Summary
Transplantasjon av humane pluripotente stamcelleavledede GABAergiske nevroner generert av nevronprogrammering kan være en potensiell behandlingsmetode for nevroutviklingsforstyrrelser. Denne protokollen beskriver generering og transplantasjon av humane stamcelleavledede GABAergiske nevronale forløpere i hjernen til nyfødte mus, noe som muliggjør langsiktig undersøkelse av podede nevroner og evaluering av deres terapeutiske potensial.
Abstract
Et redusert antall eller dysfunksjon av hemmende interneuroner er en vanlig bidragsyter til nevrodevelopmental lidelser. Derfor er celleterapi ved hjelp av interneuroner for å erstatte eller redusere effekten av endrede nevronkretser en attraktiv terapeutisk avenue. For dette formål er det behov for mer kunnskap om hvordan humane stamcelleavledede GABAergiske interneuronlignende celler (hdINs) modnes, integreres og fungerer over tid i vertskretsene. Av særlig betydning i nevroutviklingsforstyrrelser er en bedre forståelse av om disse prosessene i transplanterte celler påvirkes av en utviklende og moden vertshjerne. Denne protokollen beskriver en rask og svært effektiv generering av HDIN-er fra humane embryonale stamceller basert på det transgene uttrykket av transkripsjonsfaktorene Ascl1 og Dlx2. Disse nevronale forløperne transplanteres ensidig, etter 7 dager in vitro, til hippocampus av neonatal 2 dager gamle mus. De transplanterte nevronene sprer seg i ipsi- og kontralateral hippocampus av en musemodell av kortikal dysplasi-fokal epilepsisyndrom og overlever i opptil 9 måneder etter transplantasjon. Denne tilnærmingen gjør det mulig å undersøke den cellulære identiteten, integrasjonen, funksjonaliteten og terapeutiske potensialet til transplanterte interneuroner over lengre tid for å utvikle sunne og syke hjerner.
Introduction
Etablering, modning og forfining av nevrale nettverk skjer i perinatal og tidlig postnatal periode og represer et avgjørende tidsvindu for hjernens utvikling1. Fra en begeistring av tilkobling etter fødselen, utvikler hjernen seg til en finjustering av tilkoblinger som strekker seg til ungdomsårene2. Følgelig definerer endringer i gener uttrykt i disse periodene, samt eksterne faktorer eller fornærmelser, en persons predisponering for flere nevrodevelopmental lidelser. Forringelser i kognisjon og motorisk funksjon utfolder seg over tid, og farmakologiske behandlinger er begrenset, de fleste retter seg mot symptomer med risiko for alvorlige bivirkninger.
Dysfunksjon i gamma-aminosmørsyre (GABA) ergisk inhibering har vist seg å være en viktig bidragsyter til den underliggende årsaken til ulike nevrodevelopmental lidelser3, som fragilt X-syndrom, Angelman syndrom, epilepsi, skizofreni og autisme. GABA er den viktigste hemmende senderen i sentralnervesystemet og er medvirkende til å opprettholde eksitatorisk / hemmende (E / I) balanse, synkronisering av nevronavfyring og beregning. GABAergic interneurons er en heterogen populasjon av nevroner, med økende funksjonell intricacy i mer komplekse hjernegrupper4 og med evolusjon 5,6. Tatt i betraktning den begrensede endogene regenerative kapasiteten til den menneskelige hjerne og implikasjonen av interneuron dysfunksjon i flere nevrologiske lidelser, kan transplantasjon av GABAergic interneurons være en lovende terapeutisk vei å utforske. Langs denne linjen synes humane stamcelleavledede GABAergic interneuron-like celler (hdINs) å være den mest translasjonelle og levedyktige kilden til dette formålet sammenlignet med gnagere allogene nevronale forløpere eller andre kilder som brukes andre steder7. Protokoller for generering av GABAergiske nevroner fra ulike cellekilder er tilgjengelige 8,9,10,11,12,13, men mer kunnskap er nødvendig om hvordan HSINs modnes, integreres og fungerer over tid i en utviklende patologisk hjerne. Flere studier har identifisert endringer i gener som er aktive under kortikal mønster, etablering av nevronforbindelse14 og innstilling av fysiologisk E / I-balanse15. Neonatal transplantasjon av HDIN i musemodeller med tilsvarende genetiske forstyrrelser gjør at vi kan følge samspillet mellom vert og transplantat, som er kunnskap som er nødvendig for å bestemme potensielle terapeutiske strategier.
Immunmodulering brukes ofte og vellykket i xenografttransplantasjoner for å unngå å utløse en vertsimmunrespons og avvisning16. Imidlertid forårsaker administrering av immunosuppressive legemidler, som ciklosporin A, nyretoksisitet etter kronisk administrering, er arbeidsintensiv på grunn av behovet for daglige intraperitoneale injeksjoner for å oppnå stabile systemiske konsentrasjoner, forårsaker dyrestress17, og har off-target effekter som kan interagere med patologi18. I tillegg har kompromittering av immunsystemet vist seg å endre atferdsfenotyper19, med endringer i de tilsvarende nevroanatomiske regionene20. Transplantasjon i første leveuke har vist seg å muliggjøre tilpasning til transplanterte celler 21,22, mens andre har rapportert initial overlevelse etterfulgt av avstøtning av transplantatene innen første postnatale måned 23,24.
