Summary
Transplantation av humana pluripotenta stamcellsderiverade GABAergiska nervceller som genereras av neuronal programmering kan vara en potentiell behandlingsmetod för neurodevelopmental störningar. Detta protokoll beskriver generering och transplantation av humana stamcells-härledda GABAergiska neuronala prekursorer i hjärnan hos neonatala mus, vilket möjliggör långsiktig undersökning av ympade neuroner och utvärdering av deras terapeutiska potential.
Abstract
Ett minskat antal eller dysfunktion av hämmande interneuroner är en vanlig bidragsgivare till neurodevelopmental störningar. Därför är cellterapi med interneuroner för att ersätta eller mildra effekterna av förändrade neuronala kretsar en attraktiv terapeutisk väg. För detta ändamål behövs mer kunskap om hur mänskliga stamcells-härledda GABAergic interneuron-liknande celler (hdINs) mognar, integreras och fungerar över tid i värdkretsarna. Av särskild betydelse vid utvecklingsneurologiska störningar är en bättre förståelse för om dessa processer i transplanterade celler påverkas av en utvecklande och mognande värdhjärna. Detta protokoll beskriver en snabb och mycket effektiv generering av hdIN från mänskliga embryonala stamceller baserat på det transgena uttrycket av transkriptionsfaktorerna Ascl1 och Dlx2. Dessa neuronala prekursorer transplanteras ensidigt, efter 7 dagar in vitro, till hippocampus hos neonatala 2 dagar gamla möss. De transplanterade neuronerna sprids i ipsi- och kontralateral hippocampus av en musmodell av kortikal dysplasi-fokal epilepsi syndrom och överlever i upp till 9 månader efter transplantation. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att undersöka den cellulära identiteten, integrationen, funktionaliteten och terapeutiska potentialen hos transplanterade interneuroner under en längre tid för att utveckla friska och sjuka hjärnor.
Introduction
Etablering, mognad och förfining av neuronala nätverk sker under den perinatala och tidiga postnatala perioden och represe en avgörande tidsfönster för hjärnans utveckling1. Från ett överflöd av anslutning efter födseln utvecklas hjärnan till en finjustering av anslutningar som sträcker sig fram till tonåren2. Följaktligen definierar förändringar i gener som uttrycks under dessa perioder, såväl som yttre faktorer eller förolämpningar, en individs predisposition för flera neurodevelopmental störningar. Försämringar i kognition och motorisk funktion utvecklas över tid, och farmakologiska behandlingar är begränsade, majoriteten inriktade på symtom med risk för allvarliga biverkningar.
Dysfunktion i gamma-aminosmörsyra (GABA)erg hämning har visat sig vara en viktig bidragsgivare till den bakomliggande orsaken till olika neurodevelopmental störningar3, såsom bräckligt X-syndrom, Angelmans syndrom, epilepsi, schizofreni och autism. GABA är den viktigaste hämmande sändaren av centrala nervsystemet och är avgörande för att upprätthålla excitatorisk / hämmande (E / I) balans, synkronisering av neuronal avfyrning och beräkning. GABAerga interneuroner är en heterogen population av neuroner, med ökande funktionell inveckling i mer komplexa hjärnregioner4 och med evolution 5,6. Med tanke på den begränsade endogena regenerativa kapaciteten hos den mänskliga hjärnan och implikationen av interneuron dysfunktion vid flera neurologiska störningar kan transplantationen av GABAergic interneuroner vara en lovande terapeutisk väg att utforska. Längs denna linje verkar mänskliga stamcells-härledda GABAergic interneuron-liknande celler (hdINs) vara den mest translationella och livskraftiga källan för detta ändamål jämfört med gnagare allogena neuronala prekursorer eller andra källor som används någon annanstans7. Protokoll för att generera GABAergiska nervceller från olika cellkällor finns tillgängliga 8,9,10,11,12,13, men mer kunskap krävs om hur hdINs mognar, integreras och fungerar över tid i en utvecklande patologisk hjärna. Flera studier har identifierat förändringar i gener som är aktiva under kortikal mönstring, etablerar neuronal anslutning14 och ställer in fysiologisk E / I-balans15. Neonatal transplantation av hdIN i musmodeller med motsvarande genetiska störningar gör att vi kan följa samspelet mellan värd och transplantat, vilket är kunskap som är nödvändig för att bestämma potentiella terapeutiska strategier.
Immunmodulering används ofta och framgångsrikt vid xenografttransplantationer för att undvika att utlösa ett värdimmunsvar och avstötning16. Administreringen av immunsuppressiva läkemedel, såsom cyklosporin A, orsakar emellertid njurtoxicitet efter kronisk administrering, är arbetsintensiv på grund av behovet av dagliga intraperitoneala injektioner för att uppnå stabila systemiska koncentrationer, vilket orsakar djurstress17 och har off-target effekter som kan interagera med patologi18. Dessutom har kompromettering av immunsystemet visat sig förändra beteendefenotyper19, med förändringar i motsvarande neuroanatomiska regioner20. Transplantation under den första veckan i livet har visat sig möjliggöra anpassning till transplanterade celler 21,22, medan andra har rapporterat initial överlevnad följt av avstötning av transplantaten inom den första postnatala månaden 23,24.
