज, सरल और व्यापक रूप से सुलभ पद्धति का वर्णन करता है और न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों के प्रीक्लिनिकल मॉडल में प्रारंभिक इंटरवेंशनल सेल थेरेपी के रूप में इसका उपयोग करता है।

भले ही किशोरावस्था या वयस्कता के दौरान न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों के कुछ विशिष्ट फेनोटाइप उत्पन्न होते हैं, लेकिन प्रारंभिक विकास के दौरान पैथोफिजियोलॉजिकल परिवर्तन पहले से ही मौजूद होते हैं। इस कारण से, रोगसूचकता या नैदानिक अभिव्यक्ति से पहले महत्वपूर्ण मस्तिष्क विकास अवधि में कार्य करके लाभकारी प्रभाव प्राप्त करने के लिए प्रारंभिक हस्तक्षेप अत्यधिक आवश्यक होगा। भविष्य में, आनुवंशिक स्क्रीनिंग और बायोमाकर्स का विकास रोगनिरोधी या पूर्व-रोगसूचक उपचार को वहन करेगा, जो उन रोगियों के लिए एक गेम चेंजर का प्रतिनिधित्व करेगा। इसलिए, एचडीआईएन अग्रदूतों को Cntnap2 KO माउस मॉडल में जन्म के तुरंत बाद प्रत्यारोपित किया गया था जब न्यूरोनल नेटवर्क में एपिलेप्टोजेनिकपरिवर्तन चल रहे हो सकते हैं और एक समय बिंदु पर जिस पर इस पशु मॉडल29 में सेलुलर परिवर्तनों का वर्णन किया गया है। हालांकि, उम्र के सुधार के संभावित नुकसान और माउस बनाम मानव मस्तिष्क में कुछ प्रक्रियाओं के समय पर विचार करना महत्वपूर्ण है।

प्रक्रिया पर ध्यान केंद्रित करते हुए, यहां प्रस्तुत भेदभाव प्रोटोकॉल प्रतिलेखन कारकों के उपयोग पर आधारित है, जो छोटे अणुओं10,30 के आधार पर कहीं और अन्य प्रोटोकॉल की तुलना में स्टेम कोशिकाओं के तेज और अत्यधिक कुशल प्रोग्रामिंग की अनुमति देता है। इस दृष्टिकोण का एक संभावित दोष लेंटिवायरल वैक्टर की आवश्यकता हो सकती है, जिसमें सम्मिलन म्यूटेनेसिस का खतरा होता है। प्रोटोकॉल में दो महत्वपूर्ण कदम क्रमशः टेराटोमा गठन के जोखिम से बचते हुए, प्रतिलेखन कारकों को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के लिए चयन करने और प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं को खत्म करने के लिए माध्यम में एंटीबायोटिक दवाओं और एंटी-माइटोटिक एजेंट को जोड़ना है। यद्यपि इस अध्ययन में केवल एचडीआईएन अग्रदूतों का परीक्षण किया गया था, प्रक्रिया को अन्य सेल स्रोतों और प्रोग्रामिंग / भेदभाव प्रोटोकॉल के साथ संभव होने की उम्मीद है। फिर भी, अन्य न्यूरोनल उपप्रकारों और / या मॉडल को मान्य किया जाना चाहिए।