Denne protokollen beskriver prosedyrer fra HSIN-generering til celletransplantasjon hos nyfødte mus som resulterer i langsiktig transplantatoverlevelse og muliggjør undersøkelse av nevronspesifisitet, synaptisk integrasjon, funksjon og terapeutisk potensial for transplanterte humane internevroner under fysiologisk og patologisk utvikling.
Protocol
Alle forsøksprosedyrer ble godkjent av Malmö/Lunds dyreetiske råd, etisk tillatelse nummer 12548-19, og utført i samsvar med det svenske dyrevelferdsbyråets forskrifter og EU-direktiv 2010/63/EU for dyreforsøk. C57BL6/J og Contactin-assosierte proteinlignende 2 (Cntnap2) knock-out (KO) mus, både hanner og hunner, ble brukt på barseldag (P) 2 for denne studien. Humane embryonale stamceller (hESCs) ble brukt. Dyrene og stamcellene ble hentet fra kommersielle kilder (se materialtabell).
1. Generering av hdIN-forløperne
MERK: Alle trinnene i denne delen er gjort i en cellekultur hette. HESC-ene ble opprettholdt som materfrie celler på belagte plater ved hjelp av et stamcellekulturmedium og passasjert som kolonier.
- Utfør fremoverprogrammering av hESC-ene til hdIN-forløpere (figur 1).
MERK: Den fremadrettede programmeringsmetoden er basert på prosedyren beskrevet i Gonzalez-Ramos et al.8 og Yang et al.9.- Transduser hESCene med lentivirale vektorer som inneholder Tet-On-systemet i et friskt stamcellekulturmedium som inneholder 10 μM ROCK-hemmer (RI) (se materialtabell). Oppbevares ved 37 °C i inkubatoren.
- Bytt medium til et friskt stamcellekulturmedium 16 timer etter transduksjon og oppretthold de transduserte cellene på samme måte som de ikke-transducerte hESCene.
- Når de flyter, løsner du hESCene som enkeltceller ved hjelp av en celleløsning (se materialtabell) og plate dem i belagte 6-brønnsplater med en tetthet på 3 x 105 celler / brønn i stamcellekulturmedium som inneholder 10 μM RI på dag in vitro (DIV) -1.
- Ved 1 DIV erstatter du dyrkingsmediet med N2-medium som inneholder 2 g/l doksysyklin (DOX, se materialtabell).
MERK: DOX brukes til å indusere transgen ekspresjon av Ascl1 og Dlx29, fra 1 DIV til 7 DIV, og fortsetter deretter in vivo ved å legge til drikkevannet25. - Ved 2 DIV starter en seleksjonsperiode for antibiotikaresistens som vil vare til 5 DIV. Tilsett puromycin (puro) og hygromycin (hygro) til det friske mediet (se Tabell over materialer). Endre medium på 2 DIV, 4 DIV og 5 DIV.
MERK: Optimaliser konsentrasjonene av puro og hygro før differensieringsprotokollen ved hjelp av transduserte og ikke-transduserte hESC-er for å sikre overlevelse av bare cellene som bærer antibiotikaresistenskassettene. I denne protokollen ble det brukt 0,5 μg/ml puro og 750 μg/ml hygro. - Ved 5 DIV avsluttes antibiotikaseleksjonsperioden. Bytt til N2-medium supplert med 2 g/l DOX og 4 μM cytosin β-D-arabinofuranosid (Ara-C, se materialtabell).
Figur 1: Generering av hdIN-forløpere fra hESC ved å overuttrykke Ascl1 og Dlx2. (A) Skjemaer for differensieringsprotokollen som brukes til generering av hdIN-forløpere. (B-E) Immuncytokjemi av hdIN-forløpere ved 7 DIV for (B) nevronmarkøren MAP2, (C) den proliferative markøren Ki67, (D) generell kjernefarging og (E) en sammenslåing av de tidligere markørene. Skala bar: 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Fremstilling av encellet suspensjon for transplantasjon
MERK: Alle trinnene i denne delen er gjort i cellekulturhetten. På 7 DIV dissosieres hdIN-forløpere og brukes til transplantasjon.
- Utfør løsrivelse av cellene ved å følge trinnene nedenfor.
- Fjern mediet og skyll forsiktig cellene med DPBS uten kalsium og magnesium.
- Tilsett 400 μL av celleløsningen (se materialtabell) til hver brønn på 6-brønnsplaten.
MERK: Sikre dekning av hele overflaten av løsningen. - Inkuber i 2-3 minutter ved 37 °C i inkubatoren til cellegrensen begynner å se skinnende ut, noe som indikerer enzymatisk nedbrytning av celleoverflateproteiner og løsrivelse fra brønnoverflaten.
MERK: For å øke celleoverlevelsen, ikke vent for lenge når alle cellene er helt løsrevet og flyter rundt. - Deretter tilsettes 600 μL friskt N2-medium til hver brønn på 6-brønnsplaten for å stoppe enzymet, og mekanisk med pipetten, bidrar til å løsne cellene for å oppnå en encellet suspensjon.