Detta protokoll beskriver procedurer från hdIN-generering till celltransplantation hos neonatala möss som resulterar i långsiktig transplantatöverlevnad och möjliggör undersökning av neuronal specificitet, synaptisk integration, funktion och terapeutisk potential hos transplanterade mänskliga interneuroner under fysiologisk och patologisk utveckling.
Protocol
Alla försöksförfaranden godkändes av Malmö/Lunds djurförsöksetiska nämnd, etiskt tillstånd nummer 12548-19, och genomfördes i enlighet med Djurskyddsmyndighetens föreskrifter och EU-direktivet 2010/63/EU för djurförsök. C57BL6/J och Contactin-associerade proteinliknande 2 (Cntnap2) knock-out (KO) möss, både hanar och honor, användes vid postnatal dag (P) 2 för den aktuella studien. Mänskliga embryonala stamceller (hESC) användes. Djuren och stamcellerna erhölls från kommersiella källor (se materialförteckningen).
1. Generering av hdIN-prekursorer
OBS: Alla steg i det här avsnittet görs i en cellodlingshuv. HESC: erna upprätthölls som matarfria celler på belagda plattor med hjälp av ett stamcellsodlingsmedium och passerade som kolonier.
- Utföra framåtprogrammering av hESC till hdIN-prekursorer (figur 1).
OBS: Den framåtriktade programmeringsmetoden är baserad på det förfarande som beskrivs i Gonzalez-Ramos et al.8 och Yang et al.9.- Transducera hESC med lentivirala vektorer som innehåller Tet-On-systemet i ett färskt stamcellsodlingsmedium innehållande 10 μM ROCK-hämmare (RI) (se materialförteckning). Förvaras vid 37 °C i kuvösen.
- Byt medium till ett nytt stamcellsodlingsmedium 16 timmar efter transduktion och behåll de transducerade cellerna på samma sätt som de icke-transducerade hESC: erna.
- När hESC:erna är sammanflytande ska de avlägsnas som enskilda celler med hjälp av en cellavskiljningslösning (se materialförteckningen) och plåtas i belagda 6-brunnsplattor med en densitet av 3 x 105 celler/brunn i stamcellsodlingsmedium som innehåller 10 μM RI på dagen in vitro (DIV) −1.
- Vid 1 DIV, ersätt odlingsmediet med N2-medium som innehåller 2 g / L doxycyklin (DOX, se materialtabell).
OBS: DOX används för att inducera transgenuttryck av Ascl1 och Dlx29, från 1 DIV till 7 DIV, och fortsätter sedan in vivo genom tillsats till dricksvattnet25. - Vid 2 DIV börjar en urvalsperiod för antibiotikaresistens som varar fram till 5 DIV. Tillsätt puromycin (puro) och hygromycin (hygro) till det färska mediet (se materialförteckning). Ändra medium på 2 DIV, 4 DIV och 5 DIV.
OBS: Optimera koncentrationerna av puro och hygro före differentieringsprotokollet med hjälp av transducerade och icke-transducerade hESC för att säkerställa överlevnaden för endast cellerna som bär antibiotikaresistenskassetterna. I detta protokoll användes 0,5 μg/ml puro och 750 μg/ml hygro. - Vid 5 DIV avslutas antibiotikavalsperioden. Byt till N2-medium kompletterat med 2 g/L DOX och 4 μM cytosin β-D-arabinofuranosid (Ara-C, se Materialförteckning).
Figur 1: Generering av hdIN-prekursorer från hESC genom att överuttrycka Ascl1 och Dlx2. (A) Scheman för det differentieringsprotokoll som används för generering av hdIN-prekursorer. (B–E) Immunocytokemi för hdIN-prekursorer vid 7 DIV för (B) neuronmarkören MAP2, (C) den proliferativa markören Ki67, (D) allmän kärnfärgning och (E) en sammanslagning av de tidigare markörerna. Skalstreck: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. Beredning av encellssuspensionen för transplantation
OBS: Alla steg i det här avsnittet görs i cellodlingshuven. På 7 DIV dissocieras hdIN-prekursorer och används för transplantation.
- Utför avlägsnande av cellerna enligt stegen nedan.
- Ta bort mediet och skölj försiktigt cellerna med DPBS utan kalcium och magnesium.
- Tillsätt 400 μl av cellavskiljningslösningen (se materialtabell) till varje brunn på 6-brunnsplattan.
OBS: Se till att hela ytan täcks av lösningen. - Inkubera i 2-3 minuter vid 37 °C i inkubatorn tills cellernas kant börjar se blank ut, vilket indikerar enzymatisk nedbrytning av cellytproteiner och lossning från brunnsytan.
OBS: För att öka cellöverlevnaden, vänta inte för länge när alla celler är helt lossnade och flyter runt. - Tillsätt sedan 600 μL färskt N2-medium till varje brunn på 6-brunnsplattan för att stoppa enzymet, och mekaniskt med pipetten hjälper du till att lossa cellerna för att erhålla en encellssuspension.
