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Medición transdérmica de la tasa de filtración glomerular en lechones ventilados mecánicamente

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64413
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Physiology, College of Medicine University of Tennessee Health Science Center
* These authors contributed equally

Summary

La tasa de filtración glomerular (TFG) es el marcador ideal para evaluar la función renal. Sin embargo, el método de medición estándar que utiliza la inyección de inulina con análisis seriados de sangre y orina no es práctico. Este artículo describe un método práctico para medir la TFG transdérmica en lechones.

Abstract

La medición transdérmica de la tasa de filtración glomerular (TFG) se ha utilizado para evaluar la función renal en animales conscientes. Esta técnica está bien establecida en roedores para estudiar la lesión renal aguda y la enfermedad renal crónica. Sin embargo, la medición de la TFG utilizando el sistema transdérmico no se ha validado en cerdos, una especie con un sistema renal similar al de los humanos. Por lo tanto, investigamos el efecto de la sepsis sobre la TFG transdérmica en cerdos neonatos anestesiados y ventilados mecánicamente. La sepsis polimicrobiana fue inducida por ligadura y punción cecal (CLP). El sistema de medición transdérmica de TFG que consiste en un sensor de fluorescencia miniaturizado se conectó a la piel afeitada del cerdo para determinar el aclaramiento de sinistrina conjugada con fluoresceína-isotiocianato (FITC), un trazador de TFG inyectado por vía intravenosa. Nuestros resultados muestran que a las 12 h post-CLP, la creatinina sérica aumentó con una disminución de la TFG. Este estudio demuestra, por primera vez, la utilidad del enfoque transdérmico de TFG para determinar la función renal en cerdos neonatales con ventilación mecánica.

Introduction

Una evaluación práctica y cuantitativa de la función renal es la medición de la tasa de filtración glomerular (TFG), que indica qué tan bien los riñones filtran la sangre según el principio de aclaramiento1. Un método anterior de medición de la TFG implica la inyección intravenosa de compuestos exógenos como la inulina o la sinistrina, realizando mediciones seriadas de los niveles plasmáticos/urinarios para detectar su aclaramiento 2,3. Este método es engorroso y requiere la recolección en serie de muestras de plasma y orina4. Una alternativa es la medición de productos finales metabólicos endógenos como la creatinina. Sin embargo, esto consume mucho tiempo y, a veces, es inexacto, ya que no solo es filtrado por el glomérulo sino también secretado por los túbulos 5,6. Además, el nivel de creatinina está influenciado por el sexo, la edad, la dieta y la masa muscular 7,8,9.

Una medida más precisa, mínimamente invasiva y ampliamente utilizada de la TFG es el uso de monitores transdérmicos de TFG, que miden la TFG en tiempo realen animales 4,10. Sinistrin, un marcador renal exógeno altamente soluble y filtrado libremente, está marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC). Este compuesto conjugado se inyecta por vía intravenosa, y la función renal en tiempo real puede ser evaluada sin recoger muestras de sangre y orina11. El uso de la medición transdérmica de la TFG se ha validado en roedores 12, perros13 y gatos14, pero no en cerdos.

Las especies porcinas comparten varias características anatómicas y fisiológicas con los humanos, lo que las convierte en animales ideales para el estudio de diversas enfermedades humanas15. El uso de cerdos en la investigación biomédica traslacional se ha vuelto cada vez más popular y preferido sobre los modelos de roedores porque imita la fisiología y fisiopatología humana16. Los cerdos neonatos son de interés en la comprensión de los mecanismos de las enfermedades exclusivas de los pacientes pediátricos17. Además, el reciente avance en el trasplante de órganos de cerdo a humano pone en urgencia la ampliación de las herramientas de diagnóstico para ensayos preclínicos y clínicos 18,19,20,21. Este documento, por primera vez, proporciona una guía para el uso del dispositivo transdérmico en la medición de la TFG en cerdos neonatos.

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Protocol

Los procedimientos están escritos de acuerdo con los estándares nacionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Tennessee (UTHSC).

NOTA: Los lechones en el grupo experimental son sometidos a ligadura cecal y punción, mientras que el grupo simulado sólo se somete a la apertura del abdomen sin ligadura cecal o punción. Los lechones en ambos grupos se mantienen bajo anestesia durante 12 h después del procedimiento para permitir suficiente tiempo para que se produzca sepsis y lesión renal aguda (LRA) en el grupo experimental. La medición transdérmica de la TFG se producirá a las 8 h después del procedimiento durante un total de 12 h.