- Overfør cellesuspensjonen til et plastrør (15 ml) og sentrifuger ved 180 x g i 4 minutter ved romtemperatur (RT).
- Utfør resuspendering av cellene.
- Kast supernatanten ved hjelp av et vakuumsystem (forsiktig, uten å forstyrre pelleten) og resuspendere pelleten i transplantasjonsmediet som inneholder 10 μM RI, 1 μg/ml DNase og 2 μg/μL DOX.
- Tell de totale cellene i suspensjonen ved hjelp av et tellekammer og en manuell celleteller og juster volumet til en endelig konsentrasjon på 100 000 celler / μL.
- Hold cellesuspensjonen i et lukket rør på is til transplantasjon i maksimalt 4 timer.
MERK: Transplantasjonen må utføres samme dag som tilberedningen av cellesuspensjonen (7 DIV).
3. Intrahippocampal celletransplantasjon
MERK: Alle trinnene i denne delen utføres utenfor cellekulturhetten i dyreavdelingen. Tidlig postnatal transplantasjon av celler inn i hjernen ble utført på P2, med tanke på P0 som fødselsdag.
- Forbered deg på transplantasjonseksperimentet ved å følge trinnene nedenfor.
- Autoklav alt kirurgisk materiale eller, hvis ikke mulig, steriliseres med en annen godkjent metode.
- Monter injeksjonssprøyten i holderen uten glasskapillær. Skyll nålen med vann.
MERK: Kanylen må være 33 G. - Kurve 90° tuppen av en 30 g insulinnål.
- Lag en hjemmelaget Play-Doh-lignende scene for plassering av valpen med hodet flatt (figur 2A).
- Hent museburet med moren og valpene før du forbereder noe for operasjonen slik at de kan akklimatisere seg til det nye miljøet.
- Forbered et brett med våt is og et tomt bur med litt papir til isofluranen.
- Bedøv musepuppen.
- Bløtlegg et stykke papir med isofluran (se materialtabell) og legg det inne i det tomme buret. Ta forsiktig en valp og legg den i buret med papiret gjennomvåt i isofluran.
MERK: La aldri mindre enn tre valper være hos moren. Ikke overskrid 20-30 s isofluranbedøvelse, eller valpen kan dø. - Kontroller effekten av anestesien ved bevegelsesstans.
- Umiddelbart etter anestesi, legg valpen på et vått vev på overflaten av våt is. Hold dyret på is i 3 minutter til overekstremitetene blir hvite (figur 2B, blå pil). Dette tar vanligvis 2-3 min.
- Bruk denne tiden til å fylle sprøyten med cellesuspensjonen. Resuspend cellene forsiktig med en pipette før.
- Plasser valpen på stereotaksisk ramme. Bruk ørestengene i motsatt retning (figur 2A, magentapiler).
MERK: Baksiden av ørestengene er mindre spiss, og siden P2-valper ikke har ører, bruk den flatere siden for å unngå å skade dyret. - Fra siden, sjekk om hodet er rett. Hodet må være flatt; bruk Play-Doh-lignende scene for å justere for det.
MERK: Valper i denne alderen har ennå ikke åpnet øynene, så det må ikke gjøres noe ekstra skritt i denne forbindelse. Valper har ikke pels i denne alderen, så det er ikke nødvendig med barbering av området. Ingen spesifikk smertebehandling er gitt, da det ikke er et åpent snitt til huden, og ingen suturering er involvert. - Hold valpen dekket på is (på toppen av silkepapir) i hele operasjonens varighet.
NOTAT: Ikke plasser isen i direkte kontakt med valpens hud.
- Bløtlegg et stykke papir med isofluran (se materialtabell) og legg det inne i det tomme buret. Ta forsiktig en valp og legg den i buret med papiret gjennomvåt i isofluran.
- Utfør injeksjonen.
- Rengjør overflaten av huden med et mykt vev gjennomvåt i etanol.
- Identifiser lambda og sett koordinatene til null på den digitale skjermkonsollen til det stereotaksiske instrumentet (figur 2C, gul stiplet linje). Sagittal og lambdoid suturer er lett synlige for øyet, siden de er vaskularisert, som røde linjer.
MERK: Hvis du har problemer med å visualisere lambda, legg et lite stykke is på huden og vent et par minutter på at den skal avkjøles. Fjern deretter isstykket, og den subtile blekingen av huden lar deg visualisere. - Flytt kanylen til de ønskede koordinatene. I den beskrevne protokollen var den målrettede regionen hippocampus, og koordinatene var som følger: anterior-posterior (AP) +0,85 og medio-lateral (ML) +1,35.
- Bruk en 90 ° bøyd insulinnål for å trenge inn i skallen og lage et lite hull.
- Ta ned injeksjonsnålen til den har krysset skallen, og null dorso-ventral (DV) koordinatene. Senk nålen til ønsket DV-koordinater. I den beskrevne protokollen var koordinatene DV -1.1.
- Injiser i henhold til de forhåndsbestemte tidsintervallene.