प्रत्यारोपण के लिए एचडीआईएन अग्रदूत की आयु, 7 DIV, (i) प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं की अनुपस्थिति के आधार पर तय की गई थी, जिसका मूल्यांकन Ki67 के खिलाफ विकृति द्वारा किया गया था, (ii) पीओयू 5 एफ 1 जैसे प्लूरिपोटेंसी जीन की अभिव्यक्ति में कमी के पहले रिपोर्ट किए गए अवलोकन और उस समय न्यूरोनल मार्कर एमएपी 2 और इंटरन्यूरॉन मार्कर जीएडी 1 की उपस्थिति 8 के आधार पर तयकिया गया था। . हालांकि, इस प्रोटोकॉल का वर्णन करने वाले मूल काम ने डीओएक्स निकासी9 के बाद 14 DIV पर प्रत्यारोपण किया। यह इस बारे में सवाल उठाता है कि क्या मां के पीने के पानी में डीओएक्स दूध के माध्यम से नर्सिंग पिल्ले के दिमाग में ग्राफ्ट की गई कोशिकाओं तक पहुंच सकता है, या यदि डीओएक्स प्रेरण का 7 DIV GABArgic भाग्य स्थापित करने के लिए पर्याप्त है। यद्यपि यांग एट अल ने विट्रो9 में स्थिर न्यूरोनल कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए डीओएक्स के 14 दिनों की पहचान की, गोंजालेज-रामोस एट अल.8 ने पहले से ही 7 DIV पर जीएडी 1 जीन अभिव्यक्ति का पता लगाया, यह दर्शाता है कि Ascl1 और Dlx2 द्वारा GAD67 का डाउनस्ट्रीम सक्रियण पहले से ही इस समय हुआ है। इसलिए, पैटर्निंग 7 DIV पर शुरू हो गई है और DOX उपचार पर कम निर्भर हो सकती है। इसके अलावा, कृन्तकों और मनुष्यों में साक्ष्य स्तन के दूध31,32 में डीओएक्स की उपस्थिति को इंगित करते हैं, और यहां प्रस्तुत परिणाम बताते हैं कि ग्राफ्टेड एचडीआईएन 2 सप्ताह और 2 महीने पीटी पर एएससीएल 1 के लिए इम्यूनोरिएक्टिव थे और बाद में 9 महीने पीटी पर इंटरन्यूरॉन मार्कर थे। ग्राफ्टेड आबादी के भीतर, पीवी और एसएसटी पॉजिटिव न्यूरॉन्स के अलावा, इंटरन्यूरॉन की उप-आबादी के लिए अन्य मार्कर भी कम मात्रा में पाए गए, जैसे कि कैलरेटिनिन (सीआर) और कैलबिन्डिन (सीबी)।

इस प्रक्रिया का एक चुनौतीपूर्ण पहलू भेदभाव और पिल्ले की उम्र दोनों के लिए समय का समन्वय है। आमतौर पर, माउस गर्भधारण में संभोग पिंजरे को स्थापित करने के बाद 21 दिन लगते हैं, हालांकि यह कभी-कभी भिन्न हो सकता है। वयस्क कृन्तकों में सेल प्रत्यारोपण करते समय यह परिदृश्य नहीं होता है जब सब कुछ सावधानीपूर्वक नियोजित और व्यवस्थित किया जा सकता है। फिर भी, इसे 2 दिन के अंतराल के साथ दो से तीन संभोग पिंजरों या एक दूसरे से 2 दिन के समय-अंतराल के साथ दो से तीन भेदभाव बैचों को स्थापित करके आसानी से कम किया जा सकता है।

यद्यपि इस अध्ययन में उपयोग किए गए चूहे न तो इम्यूनोडेफिशिएंसी थे और न ही इम्यूनोसप्रेस्ड थे, प्रत्यारोपित कोशिकाएं विवो में 9 महीने तक जीवित रहीं, और ज़ेनोजेनिक कोशिकाओं या स्थानीय सूजन के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के मार्कर पी 14 या 2 महीने पीटी पर नहीं देखे गए। 34. इसलिए, टी कोशिकाओं के मार्करों के साथ-साथ प्रतिक्रियाशील माइक्रोग्लिया के लिए विकृति का पता लगाया गया था। मेजबान ऊतक में ग्राफ्टेड कोशिकाओं की प्रतिरक्षा अस्वीकृति का कोई संकेत या तो प्रतिक्रियाशील माइक्रोग्लिया के स्तर से या पी 14 या 2 महीने में डब्ल्यूटी चूहों में टी लिम्फोसाइटों की उपस्थिति से नहीं पाया गया था। इसके अलावा, एस्ट्रोग्लियोसिस और भड़काऊ साइटोकिन्स के मूल्यांकन स्तर के आधार पर कोई स्थानीय सूजन नहीं देखी गई। यह परिणाम आंशिक रूप से नवजात प्रतिरक्षा सहिष्णुता 35,36,37 पर निर्भर हो सकता है, जो अन्य सेल पहचान, स्थानों और पशु मॉडल 35,38 द्वारा देखा गया है। एंग्लुंड एट अल ने प्रवासन और परिपक्वता के संदर्भ में ग्राफ्टेड कोशिकाओं के परिणाम में क्षेत्रीय अंतर की पहचान की, जिसमें आसन्न सफेद पदार्थ35 में ग्राफ्टेड कोशिकाओं का अवलोकन भी शामिल है।