1. Suministro y alojamiento de lechones

  1. Identifique una granja local de cerdos que pueda proporcionar lechones neonatales de 3 a 5 días. Programe la entrega a principios de la semana para completar la experimentación antes de que los lechones tengan más de 7 días.
    NOTA: El proveedor proporcionó de tres a cinco lechones los lunes para este experimento; para el viernes, los lechones se habrían sometido al experimento. Usar el mismo sexo y casi una edad similar es esencial para evitar factores de confusión.
  2. A la llegada del lechón, asegúrese de que tenga una identificación individual (por ejemplo, una marca auricular y un registro que incluya el peso y la edad).
  3. Aloje a los lechones en una unidad de cuidado de animales de laboratorio (LACU) bajo el cuidado de un veterinario con licencia. Los animales se alojan como grupo en un corral espacioso con un piso de concreto sólido que se lava fácilmente con agua para mantener un buen saneamiento.
  4. Agregue un mueble como una bola pesada para permitir el enriquecimiento y la estimulación ambiental.
  5. Asegúrese de que la LACU proporcione condiciones ambientales óptimas, incluidos los siguientes elementos clave: saneamiento, nutrición, control de temperatura, ventilación y ciclo día-noche mediante el control de la iluminación.
  6. Haga que el veterinario revise el lechón diariamente, incluida la medición del peso, para informar al investigador si algún lechón parece enfermo, lo que puede requerir la exclusión del experimento.
  7. Deje a los lechones durante al menos 1 día para aclimatarse al medio ambiente, lo que ayuda a minimizar el estrés.

2. Preparación preoperatoria

  1. Prepare la estación quirúrgica antes de iniciar el experimento. Esto incluye una almohadilla térmica, catéteres, un ventilador, un tubo endotraqueal, solución salina heparinizada y una bolsa de líquido de lactato de timbre.
    NOTA: Los lechones tienen mala capacitancia termorreguladora y son propensos a la hipotermia que altera la hemodinámica22,23. Por lo tanto, es esencial dejar suficiente tiempo para que la almohadilla térmica se caliente.
  2. Preparar 10 mg/ml de α-cloralosa mezclándola con solución salina a 60 °C hasta que la mezcla esté clara. No sobrecaliente la solución para evitar la cristalización del medicamento al enfriarlo. Filtrar con un filtro de jeringa (tamaño 0,22 μm) antes de administrarlo a los lechones.
  3. Elaborar medicación anestésica basada en el peso animal: ketamina: 20 mg/kg y xilazina: 2,2 mg/kg. Use α -cloralosa (5 mL/kg) para mantener la anestesia.
    NOTA: α -cloralosa se utiliza debido a la facilidad de administración IV en comparación con inhalada
    anestésicos, ya que estos últimos requieren una máquina anestésica y un sistema de barrido apropiado que se administrará a través de un tubo endotraqueal.

3. Anestesia

  1. Realizar la inducción de la anestesia en el corral de cerdos, un ambiente familiar para los lechones, para evitar el estrés indebido.
  2. Recoger suavemente el lechón por las patas traseras y administrar ketamina: 20 mg/kg y xilazina: 2,2 mg/kg en la pata trasera en el músculo semimembranoso/semitendinoso, utilizando una aguja de 23 G 3/4.
  3. Espere unos minutos para que los medicamentos surtan efecto. Verifique el nivel de anestesia adecuado asegurándose de que el animal esté lo suficientemente relajado como para estar inmóvil, con pérdida del reflejo palpebral y el tono de la mandíbula para permitir un transporte fácil y seguro a la estación quirúrgica. Evaluar el reflejo palpebral tocando la esquina interna del ojo; La ausencia de parpadeo indica una anestesia adecuada.

4. Traqueotomía

NOTA: Este experimento no es de supervivencia, por lo que se realiza una traqueotomía para establecer una vía aérea para la ventilación mecánica. La traqueotomía es un procedimiento rápido y fácil, a diferencia de la intubación endotraqueal, que es un desafío en lechones dada la anatomía de su cabeza y vías respiratorias superiores24,25. Además, el laringoespasmo es comúnmente relatado durante la intubación, resultando en un período prolongado de hipoxia e hipercapnia que puede comprometer los resultados26.

  1. Coloque el lechón en decúbito dorsal. Identifique el cartílago cricotiroideo palpando la prominencia del cartílago tiroides que se siente firme. Esterilice el área con povidona yodada y etanol al 70% antes de aplicar una cortina estéril.
  2. Usando una cuchilla quirúrgica, haga una incisión ventral de 2-3 cm en la línea media inferior al extremo caudal del cartílago tiroides.
  3. Usando un hemostático de mosquito curvo, diseccione sin rodeos los tejidos y músculos subcutáneos suprayacentes (esternohioides y coli cutáneos) hasta que se visualicen la membrana cricotiroidea y los primeros anillos traqueales. Al diseccionar, tenga cuidado de evitar lesionar los vasos sanguíneos.
  4. Obtenga una visión clara de la membrana cricotiroidea y los anillos traqueales24, luego use un par de pinzas de ángulo recto mezclador largo para elevar las estructuras.
    1. Con un par de tijeras pequeñas, haga un pequeño corte en la membrana cricotiroidea o en el primer anillo traqueal. Extienda el corte horizontalmente a ~0.5 cm para pasar un tubo endotraqueal de 3.0 mm.
    2. Inserte el tubo en la marca de 5 cm. Asegúrese de la expansión bilateral del pecho y los ruidos respiratorios antes de asegurar el tubo.
  5. Pase cinta umbilical alrededor de la tráquea para asegurarla en su lugar. Se utiliza cinta adhesiva adicional para asegurar el tubo a la base de la mandíbula.
  6. Encienda el ventilador, conecte el tubo endotraqueal y gire las perillas específicas (p. ej. Perillas SIMV, perillas PEEP, etc.) para seleccionar la siguiente configuración de línea base. Modo de control de presión: ventilación mecánica intermitente sincronizada (SIMV); presión inspiratoria máxima (PIP) - 15; presión positiva al final de la espiración (PEEP) - 5; Tasa- 20; I-tiempo - 0.6. Después del primer análisis de gases en sangre, ajuste la configuración del ventilador de acuerdo con los resultados de gases en sangre, con el objetivo de mantener una oxigenación y ventilación adecuadas.