MERK: I den beskrevne protokollen var de nøyaktige tidspunktene følgende: (i) etter å ha gått ned til DV-koordinaten, vent 3 min, (ii) injiser 1 μL volum i 5 minutter, og (iii) etter at alt volumet er injisert, vent 3 min. - Trekk nålen sakte tilbake.
- Avslutt prosedyren.
MERK: Operasjonen kan ikke vare mer enn 15 minutter for å sikre valpens overlevelse og unngå skade som følge av anestesi ved hypotermi.- Varm opp valpen med hendene til den begynner å bevege seg før du gir den tilbake til moren.
- Gi DOX i en konsentrasjon på 1 mg/ml i 0,5 % sukroseoppløsning som drikkevann i minst 2 dager før og 3 uker etter transplantasjon (PT) for å fortsette celledifferensieringen in vivo.
Figur 2: Stereotaksisk transplantasjon hos nyfødte mus hos valper ved P2. (A) En Play-Doh-lignende scene for å holde valpens kropp på plass og inverterte ørestenger (magenta piler). (B) Hvit fremre pote (blå pil) som indikerer den reduserte blodstrømmen i dette området, slik at valpen opplever anestesi ved hypotermi. (C) Oversikt over oppsettet med valpen allerede dekket av is over bløtvevspapiret. (c#) Lukket zoom av valpens hode, med injeksjonsnålen allerede satt inn i hjernen (gul stiplet linje som indikerer lambda- og lambdoid suturer). Denne figuren er tilpasset fra Gonzalez Ramos et al. 27. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Representative Results
Etter protokollen presentert her og illustrert i figur 1A, var hdIN-forløpere ikke proliferative ennå ved 7 DIV som definert av (i) negativ immunreaktivitet for cellesyklusmarkøren Ki67 og (ii) uttrykk for nevronmarkører som mikrotubuliassosiert protein 2 (MAP2) (figur 1B-E). Denne karakteriseringen ble utført på restceller replated i 24 timer etter å ha gjennomgått alle prosedyretrinnene. I tillegg indikerte genuttrykksanalysen publisert tidligere at en rask overgang fra pluripotent tilstand til en nevronal fenotype forekommer rundt 4 DIV og 7 DIV8. Samlet sett bekreftet disse resultatene tilstedeværelsen av postmitotiske celler og fraværet av risiko for teratomdannelse.
Deretter ble hdIN-forløpernes overlevelse etter tidlig postnatal transplantasjon i hippocampus hos villtypemus (WT) testet ved immunhistokjemi mot den humane cytoplasmatiske markøren STEM121. HDIN-forløperne ble transplantert inn i høyre dorsale hippocampus hos naive immunkompetente mus ved P2, som deretter ble ofret ved P14 og 2 måneders PT. Podede celler ble funnet over hele dorsale hippocampus, samt spredt gjennom corpus callosum og kontralateral hippocampus, på begge tidspunkter. Dessuten uttrykte transplanterte hdINer på begge tidspunktene Ascl1, en av induksjonstranskripsjonsfaktorene (supplerende figur 1), og var ikke proliferative, noe fraværet av Ki67-uttrykk indikerte (supplerende figur 2).
Det er viktig at ingen immunreaksjon eller lokal betennelse mot de transplanterte cellene ble funnet verken ved P14 eller 2 måneders PT, vurdert ved fravær av reaktiv mikroglia identifisert ved bruk av Iba1, CD68 og galektin-3 (Gal3) (figur 3), omfanget av astrogliose bestemt av glial fibrillært surt protein (GFAP) og inflammatoriske cytokiner som interleukin-1 (IL-1), og fravær av cytotoksiske T-lymfocytter (CD8) (figur 4).
Figur 3: hdINs ved P14 og 2 måneder PT inn i hippocampus hos nyfødte WT-mus uten å utløse immunavvisning fra vertsvevet. Immunfluorescens for Iba1-, CD68- og Gal3-markører i hjernevev fra (A-D) nærheten til et iskemisk kjerneområde i en elektrokoagulasjonsslagmusmodell (positiv kontroll, Ctrl +), (E-H) negative kontrolldyr (Ctrl-) ved 2 måneder og (M-P) P14, og (I-L) dyr som har gjennomgått celletransplantasjon etter 2 måneder og (Q-T ) P14. De hvite pilene indikerer noen eksempler på blodkar som er synlige i alle kanaler på grunn av autofluorescens. Forkortelser: Ctx = cortex; Hip = hippocampus; DG = dentate gyrus; CA1 = cornu ammonis 1. Skala bar: 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: hdINs ved 2 måneders PT inn i hippocampus hos nyfødte WT-mus uten å utløse immunavvisning fra vertsvevet. Immunfluorescens for IL1-, GFAP- og CD8-markører i hjernevev fra (AD) nærheten til et iskemisk kjerneområde i en elektrokoagulasjonsslagmusmodell (positiv kontroll, Ctrl +), (E-H) negative kontrolldyr (Ctrl-) ved 2 måneder, og (I-L) dyr som har gjennomgått celletransplantasjon etter 2 måneder. Forkortelser: Ctx = cortex; Hip = hippocampus; DG = dentate gyrus. Skala bar: 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
På samme måte ble hdIN-forløpere også transplantert inn i hippocampus av Cntnap2 KO-mus, en modell for autismespektrumforstyrrelse og kortikal dysplasi-fokal epilepsisyndrom. I Cntnap2 KO-musene overlevde hdIN-ene faktisk opptil 9 måneder PT og ble lokalisert på injeksjonsstedet, selv om de også ble spredt over ipsilateral og til og med kontralateral hippocampus som observert i WT-musene (figur 5). Videre var de fleste transplanterte HDIN-ene immunreaktive for internevronmarkører, som forventet fra tidligere resultater in vitro 8,26 og hos voksne gnagere in vivo25.