- Överför cellsuspensionen till ett plaströr (15 ml) och centrifugera vid 180 x g i 4 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Utför resuspension av cellerna.
- Kassera supernatanten med ett vakuumsystem (försiktigt, utan att störa pelleten) och återsuspendera pelleten i transplantationsmediet som innehåller 10 μM RI, 1 μg/ml DNas och 2 μg/μL DOX.
- Räkna det totala antalet celler i suspensionen med hjälp av en räknekammare och en manuell cellräknare och justera volymen till en slutlig koncentration på 100 000 celler/μl.
- Håll cellsuspensionen i ett slutet rör på is tills transplantationen i högst 4 timmar.
OBS: Transplantationen måste utföras samma dag som beredningen av cellsuspensionen (7 DIV).
3. Intrahippocampal celltransplantation
OBS: Alla steg i detta avsnitt utförs utanför cellodlingshuven i djuranläggningen. Tidig postnatal transplantation av celler i hjärnan utfördes på P2, med tanke på P0 födelsedagen.
- Förbered dig för transplantationsexperimentet enligt stegen nedan.
- Autoklavera allt kirurgiskt material eller, om det inte är möjligt, sterilisera med en annan godkänd metod.
- Montera injektionssprutan i hållaren utan någon glaskapillär. Skölj nålen med vatten.
OBS: Nålen måste vara 33 G. - Kurva 90° spetsen på en 30 G insulinnål.
- Skapa en hemmagjord Play-Doh-liknande scen för att placera valpen med huvudet platt (figur 2A).
- Hämta mössburen med mamman och valparna innan du förbereder något för operationen så att de kan acklimatisera sig till den nya miljön.
- Förbered en bricka med våt is och en tom bur med lite papper för isofluranen.
- Bedöva musvalpen.
- Blötlägg ett papper med isofluran (se Materialtabell) och placera det i den tomma buren. Ta försiktigt en valp och placera den i buret med papperet blött i isofluran.
OBS: Lämna aldrig mindre än tre valpar hos mamman. Överskrid inte 20-30 s isoflurananestesi, annars kan valpen dö. - Kontrollera effekten av anestesin genom att rörelsen upphör.
- Omedelbart efter anestesi, placera valpen på en våt vävnad på ytan av våt is. Håll djuret på is i 3 minuter tills de övre extremiteterna blir vitaktiga (figur 2B, blå pil). Detta tar vanligtvis 2-3 min.
- Använd den här tiden för att ladda sprutan med cellsuspensionen. Återsuspendera cellerna försiktigt med en pipett innan.
- Placera valpen på den stereotaxiska ramen. Använd öronstängerna i motsatt riktning (figur 2A, magentapilar).
OBS: Baksidan av öronstängerna är mindre spetsig, och eftersom P2-valpar inte har öron, använd den plattare sidan för att undvika att skada djuret. - Från sidan, kontrollera om huvudet är rakt. Huvudet måste vara platt; använd den Play-Doh-liknande scenen för att justera för det.
OBS: Valpar i denna ålder har ännu inte öppnat ögonen, så inget ytterligare steg i detta avseende behöver göras. Valpar har inte päls i denna ålder, så ingen rakning av området krävs. Ingen specifik smärtbehandling ges eftersom det inte är ett öppet snitt mot huden, och ingen suturering är inblandad. - Håll valpen täckt på is (ovanpå silkespapper) under hela operationen.
OBS: Placera inte isen i direkt kontakt med valpens hud.
- Blötlägg ett papper med isofluran (se Materialtabell) och placera det i den tomma buren. Ta försiktigt en valp och placera den i buret med papperet blött i isofluran.
- Utför injektionen.
- Rengör ytan på huden med en mjukvävnad som blötläggs i etanol.
- Identifiera lambda och ställ in koordinaterna till noll på stereotaxicinstrumentets digitala bildskärmskonsol (bild 2C, gul streckad linje). Sagittala och lambdoid suturer är lätt synliga i ögat, eftersom de är vaskulariserade, som röda linjer.
OBS: Om du har svårt att visualisera lambda, placera en liten isbit på huden och vänta ett par minuter tills den har svalnat. Ta sedan bort isbiten, och den subtila blekningen av huden gör att du kan visualisera. - Flytta injektionsnålen till önskade koordinater. I det beskrivna protokollet var den riktade regionen hippocampus, och koordinaterna var följande: främre-bakre (AP) +0,85 och medio-lateral (ML) +1,35.
- Använd en 90 ° böjd insulinnål för att tränga in i skallen och skapa ett litet hål.
- Ta ner injektionsnålen tills den har passerat skallen och nollställ dorso-ventrala (DV) koordinater. Sänk nålen tills önskade DV-koordinater. I det beskrivna protokollet var koordinaterna DV −1,1.
- Injicera enligt de förutbestämda tidsintervallen.
OBS: I det beskrivna protokollet var de exakta tidpunkterna följande: (i) efter att ha gått ner till DV-koordinaten, vänta 3 min, (ii) injicera 1 μL volym i 5 min och (iii) efter att all volym har injicerats, vänta 3 min. - Dra tillbaka nålen långsamt.