अंत में, वयस्क कृन्तकों में प्रत्यारोपण करने वाले अन्य अध्ययनों की तुलना में हिप्पोकैम्पस के भीतर ग्राफ्टेड कोशिकाओं का अधिक फैलाव देखा गया, जहां एचडीआईएन एक ग्राफ्टेड कोर25 के रूप में बने रहे। यह फैलाव यांग एट अल.9 द्वारा पहले देखे गए परिणामों से भी भिन्न था, जिसे इस मामले में प्रत्यारोपण के समय कोशिकाओं की उम्र से समझाया जा सकता है।

Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं किया है।

Acknowledgments

इस परियोजना को स्वीडिश रिसर्च काउंसिल (अनुदान संख्या: 2016-02605, एमए), स्वीडिश ब्रेन फाउंडेशन एफ 02021-0369 (एमए), क्रैफूर्ड फाउंडेशन (एमए), और यूरोपीय संघ क्षितिज 2020 कार्यक्रम (एच 2020-एमएससीए-आईटीएन -2016) द्वारा मैरी स्केडोव्स्का-क्यूरी इनोवेटिव ट्रेनिंग नेटवर्क प्रोजेक्ट ट्रेनिंग 4 सीआरएम नंबर 722779 के तहत वित्त पोषित किया गया था। हम पी 2 नवजात चूहों में स्टीरियोटैक्सिक सेल प्रत्यारोपण सिखाने के लिए जोसेप मारिया कैनाल्स लैब (स्टेम सेल और पुनर्योजी चिकित्सा प्रयोगशाला, बार्सिलोना विश्वविद्यालय) से एंड्रेस मिगुएज़ और ऑस्टिन में टेक्सास विश्वविद्यालय में समूह के नेता मैकेंजी हॉवर्ड से मदद के लिए बेहद आभारी हैं। हम पशु देखभाल के साथ सहायता के लिए सुज़ैन गेरेस और ऊतक प्रसंस्करण के साथ मदद के लिए लिंग काओ को धन्यवाद देते हैं, साथ ही साथ उन छात्रों को जिन्होंने अध्ययन और विशेष रूप से डायना हैटामियन में एक या दूसरे तरीके से योगदान दिया है। अंत में, इस पेपर को चित्रित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले कुछ ग्राफिक्स BioRender.com के साथ बनाए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30 G needle B Braun 4656300
33 G needle for Hamilton syringe Hamilton 7762-06
4-well plates Thermo Scientific 176740
Accutase STEMCELL Technologies 7920 Cell detachment solution use for splitting cells (hESC and hdIN precursors)
Adjustable volume pipettes 10, 20, 200, 1000 µL
Alexa Fluor Plus 488/555/647 Thermo Fisher 1:1000
Anti-CD68 (Rat) Bio-Rad MCA1957 1:200
Anti-CD8 (Rabbit) Abcam 203035 1:200
Anti-Galectin 3 (Goat) R&D systems AF1197 1:500
Anti-GFAP (Guiena Pig) Synaptic systems 173004 1:500
Anti-Iba1 (Rabbit) WAKO 19119741 1:500
Anti-IL1 (Goat) Santa Cruz Biotech SC-106 1:400
Anti-Ki67 Abcam ab16667 1:250
Anti-Ki67 (Rabbit) Novocastra NCL-Ki67p 1:250
Anti-MAP2 (Chicken) Abcam ab5392 1:2000
Anti-Mash1 (Ascl1) Abcam ab74065 1:1000
Anti-Parvalbumin (Rabbit) Swant PV 27 1:5000
Anti-Somatostatin (Rat) Millipore MAB354 1:150
Anti-STEM121 (Mouse) Takara Bio Y40410 1:400
Avidin/Biotin Blocking Kit VECTOR Laboratories SP-2001
B6.129(Cg)-Cntnap2tm1Pele/J Jackson Laboratory 17482 Animal model
Biotinylated Horse anti-Mouse VECTOR Laboratories BA-2001 1:200
Burker Chamber Thermo Fisher Scientific 10628431
C57BL/6J Janvier Labs Animal model
Centrifuge For 15 mL tubes
Confocal microscope Nikon  Confocal A1RHD microscope
Costar 6-well Clear TC-treated  Corning 3516
Cy3 Streptavidin Jackson ImmunoResearch 016-160-084 1:200
Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) Sigma C1768 4 µM