Figur 5: Podet hdINs i hippocampus av Cntnap2 KO mus ved 9 måneder PT. (A) Immunkjemi mot den cytoplasmatiske humane markøren STEM121 hos celletransplanterte (venstre) og humbug (høyre) mus. (a1 og a2) Forstørrede bilder av STEM121 positive celler. (B) Immunfluorescens for STEM121 (magenta) og internevronmarkørene parvalbumin (PV) og somatostatin (SST). Hvite piler indikerer doble positive celler for STEM121 og den respektive interneuronmarkøren. (C) Ortogonal visning av en podet hdIN-immunreaktiv for STEM121 og PV. Skalalinje: 200 μm (A og B), 100 μm (a1 og a2), 20 μm (liten kvadratforstørrelse i a1 og a2 og C). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Podet hdINs ved 2 måneders PT inn i hippocampus hos nyfødte WT-mus som uttrykker Ascl1. Immunfluorescens mot Ascl1 og den cytoplasmatiske humane markøren STEM121 ved (A) CA3 og (B) DG hos celletransplanterte WT-mus. (a) Forstørret bilde av en STEM121 positiv celle. De hvite pilene indikerer dobbelt positive celler for STEM121 og Ascl1. Skala bar: 100 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2: Post-mitotisk podet hdINs ved 2 måneders PT inn i hippocampus hos nyfødte WT-mus. Immunfluorescens mot den proliferative markøren Ki67 og den cytoplasmatiske humane markøren STEM121 hos (A) naive og (B) celletransplanterte WT-mus. (b) Forstørret bilde av en STEM121 positiv celle. Den gule pilen indikerer en celle positiv for Ki67 og negativ for STEM121. Den hvite pilen indikerer celler som er positive for STEM121 og negative for Ki67. Den hvite stjernen peker ut en lateral ventrikel. Skala bar: 100 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Denne protokollen beskriver en robust, rask, enkel og allment tilgjengelig metode for å generere hdIN-forløpere in vitro og dens bruk som tidlig intervensjonell celleterapi i prekliniske modeller av nevroutviklingsforstyrrelser.
Selv om noen av de karakteristiske fenotypene av nevroutviklingsforstyrrelser oppstår i ungdomsårene eller voksen alder, er patofysiologiske endringer allerede tilstede under tidlig utvikling. Av denne grunn vil tidlig intervensjon være svært berettiget for å oppnå gunstige effekter ved å handle i kritiske hjerneutviklingsperioder før symptomatologi eller klinisk manifestasjon. I fremtiden vil genetisk screening og utvikling av biomarkører gi profylaktisk eller presymptomatisk behandling, noe som representerer en spillveksler for disse pasientene. Derfor ble hdIN-forløpere transplantert tidlig etter fødselen i Cntnap2 KO-musemodellen når epileptogene endringer i nevronnettverket kan være pågående28 og på et tidspunkt hvor cellulære endringer er beskrevet i denne dyremodellen29. Det er imidlertid viktig å vurdere de potensielle fallgruvene ved aldersekstrapolering og tidspunktet for visse prosesser i musen versus den menneskelige hjerne.
Med fokus på selve prosedyren er differensieringsprotokollen som presenteres her basert på bruk av transkripsjonsfaktorer, noe som muliggjør rask og svært effektiv programmering av stamceller sammenlignet med andre protokoller andre steder basert på små molekyler10,30. En potensiell ulempe ved denne tilnærmingen kan være kravet til lentivirale vektorer, noe som medfører risiko for innsettingsmutagenese. To kritiske trinn i protokollen er tilsetning av antibiotika og det anti-mitotiske middel til mediet for å velge for celler som uttrykker transkripsjonsfaktorene og eliminere proliferative celler, og unngår risikoen for teratomdannelse, henholdsvis. Selv om bare hdIN-prekursorer ble testet i denne studien, forventes prosedyren å være gjennomførbar med andre cellekilder og programmerings-/differensieringsprotokoller. Likevel bør andre nevrale subtyper og/eller modeller valideres.