- Avsluta proceduren.
OBS: Operationen kan inte pågå mer än 15 minuter för att säkerställa valpens överlevnad och undvika skador som härrör från anestesi genom hypotermi.- Värm upp valpen med händerna tills den börjar röra sig innan du ger den tillbaka till mamman.
- Ge DOX i en koncentration av 1 mg/ml i 0,5 % sackaroslösning som dricksvatten i minst 2 dagar före och 3 veckor efter transplantation (PT) för att fortsätta celldifferentieringen in vivo.
Figur 2: Stereotaxisk transplantation hos nyfödda mössungar vid P2. (A) Ett Play-Doh-liknande stadium för att hålla valpens kropp på plats och inverterade öronstänger (magentapilar). (B) Vit främre tass (blå pil) som indikerar det minskade blodflödet i det området så att valpen upplever anestesi genom hypotermi. (C) Översikt över installationen med valpen redan täckt av is över mjukpapperet. (c#) Stängd zoom av valpens huvud, med injektionsnålen redan införd i hjärnan (gul streckad linje som indikerar lambda- och lambdoidsuturer). Denna siffra är anpassad från Gonzalez Ramos et al. 27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Representative Results
Enligt det protokoll som presenteras här och illustreras i figur 1A var hdIN-prekursorer ännu inte proliferativa vid 7 DIV enligt definitionen av (i) negativ immunreaktivitet för cellcykelmarkören Ki67 och (ii) uttrycker neuronala markörer såsom mikrotubuliassocierat protein 2 (MAP2) (Figur 1B-E). Denna karakterisering utfördes på kvarvarande celler replated i 24 timmar efter att ha genomgått alla procedursteg. Dessutom indikerade genuttrycksanalysen som tidigare publicerats att en snabb övergång från det pluripotenta tillståndet till en neuronal fenotyp sker runt 4 DIV och 7 DIV8. Sammantaget bekräftade dessa resultat närvaron av postmitotiska celler och frånvaron av risk för teratombildning.
Därefter testades hdIN-prekursorernas överlevnad efter tidig postnatal transplantation i hippocampus hos vildtypsmöss (WT) genom immunhistokemi mot den humana cytoplasmatiska markören STEM121. HDIN-prekursorerna transplanterades till höger dorsal hippocampus hos naiva immunkompetenta möss vid P2, som sedan offrades vid P14 och 2 månader PT. Ympade celler hittades över hela dorsala hippocampus, samt dispergerades genom corpus callosum och contralateral hippocampus, vid båda tidpunkterna. Vid båda tidpunkterna uttryckte dessutom ympade hdINs Ascl1, en av induktionstranskriptionsfaktorerna (kompletterande figur 1), och var inte proliferativa, vilket indikeras av frånvaron av Ki67-uttryck (kompletterande figur 2).
Viktigt är att ingen immunreaktion eller lokal inflammation mot de transplanterade cellerna hittades varken vid P14 eller 2 månaders PT, bedömt av frånvaron av reaktiv mikroglia identifierad med Iba1, CD68 och galektin-3 (Gal3) (Figur 3), omfattningen av astroglios bestämd av glialfibrillärt surt protein (GFAP) och inflammatoriska cytokiner såsom interleukin-1 (IL-1), och frånvaron av cytotoxiska T-lymfocyter (CD8) (figur 4).
Figur 3: hdIN vid P14 och 2 månader PT in i hippocampus hos nyfödda WT-möss utan att utlösa immunavstötning från värdvävnaden. Immunofluorescens för Iba1-, CD68- och Gal3-markörer i hjärnvävnad från (A-D) närheten till ett ischemiskt kärnområde i en elektrokoaguleringsslagmusmodell (positiv kontroll, Ctrl +), (E-H) negativa kontrolldjur (Ctrl-) vid 2 månader och (M-P) P14, och (I-L) djur som har genomgått celltransplantation vid 2 månader och (Q-T ) P14. De vita pilarna indikerar några exempel på blodkärl som är synliga vid alla kanaler på grund av autofluorescens. Förkortningar: Ctx = cortex; Höft = hippocampus; DG = dentate gyrus; CA1 = cornu ammonis 1. Skalstreck: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: hdINs vid 2 månader PT in i hippocampus hos nyfödda WT-möss utan att utlösa immunavstötning från värdvävnaden. Immunofluorescens för IL1-, GFAP- och CD8-markörer i hjärnvävnad från (A-D) närheten till ett ischemiskt kärnområde i en elektrokoaguleringsmusmodell (positiv kontroll, Ctrl +), (E-H) negativa kontrolldjur (Ctrl-) vid 2 månader och (I-L) djur som har genomgått celltransplantation vid 2 månader. Förkortningar: Ctx = cortex; Höft = hippocampus; DG = dentate gyrus. Skalstreck: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
På samma sätt transplanterades också hdIN-prekursorer i hippocampus hos Cntnap2 KO-möss, en modell för autismspektrumstörning och kortikal dysplasi-fokal epilepsisyndrom. I Cntnap2 KO-mössen överlevde faktiskt hdINs upp till 9 månader PT och lokaliserades på injektionsstället, även om de också spriddes över ipsilateral och till och med kontralateral hippocampus som observerats hos WT-mössen (Figur 5). Dessutom var de flesta av de ympade hdINs immunoreaktiva för interneuronmarkörer, vilket förväntas från tidigare resultat in vitro 8,26 och hos vuxna gnagare in vivo25.