DAB Substrate Kit, Peroxidase (With Nickel) VECTOR Laboratories SK-4100
Digital Stereotax KOPF Model 940
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11320082 Use for the N2 medium
DNase I Solution STEMCELL Technologies 7900 1 µg/mL
Doxycyclin Sigma-Aldrich D9891 2 µg/mL
DPBS -/- Gibco 14190144
Epifluorescence microscope Olympus BX51 Microscope
Ethanol Solveco 70%, 95%, 99.8%
FUW-rTA Addgene 20342 Lentiviral vector
FUW-TetO-Ascl1-T2A-puromycin Addgene 97329 Lentiviral vector
FUW-TetO-Dlx2-IRES-hygromycin Addgene 97330 Lentiviral vector
H1 (WA01) ESC WiCell WA01 Human embryonic stem cell line under a MTA agreement
H2O2 Sigma-Aldrich 18304
Hamilton Syringe Hamilton 7634-01 5 µL
HBSS Gibco 14175095 No calcium, No magnesium - Transplantation medium
Hoechst 33342 Invitrogen H3570 1:1000
Hygromycin B Gibco (Invitrogen) 10687010
Incubator 5% CO2, 37 °C
Isoflurane Baxter Apoteket AB
Manual cell counter VWR 720-1984
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free Corning 354277 For the coating
Methanol Merck Millipore 1060091000
Microscope Coverslips 24 x 60 mm Thermo Scientific BBAD02400500#A113MNZ#0##
Microscope Slides VWR 631-1551
Microscope Software Olympus CellSens
Mounting media Merck 10981 PVA-Dabco 
Mouse adaptor to stereotax RWD 68030
mTeSR1 STEMCELL Technologies 85850 Kit Basal Medium and 5X Supplement - Stem cell culture medium
N2 supplement Gibco 17502048
NaOH Sigma-Aldrich S8045 1M
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P0781
Pertex HistoLab 811
Pipet Filler
Play-Doh
Puromycin (Dihydrochloride) Gibco A1113803
Round cover glasses thickness No. 1.5H (tol. ± 5 μm) 13 mm Ø Marienfeld MARI0117530 For immunocytochemistry
Serum Thermo Fisher Goat, Donkey, Horse
Sterile pipette tips For volumes 0.1-1000 µL
Sterile serological pipettes 5, 10, 25 mL
Sterile water Braun B Braun 3626873
Sucrose Sigma-Aldrich S8501 For 0.5% Sucrose solution
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Trypan Blue Solution Gibco 15250061
Tubes Sarstedt 15 ml, Eppendorf 1.5 mL
Tweezer VWR
Ultra pure water MilliQ Water System
Xylene VWR 28973.363
Y-27632 (ROCK inhibitor) STEMCELL Technologies 72304 10 µM

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 189
न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों को कम करने के लिए प्रारंभिक प्रसवोत्तर माउस हिप्पोकैम्पस में मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न जीबीएर्जिक न्यूरॉन्स का प्रत्यारोपण
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Gonzalez-Ramos, A., Laurin, K.,… More

Gonzalez-Ramos, A., Laurin, K., Berglind, F., Ledri, M., Kokaia, M., Andersson, M. Transplantation of Human Stem Cell-Derived GABAergic Neurons into the Early Postnatal Mouse Hippocampus to Mitigate Neurodevelopmental Disorders. J. Vis. Exp. (189), e64272, doi:10.3791/64272 (2022).

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