HDIN-forløperens alder for transplantasjon, 7 DIV, ble bestemt basert på (i) fravær av proliferative celler, vurdert ved immunreaktivitet mot Ki67, (ii) sammen med den tidligere rapporterte observasjonen av reduksjoner i ekspresjonen av pluripotensgener som POU5F1 og utseendet til nevronmarkøren MAP2 og internevronmarkøren GAD1 på det tidspunktet8 . Det opprinnelige arbeidet som beskriver denne protokollen utførte imidlertid transplantasjoner ved 14 DIV etter DOX-seponering9. Dette reiser spørsmål om DOX i mors drikkevann kan nå celler podet inn i hjernen til ammende valper via melken, eller om 7 DIV DOX-induksjon er nok til å etablere GABAergic skjebnen. Selv om Yang og medarbeidere identifiserte 14 dager med DOX som tilstrekkelig til å generere stabile nevronceller in vitro9, oppdaget Gonzalez-Ramos et al.8 GAD1-genuttrykk allerede ved 7 DIV, noe som indikerer at nedstrøms aktivering av GAD67 av Ascl1 og Dlx2 allerede har skjedd på dette tidspunktet. Derfor har mønsteret begynt på 7 DIV og kan være mindre avhengig av DOX-behandlingen. Videre indikerer bevis hos gnagere og mennesker tilstedeværelsen av DOX i morsmelk 31,32, og resultatene som presenteres her viser at podede HDIN-er var immunreaktive forAscl1 ved 2 uker og 2 måneder PT- og interneuronmarkører senere ved 9 måneders PT. Innenfor den podede populasjonen, i tillegg til PV- og SST-positive nevroner, ble andre markører for underpopulasjoner av interneuroner også funnet i lavere mengder, som calretinin (CR) og calbindin (CB).
Et utfordrende aspekt ved denne prosedyren er koordineringen av tidspunktene for både differensiering og valpens alder. Vanligvis tar musens drektighet 21 dager etter at parringsburet er satt opp, selv om dette kan variere noen ganger. Dette scenariet oppstår ikke når du utfører celletransplantasjoner hos voksne gnagere når alt kan planlegges nøye og ordnes. Likevel kan dette enkelt reduseres ved å sette opp to til tre parringsbur med 2 dagers intervall eller to til tre differensieringspartier med 2 dagers tidsforløp fra hverandre.
Selv om musene som ble brukt i denne studien verken var immundefekte eller immunsupprimerte, overlevde de transplanterte cellene opptil 9 måneder in vivo, og markører for immunreaksjon mot xenogene celler eller lokal betennelse ble ikke observert ved verken P14 eller 2 måneders PT. Immunavstøtning av podede xenogene celler utløses mot MHC/peptider, og de viktigste cellulære mediatorene for transplantatavstøtning er T-lymfocytter og mikrogliaceller33, 34. Derfor ble immunoreaktivitet mot markører av T-celler, samt reaktiv mikroglia, utforsket. Ingen tegn på immunavvisning av de transplanterte cellene i vertsvevet ble påvist verken ved nivåer av reaktiv mikroglia eller ved tilstedeværelse av T-lymfocytter hos WT-mus ved P14 eller 2 måneder. Videre ble det ikke observert lokal inflammasjon basert på de vurderte nivåene av astrogliose og inflammatoriske cytokiner. Dette utfallet kan delvis være avhengig av neonatal immuntoleranse 35,36,37, observert av andre celleidentiteter, steder og dyremodeller35,38. Englund og medarbeidere identifiserte regionale forskjeller i utfallet av de podede cellene når det gjelder migrasjon og modning, inkludert observasjon av podede celler i tilstøtende hvit substans35.
Til slutt ble det observert en større dispersjon av de podede cellene i hippocampus sammenlignet med andre studier som transplanterte til voksne gnagere, hvor HDIN forble som en podet kjerne25. Denne dispersjonen skilte seg også fra resultater observert tidligere av Yang et al.9, noe som i dette tilfellet kunne forklares av cellens alder ved transplantasjonstidspunktet.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble finansiert av Vetenskapsrådet (Grant Number: 2016-02605, M.A.), Swedish Brain Foundation F02021-0369 (M.A.), Crafoord Foundation (M.A.), og European Union Horizon 2020 Programme (H2020-MSCA-ITN-2016) under Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network-prosjektet Training4CRM No. 722779 (M.K.). Vi er ekstremt takknemlige for hjelpen fra Andrés Miguez, fra Josep Maria Canals 'laboratorium (Laboratory of Stem Cells and Regenerative Medicine, University of Barcelona), for undervisning stereotaksisk celletransplantasjon i P2 nyfødte mus, og Mackenzie Howard, gruppeleder ved University of Texas i Austin, for råd og foreløpige koordinater for celletransplantasjon i hippocampus av P2 nyfødte mus. Vi takker Susanne Geres for å bistå med dyrepleie og Ling Cao for hjelp med behandling av vev, samt studenter som har bidratt på en eller annen måte til studien og spesielt Diana Hatamian. Til slutt ble noe av grafikken som ble brukt til å illustrere dette papiret laget med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G needle | B Braun | 4656300 | |
| 33 G needle for Hamilton syringe | Hamilton | 7762-06 | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell detachment solution use for splitting cells (hESC and hdIN precursors) |