Figur 5: Ympade hdINs i hippocampus hos Cntnap2 KO-möss vid 9 månader PT. (A) Immunkemi mot den cytoplasmatiska humana markören STEM121 hos celltransplanterade (vänster) och skenmöss (höger). (a1 och a2) Förstorade bilder av STEM121-positiva celler. B) Immunofluorescens för STEM121 (magenta) och interneuronmarkörerna parvalbumin (PV) och somatostatin (SST). Vita pilar indikerar dubbla positiva celler för STEM121 och respektive interneuronmarkör. (C) Ortogonal vy av en ympad hdIN-immunoreaktiv för STEM121 och PV. Skalstång: 200 μm (A och B), 100 μm (a1 och a2), 20 μm (liten kvadratförstoring i a1 och a2 och C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Ympade hdINs vid 2 månader PT i hippocampus hos nyfödda WT-möss som uttrycker Ascl1. Immunofluorescens mot Ascl1 och den cytoplasmatiska humana markören STEM121 vid (A) CA3 och (B) DG hos celltransplanterade WT-möss. a) Förstorad bild av en STEM121-positiv cell. De vita pilarna indikerar dubbelpositiva celler för STEM121 och Ascl1. Skalstreck: 100 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Post-mitotiska ympade hdINs vid 2 månader PT i hippocampus hos nyfödda WT-möss. Immunofluorescens mot den proliferativa markören Ki67 och den cytoplasmatiska humana markören STEM121 hos (A) naiva och (B) celltransplanterade WT-möss. (b) Förstorad bild av en STEM121-positiv cell. Den gula pilen indikerar en cell som är positiv för Ki67 och negativ för STEM121. Den vita pilen indikerar celler som är positiva för STEM121 och negativa för Ki67. Den vita asterisken pekar ut en lateral ventrikel. Skalstreck: 100 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Detta protokoll beskriver en robust, snabb, enkel och allmänt tillgänglig metod för att generera hdIN-prekursorer in vitro och dess användning som tidig interventionell cellterapi i prekliniska modeller av neurodevelopmental disorders.
Även om några av de karakteristiska fenotyperna av neurodevelopmental störningar uppstår under tonåren eller vuxenlivet, är patofysiologiska förändringar redan närvarande under tidig utveckling. Av denna anledning skulle tidigt ingripande vara mycket motiverat för att uppnå positiva effekter genom att agera i kritiska hjärnutvecklingsperioder före symptomatologi eller klinisk manifestation. I framtiden kommer genetisk screening och utveckling av biomarkörer att ge profylaktisk eller pre-symptomatisk behandling, vilket representerar en spelväxlare för dessa patienter. Därför transplanterades hdIN-prekursorer tidigt efter födseln i Cntnap2 KO-musmodellen när epileptogena förändringar i det neuronala nätverket kan vara pågående28 och vid en tidpunkt då cellförändringar har beskrivits i denna djurmodell29. Det är dock viktigt att överväga de potentiella fallgroparna med åldersextrapolering och tidpunkten för vissa processer i musen kontra den mänskliga hjärnan.
Med fokus på själva proceduren är differentieringsprotokollet som presenteras här baserat på användningen av transkriptionsfaktorer, vilket möjliggör snabb och mycket effektiv programmering av stamceller jämfört med andra protokoll någon annanstans baserat på små molekyler10,30. En potentiell nackdel med detta tillvägagångssätt kan vara kravet på lentivirala vektorer, vilket medför en risk för införande av mutagenes. Två kritiska steg i protokollet är tillsatsen av antibiotika och det anti-mitotiska medlet till mediet för att välja för celler som uttrycker transkriptionsfaktorerna och eliminera proliferativa celler, vilket undviker risken för teratbildning. Även om endast hdIN-prekursorer testades i denna studie förväntas proceduren vara genomförbar med andra cellkällor och programmerings-/differentieringsprotokoll. Icke desto mindre bör andra neuronala subtyper och/eller modeller valideras.