| Adjustable volume pipettes 10, 20, 200, 1000 µL | |||
| Alexa Fluor Plus 488/555/647 | Thermo Fisher | 1:1000 | |
| Anti-CD68 (Rat) | Bio-Rad | MCA1957 | 1:200 |
| Anti-CD8 (Rabbit) | Abcam | 203035 | 1:200 |
| Anti-Galectin 3 (Goat) | R&D systems | AF1197 | 1:500 |
| Anti-GFAP (Guiena Pig) | Synaptic systems | 173004 | 1:500 |
| Anti-Iba1 (Rabbit) | WAKO | 19119741 | 1:500 |
| Anti-IL1 (Goat) | Santa Cruz Biotech | SC-106 | 1:400 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | 1:250 |
| Anti-Ki67 (Rabbit) | Novocastra | NCL-Ki67p | 1:250 |
| Anti-MAP2 (Chicken) | Abcam | ab5392 | 1:2000 |
| Anti-Mash1 (Ascl1) | Abcam | ab74065 | 1:1000 |
| Anti-Parvalbumin (Rabbit) | Swant | PV 27 | 1:5000 |
| Anti-Somatostatin (Rat) | Millipore | MAB354 | 1:150 |
| Anti-STEM121 (Mouse) | Takara Bio | Y40410 | 1:400 |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | VECTOR Laboratories | SP-2001 | |
| B6.129(Cg)-Cntnap2tm1Pele/J | Jackson Laboratory | 17482 | Animal model |
| Biotinylated Horse anti-Mouse | VECTOR Laboratories | BA-2001 | 1:200 |
| Burker Chamber | Thermo Fisher Scientific | 10628431 | |
| C57BL/6J | Janvier Labs | Animal model | |
| Centrifuge | For 15 mL tubes | ||
| Confocal microscope | Nikon | Confocal A1RHD microscope | |
| Costar 6-well Clear TC-treated | Corning | 3516 | |
| Cy3 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | 1:200 |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma | C1768 | 4 µM |
| DAB Substrate Kit, Peroxidase (With Nickel) | VECTOR Laboratories | SK-4100 | |
| Digital Stereotax | KOPF | Model 940 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Use for the N2 medium |
| DNase I Solution | STEMCELL Technologies | 7900 | 1 µg/mL |
| Doxycyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | 2 µg/mL |
| DPBS -/- | Gibco | 14190144 | |
| Epifluorescence microscope | Olympus | BX51 Microscope | |
| Ethanol | Solveco | 70%, 95%, 99.8% | |
| FUW-rTA | Addgene | 20342 | Lentiviral vector |
| FUW-TetO-Ascl1-T2A-puromycin | Addgene | 97329 | Lentiviral vector |
| FUW-TetO-Dlx2-IRES-hygromycin | Addgene | 97330 | Lentiviral vector |
| H1 (WA01) ESC | WiCell | WA01 | Human embryonic stem cell line under a MTA agreement |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | 18304 | |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 7634-01 | 5 µL |
| HBSS | Gibco | 14175095 | No calcium, No magnesium - Transplantation medium |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:1000 |
| Hygromycin B | Gibco (Invitrogen) | 10687010 | |
| Incubator | 5% CO2, 37 °C | ||
| Isoflurane Baxter | Apoteket AB | ||
| Manual cell counter | VWR | 720-1984 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free | Corning | 354277 | For the coating |
| Methanol | Merck Millipore | 1060091000 | |
| Microscope Coverslips 24 x 60 mm | Thermo Scientific | BBAD02400500#A113MNZ#0## | |
| Microscope Slides | VWR | 631-1551 | |
| Microscope Software | Olympus | CellSens | |
| Mounting media | Merck | 10981 | PVA-Dabco |
| Mouse adaptor to stereotax | RWD | 68030 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | Kit Basal Medium and 5X Supplement - Stem cell culture medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | 1M |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Pertex | HistoLab | 811 | |
| Pipet Filler | |||
| Play-Doh | |||
| Puromycin (Dihydrochloride) | Gibco | A1113803 | |
| Round cover glasses thickness No. 1.5H (tol. ± 5 μm) 13 mm Ø | Marienfeld | MARI0117530 | For immunocytochemistry |
| Serum | Thermo Fisher | Goat, Donkey, Horse | |
| Sterile pipette tips | For volumes 0.1-1000 µL | ||
| Sterile serological pipettes | 5, 10, 25 mL | ||
| Sterile water Braun | B Braun | 3626873 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | For 0.5% Sucrose solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Tubes | Sarstedt | 15 ml, Eppendorf 1.5 mL | |
| Tweezer | VWR | ||
| Ultra pure water | MilliQ Water System | ||
| Xylene | VWR | 28973.363 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 µM |
References
- Kostović, I., Jovanov-Milošević, N. The development of cerebral connections during the first 20-45 weeks' gestation. Seminars in Fetal and Neonatal. 11 (6), 415-422 (2006).
- Innocenti, G. M., Price, D. J. Exuberance in the development of cortical networks. Nature Reviews Neuroscience. 6 (12), 955-965 (2005).
- Tang, X., Jaenisch, R., Sur, M. The role of GABAergic signalling in neurodevelopmental disorders. Nature Reviews Neuroscience. 22 (5), 290-307 (2021).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: Comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31 (3-5), 299-316 (2002).
- Radonjić, N. V., et al. Diversity of cortical interneurons in primates: The role of the dorsal proliferative niche. Cell Reports. 9 (6), 2139-2151 (2014).
- Turner, D. A., Shetty, A. K. Clinical prospects for neural grafting therapy for hippocampal lesions and epilepsy. Neurosurgery. 52 (3), 632-644 (2003).
- Gonzalez-Ramos, A., et al. Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks. Scientific Reports. 11, 22050 (2021).
- Yang, N., et al. Generation of pure GABAergic neurons by transcription factor programming. Nature Methods. 14 (6), 621-628 (2017).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
- Yuan, F., et al. Induction of human somatostatin and parvalbumin neurons by expressing a single transcription factor LIM homeobox 6. eLife. 7, 37382 (2018).
- Fandel, T. M., et al. Transplanted human stem cell-derived interneuron precursors mitigate mouse bladder dysfunction and central neuropathic pain after spinal cord injury. Cell Stem Cell. 19 (4), 544-557 (2016).
- Noakes, Z., et al. Human pluripotent stem cell-derived striatal interneurons: Differentiation and maturation in vitro and in the rat brain. Stem Cell Reports. 12 (2), 191-200 (2019).
- Parikshak, N. N., Gandal, M. J., Geschwind, D. H. Systems biology and gene networks in neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. Nature Reviews Genetics. 16 (8), 441-458 (2015).
- Marín, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).
- Sloan, D. J., Wood, M. J., Charlton, H. M. The immune response to intracerebral neural grafts. Trends in Neurosciences. 14 (8), 341-346 (1991).
- Diehl, R., et al. Immunosuppression for in vivo research: State-of-the-art protocols and experimental approaches. Cellular & Molecular Immunology. 14 (2), 146-179 (2017).
- Osman, M. M., et al. Cyclosporine-A as a neuroprotective agent against stroke: Its translation from laboratory research to clinical application. Neuropeptides. 45 (6), 359-368 (2011).
- Quinnies, K. M., Cox, K. H., Rissman, E. F. Immune deficiency influences juvenile social behavior and maternal behavior. Behavioral Neuroscience. 129 (3), 331-338 (2015).
- Fernandes, D. J., et al. Mouse models of immune dysfunction: their neuroanatomical differences reflect their anxiety-behavioural phenotype. Molecular Psychiatry. 27 (7), 3047-3055 (2022).
- Lund, R. D., Rao, K., Hankin, M. H., Kunz, H. W., Gill, T. J. Transplantation of retina and visual cortex to rat brains of different ages. Maturation, connection patterns, and immunological consequences. Annals of the New York Academy of Sciences. 495, 227-241 (1987).
- Olsson, M., Bentlage, C., Wictorin, K., Campbell, K., Björklund, A. Extensive migration and target innervation by striatal precursors after grafting into the neonatal striatum. Neuroscience. 79 (1), 57-78 (1997).
- Mattis, V. B., et al. Neonatal immune-tolerance in mice does not prevent xenograft rejection. Experimental Neurology. 254, 90-98 (2014).
- Nato, G., et al. Immune-tolerance to human iPS-derived neural progenitors xenografted into the immature cerebellum is overridden by species-specific differences in differentiation timing. Scientific Reports. 11, 651 (2021).
- Allison, T., et al. Defining the nature of human pluripotent stem cell-derived interneurons via single-cell analysis. Stem Cell Reports. 16 (10), 2548-2564 (2021).
- Waloschková, E., et al. Human stem cell-derived GABAergic interneurons establish efferent synapses onto host neurons in rat epileptic hippocampus and inhibit spontaneous recurrent seizures. International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13243 (2021).
- Gonzalez Ramos, A. Enhancing neuronal inhibition by cell and gene therapy as a novel treatment for epilepsy. , Lund University, Faculty of Medicine. PhD thesis (2022).
- Paterno, R., et al. Hippocampal gamma and sharp-wave ripple oscillations are altered in a Cntnap2 mouse model of autism spectrum disorder. Cell Reports. 37 (6), 109970 (2021).
- Penagarikano, O., et al. Absence of CNTNAP2 leads to epilepsy, neuronal migration abnormalities, and core autism-related deficits. Cell. 147 (1), 235-246 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Angeletti, B., et al. An in vivo doxycycline-controlled expression system for functional studies of the retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (2), 755-760 (2003).
- Doxycycline. Drugs and Lactation Database (LactMed). , National Library of Medicine. Bethesda, MD. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK500561 (2021).
- Barker, R. A., Widner, H. Immune problems in central nervous system cell therapy. NeuroRX. 1 (4), 472-481 (2004).
- Hoornaert, C. J., et al. Concise review: Innate and adaptive immune recognition of allogeneic and xenogeneic cell transplants in the central nervous system. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1434-1441 (2017).
- Englund, U., Fricker-Gates, R. A., Lundberg, C., Bjorklund, A., Wictorin, K. Transplantation of human neural progenitor cells into the neonatal rat brain: Extensive migration and differentiation with long-distance axonal projections. Experimental Neurology. 173 (1), 1-21 (2002).
- Fainstein, N., Ben-Hur, T. Brain region-dependent rejection of neural precursor cell transplants. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 136 (2018).
- Denham, M., et al. Neurons derived from human embryonic stem cells extend long-distance axonal projections through growth along host white matter tracts after intra-cerebral transplantation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, 11 (2012).
- Miguez, A., et al. In vivo progressive degeneration of Huntington's disease patient-derived neurons reveals human-specific pathological phenotypes. bioRxiv. , (2022).