HDIN-prekursorns ålder för transplantation, 7 DIV, bestämdes baserat på (i) frånvaron av proliferativa celler, bedömd genom immunreaktivitet mot Ki67, (ii) tillsammans med den tidigare rapporterade observationen av minskningar i uttrycket av pluripotensgener såsom POU5F1 och utseendet på neuronmarkören MAP2 och interneuronmarkören GAD1 vid den tidpunkten8 . Det ursprungliga arbetet som beskriver detta protokoll utförde dock transplantationer vid 14 DIV efter DOX-uttag9. Detta väcker frågor om huruvida DOX i moderns dricksvatten kan nå celler ympade i hjärnan hos ammande valpar via mjölken, eller om 7 DIV av DOX-induktion räcker för att fastställa det GABAergiska ödet. identifierade 14 dagars DOX som tillräckligt för att generera stabila neuronala celler in vitro9, Gonzalez-Ramos et al.8 upptäckte GAD1-genuttryck redan vid 7 DIV, vilket indikerar att nedströms aktivering av GAD67 av Ascl1 och Dlx2 redan har inträffat vid denna tidpunkt. Därför har mönstring börjat vid 7 DIV och kan vara mindre beroende av DOX-behandlingen. Dessutom indikerar bevis hos gnagare och människor närvaron av DOX i bröstmjölk 31,32, och resultaten som presenteras här visar att ympade hdINs var immunreaktiva förAscl1 vid 2 veckor och 2 månader PT och interneuronmarkörer senare vid 9 månader PT. Inom den ympade populationen, förutom PV- och SST-positiva neuroner, hittades också andra markörer för subpopulationer av interneuroner i lägre mängder, såsom calretinin (CR) och calbindin (CB).
En utmanande aspekt av detta förfarande är samordningen av tidpunkterna för både differentiering och valparnas ålder. Vanligtvis tar musdräktigheten 21 dagar efter att parningsburet har ställts in, även om det kan variera ibland. Detta scenario inträffar inte vid celltransplantationer hos vuxna gnagare när allt kan planeras och ordnas noggrant. Ändå kan detta enkelt mildras genom att sätta upp två till tre parningsburar med ett 2-dagarsintervall eller två till tre differentieringssatser med en 2-dagars tidsfördröjning från varandra.
Även om mössen som användes i denna studie varken var immunbrist eller immunsupprimerade, överlevde de transplanterade cellerna upp till 9 månader in vivo, och markörer för immunreaktion mot xenogena celler eller lokal inflammation observerades inte vid varken P14 eller 2 månader PT. Immunavstötning av ympade xenogena celler utlöses mot MHC / peptider, och de viktigaste cellulära mediatorerna för transplantatavstötning är T-lymfocyter och mikrogliaceller33, 34. Därför undersöktes immunreaktivitet mot markörer av T-celler, såväl som reaktiva mikroglia. Inga tecken på immunavstötning av de ympade cellerna i värdvävnaden detekterades varken genom nivåer av reaktiv mikroglia eller genom närvaron av T-lymfocyter hos WT-möss vid P14 eller 2 månader. Dessutom observerades ingen lokal inflammation baserat på de bedömda nivåerna av astroglios och inflammatoriska cytokiner. Detta resultat kan delvis vara beroende av neonatal immuntolerans 35,36,37, observerad av andra cellidentiteter, platser och djurmodeller35,38. identifierade regionala skillnader i resultatet av de ympade cellerna när det gäller migration och mognad, inklusive observation av ympade celler i den intilliggande vita substansen35.
Slutligen observerades en större spridning av de ympade cellerna i hippocampus jämfört med andra studier som transplanterades till vuxna gnagare, där hdINs förblev som en ympad kärna25. Denna dispersion skilde sig också från resultat som tidigare observerats av Yang et al.9, vilket i detta fall kan förklaras av cellernas ålder vid transplantationstillfället.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta projekt finansierades av Vetenskapsrådet (Anslagsnummer: 2016-02605, M.A.), Hjärnfonden F02021-0369 (M.A.), Crafoordska stiftelsen (M.A.) och Europeiska unionens Horizon 2020-program (H2020-MSCA-ITN-2016) inom ramen för Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network-projektet Training4CRM No. 722779 (M.K.). Vi är oerhört tacksamma för hjälpen från Andrés Miguez, från Josep Maria Canals laboratorium (Laboratory of Stem Cells and Regenerative Medicine, University of Barcelona), för undervisning i stereotaxisk celltransplantation i P2 nyfödda möss, och Mackenzie Howard, gruppledare vid University of Texas i Austin, för råd och preliminära koordinater för celltransplantation i hippocampus av P2 nyfödda möss. Vi tackar Susanne Geres för att hon hjälpt till med djuromsorg och Ling Cao för hjälpen med att bearbeta vävnad, samt studenter som på ett eller annat sätt bidragit till studien och specifikt Diana Hatamian. Slutligen skapades en del av grafiken som används för att illustrera detta papper med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G needle | B Braun | 4656300 | |
| 33 G needle for Hamilton syringe | Hamilton | 7762-06 | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell detachment solution use for splitting cells (hESC and hdIN precursors) |
| Adjustable volume pipettes 10, 20, 200, 1000 µL | |||
| Alexa Fluor Plus 488/555/647 | Thermo Fisher | 1:1000 | |
| Anti-CD68 (Rat) | Bio-Rad | MCA1957 | 1:200 |
| Anti-CD8 (Rabbit) | Abcam | 203035 | 1:200 |
| Anti-Galectin 3 (Goat) | R&D systems | AF1197 | 1:500 |
| Anti-GFAP (Guiena Pig) | Synaptic systems | 173004 | 1:500 |
| Anti-Iba1 (Rabbit) | WAKO | 19119741 | 1:500 |
| Anti-IL1 (Goat) | Santa Cruz Biotech | SC-106 | 1:400 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | 1:250 |
| Anti-Ki67 (Rabbit) | Novocastra | NCL-Ki67p | 1:250 |
| Anti-MAP2 (Chicken) | Abcam | ab5392 | 1:2000 |
| Anti-Mash1 (Ascl1) | Abcam | ab74065 | 1:1000 |
| Anti-Parvalbumin (Rabbit) | Swant | PV 27 | 1:5000 |
| Anti-Somatostatin (Rat) | Millipore | MAB354 | 1:150 |
| Anti-STEM121 (Mouse) | Takara Bio | Y40410 | 1:400 |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | VECTOR Laboratories | SP-2001 | |
| B6.129(Cg)-Cntnap2tm1Pele/J | Jackson Laboratory | 17482 | Animal model |
| Biotinylated Horse anti-Mouse | VECTOR Laboratories | BA-2001 | 1:200 |
| Burker Chamber | Thermo Fisher Scientific | 10628431 | |
| C57BL/6J | Janvier Labs | Animal model | |
| Centrifuge | For 15 mL tubes | ||
| Confocal microscope | Nikon | Confocal A1RHD microscope | |
| Costar 6-well Clear TC-treated | Corning | 3516 | |
| Cy3 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | 1:200 |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma | C1768 | 4 µM |
| DAB Substrate Kit, Peroxidase (With Nickel) | VECTOR Laboratories | SK-4100 | |
| Digital Stereotax | KOPF | Model 940 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Use for the N2 medium |
| DNase I Solution | STEMCELL Technologies | 7900 | 1 µg/mL |
| Doxycyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | 2 µg/mL |
| DPBS -/- | Gibco | 14190144 | |
| Epifluorescence microscope | Olympus | BX51 Microscope | |
| Ethanol | Solveco | 70%, 95%, 99.8% | |
| FUW-rTA | Addgene | 20342 | Lentiviral vector |
| FUW-TetO-Ascl1-T2A-puromycin | Addgene | 97329 | Lentiviral vector |
| FUW-TetO-Dlx2-IRES-hygromycin | Addgene | 97330 | Lentiviral vector |
| H1 (WA01) ESC | WiCell | WA01 | Human embryonic stem cell line under a MTA agreement |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | 18304 | |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 7634-01 | 5 µL |
| HBSS | Gibco | 14175095 | No calcium, No magnesium - Transplantation medium |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:1000 |
| Hygromycin B | Gibco (Invitrogen) | 10687010 | |
| Incubator | 5% CO2, 37 °C | ||
| Isoflurane Baxter | Apoteket AB | ||
| Manual cell counter | VWR | 720-1984 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free | Corning | 354277 | For the coating |
| Methanol | Merck Millipore | 1060091000 | |
| Microscope Coverslips 24 x 60 mm | Thermo Scientific | BBAD02400500#A113MNZ#0## | |
| Microscope Slides | VWR | 631-1551 | |
| Microscope Software | Olympus | CellSens | |
| Mounting media | Merck | 10981 | PVA-Dabco |
| Mouse adaptor to stereotax | RWD | 68030 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | Kit Basal Medium and 5X Supplement - Stem cell culture medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | 1M |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Pertex | HistoLab | 811 | |
| Pipet Filler | |||
| Play-Doh | |||
| Puromycin (Dihydrochloride) | Gibco | A1113803 | |
| Round cover glasses thickness No. 1.5H (tol. ± 5 μm) 13 mm Ø | Marienfeld | MARI0117530 | For immunocytochemistry |
| Serum | Thermo Fisher | Goat, Donkey, Horse | |
| Sterile pipette tips | For volumes 0.1-1000 µL | ||
| Sterile serological pipettes | 5, 10, 25 mL | ||
| Sterile water Braun | B Braun | 3626873 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | For 0.5% Sucrose solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Tubes | Sarstedt | 15 ml, Eppendorf 1.5 mL | |
| Tweezer | VWR | ||
| Ultra pure water | MilliQ Water System | ||
| Xylene | VWR | 28973.363 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 µM |
References
- Kostović, I., Jovanov-Milošević, N. The development of cerebral connections during the first 20-45 weeks' gestation. Seminars in Fetal and Neonatal. 11 (6), 415-422 (2006).
- Innocenti, G. M., Price, D. J. Exuberance in the development of cortical networks. Nature Reviews Neuroscience. 6 (12), 955-965 (2005).
- Tang, X., Jaenisch, R., Sur, M. The role of GABAergic signalling in neurodevelopmental disorders. Nature Reviews Neuroscience. 22 (5), 290-307 (2021).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: Comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31 (3-5), 299-316 (2002).
- Radonjić, N. V., et al. Diversity of cortical interneurons in primates: The role of the dorsal proliferative niche. Cell Reports. 9 (6), 2139-2151 (2014).
- Turner, D. A., Shetty, A. K. Clinical prospects for neural grafting therapy for hippocampal lesions and epilepsy. Neurosurgery. 52 (3), 632-644 (2003).
- Gonzalez-Ramos, A., et al. Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks. Scientific Reports. 11, 22050 (2021).
- Yang, N., et al. Generation of pure GABAergic neurons by transcription factor programming. Nature Methods. 14 (6), 621-628 (2017).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
- Yuan, F., et al. Induction of human somatostatin and parvalbumin neurons by expressing a single transcription factor LIM homeobox 6. eLife. 7, 37382 (2018).
- Fandel, T. M., et al. Transplanted human stem cell-derived interneuron precursors mitigate mouse bladder dysfunction and central neuropathic pain after spinal cord injury. Cell Stem Cell. 19 (4), 544-557 (2016).
- Noakes, Z., et al. Human pluripotent stem cell-derived striatal interneurons: Differentiation and maturation in vitro and in the rat brain. Stem Cell Reports. 12 (2), 191-200 (2019).
- Parikshak, N. N., Gandal, M. J., Geschwind, D. H. Systems biology and gene networks in neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. Nature Reviews Genetics. 16 (8), 441-458 (2015).
- Marín, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).
- Sloan, D. J., Wood, M. J., Charlton, H. M. The immune response to intracerebral neural grafts. Trends in Neurosciences. 14 (8), 341-346 (1991).
- Diehl, R., et al. Immunosuppression for in vivo research: State-of-the-art protocols and experimental approaches. Cellular & Molecular Immunology. 14 (2), 146-179 (2017).
- Osman, M. M., et al. Cyclosporine-A as a neuroprotective agent against stroke: Its translation from laboratory research to clinical application. Neuropeptides. 45 (6), 359-368 (2011).
- Quinnies, K. M., Cox, K. H., Rissman, E. F. Immune deficiency influences juvenile social behavior and maternal behavior. Behavioral Neuroscience. 129 (3), 331-338 (2015).
- Fernandes, D. J., et al. Mouse models of immune dysfunction: their neuroanatomical differences reflect their anxiety-behavioural phenotype. Molecular Psychiatry. 27 (7), 3047-3055 (2022).
- Lund, R. D., Rao, K., Hankin, M. H., Kunz, H. W., Gill, T. J. Transplantation of retina and visual cortex to rat brains of different ages. Maturation, connection patterns, and immunological consequences. Annals of the New York Academy of Sciences. 495, 227-241 (1987).
- Olsson, M., Bentlage, C., Wictorin, K., Campbell, K., Björklund, A. Extensive migration and target innervation by striatal precursors after grafting into the neonatal striatum. Neuroscience. 79 (1), 57-78 (1997).
- Mattis, V. B., et al. Neonatal immune-tolerance in mice does not prevent xenograft rejection. Experimental Neurology. 254, 90-98 (2014).
- Nato, G., et al. Immune-tolerance to human iPS-derived neural progenitors xenografted into the immature cerebellum is overridden by species-specific differences in differentiation timing. Scientific Reports. 11, 651 (2021).
- Allison, T., et al. Defining the nature of human pluripotent stem cell-derived interneurons via single-cell analysis. Stem Cell Reports. 16 (10), 2548-2564 (2021).
- Waloschková, E., et al. Human stem cell-derived GABAergic interneurons establish efferent synapses onto host neurons in rat epileptic hippocampus and inhibit spontaneous recurrent seizures. International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13243 (2021).
- Gonzalez Ramos, A. Enhancing neuronal inhibition by cell and gene therapy as a novel treatment for epilepsy. , Lund University, Faculty of Medicine. PhD thesis (2022).
- Paterno, R., et al. Hippocampal gamma and sharp-wave ripple oscillations are altered in a Cntnap2 mouse model of autism spectrum disorder. Cell Reports. 37 (6), 109970 (2021).
- Penagarikano, O., et al. Absence of CNTNAP2 leads to epilepsy, neuronal migration abnormalities, and core autism-related deficits. Cell. 147 (1), 235-246 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Angeletti, B., et al. An in vivo doxycycline-controlled expression system for functional studies of the retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (2), 755-760 (2003).
- Doxycycline. Drugs and Lactation Database (LactMed). , National Library of Medicine. Bethesda, MD. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK500561 (2021).
- Barker, R. A., Widner, H. Immune problems in central nervous system cell therapy. NeuroRX. 1 (4), 472-481 (2004).
- Hoornaert, C. J., et al. Concise review: Innate and adaptive immune recognition of allogeneic and xenogeneic cell transplants in the central nervous system. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1434-1441 (2017).
- Englund, U., Fricker-Gates, R. A., Lundberg, C., Bjorklund, A., Wictorin, K. Transplantation of human neural progenitor cells into the neonatal rat brain: Extensive migration and differentiation with long-distance axonal projections. Experimental Neurology. 173 (1), 1-21 (2002).
- Fainstein, N., Ben-Hur, T. Brain region-dependent rejection of neural precursor cell transplants. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 136 (2018).
- Denham, M., et al. Neurons derived from human embryonic stem cells extend long-distance axonal projections through growth along host white matter tracts after intra-cerebral transplantation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, 11 (2012).
- Miguez, A., et al. In vivo progressive degeneration of Huntington's disease patient-derived neurons reveals human-specific pathological phenotypes. bioRxiv. , (2022).