5. Canulación del vaso femoral

  1. Establezca la vía aérea y la ventilación, antes de cambiar la atención a los vasos femorales para el acceso venoso y el monitoreo invasivo de la presión arterial. La arteria femoral se identifica sintiendo un pulso en el surco entre los músculos sartorio y gracilis, y la vena se puede encontrar justo medial a la arteria.
  2. Mientras el lechón está acostado en una posición dorsal reclinada, esterilice el área de la ingle con povidona yodada y etanol, y aplique una cortina del tamaño adecuado.
  3. Use una cuchilla quirúrgica para crear una incisión longitudinal de 3-4 cm, comenzando cranealmente en el pliegue inguinal y extendiéndose distalmente a lo largo del canal femoral.
  4. Aplique una disección roma y aguda, usando pinzas curvas de mosquito y tijeras, respectivamente, para diseccionar hasta el nivel del haz neurovascular femoral. El paquete se puede encontrar en lo profundo del cuerpo del músculo gracilis27. Diseccionar circunferencialmente la arteria femoral y la vena en el transcurso de 2-3 cm para permitir la canulación . Ligate pequeñas ramas laterales si es necesario.
  5. Aplique una corbata de seda 3.0 tanto en la arteria como en los extremos proximal y distal de la vena para aplicar tracción. Ate la sutura de seda distal tanto en la vena como en la arteria, ligando los vasos.
  6. Comenzando con la vena femoral, mantenga la tracción distal y proximal en los lazos de seda y luego use un par de micro tijeras para crear una venotomía.
  7. A continuación, use un introductor de catéter de selección de venas para abrir el vaso mientras inserta un catéter de poliuretano premedido con un diámetro interno x diámetro exterior de 0.86 mm x 1.32 mm. Una vez insertado, ate la sutura de seda proximal 3.0 para fijar el catéter. Enjuague el catéter con 3 ml de solución salina heparinizada (1 U/ml). Esta solución se puede hacer agregando 0.5 ml de heparina a 50 ml de solución salina normal.
  8. Inserte un catéter de presión arterial invasivo utilizando el mismo enfoque anterior para crear una arteriotomía y pasar el catéter.
    NOTA: Mantener la tracción distal y proximal es esencial para minimizar la pérdida de sangre al acceder a la arteria.
  9. Una vez que los catéteres estén asegurados, cubra el sitio con una gasa empapada en solución salina y, si es necesario, se puede suturar la piel con una sutura de seda 3.0 para prevenir la infección.

6. Mantenimiento de anestesia, líquidos y gases en sangre

  1. Controle la profundidad de la anestesia durante todo el experimento, utilizando el tono de la mandíbula y el reflejo palpebral, y administre α-cloralosa, por vía intravenosa, según sea necesario para mantener al animal bajo anestesia profunda. Utilice una dosis de carga inicial de 50 mg/kg y de 20 mg/kg para bolos adicionales.
  2. Infundir lactato de timbre a una velocidad de 4 ml / kg / h durante todo el experimento como líquido de mantenimiento. Por ejemplo, si el peso del lechón es de 3 kg, entonces la velocidad de infusión de líquidos es de 12 ml / h.
  3. Para el análisis de gases junto a la cama, extraiga una muestra de sangre arterial en una jeringa de gases en sangre heparinizada y presente la muestra a la máquina analizadora. Seleccione la opción gasometría arterial y espere ~2-3 s para que el analizador presente la aguja de extracción de sangre.
    1. Inserte cuidadosamente la aguja en el extremo de la jeringa que contiene la muestra de sangre. Espere a que el analizador aspire la muestra requerida y retire la jeringa. Permita que la máquina analice la gasometría y presente los resultados.
    2. Según los resultados, ajuste el ventilador para mantener el pH entre 7.35--7.45, la presión parcial de dióxido de carbono (PCO2) entre 35-45 mmHg y la presión parcial de oxígeno (PaO2) entre 80-150 mmHg. La configuración difiere según el tipo de ventilador, pero en gran medida implica aumentar o reducir la frecuencia respiratoria utilizando perillas apropiadas para compensar la hipoxia y / o hipercapnia.
  4. Extraiga 3 ml de sangre en un tubo verde claro (heparina de litio). Centrifugar la muestra a 2000 xg durante 15 min, mantenida a 4 °C para extraer plasma. Una vez completado, el plasma puede analizarse inmediatamente para determinar el nivel de creatinina sérica con el analizador químico de cabecera o almacenarse a -80 °C para su posterior análisis.
  5. Controle la temperatura continuamente con un termómetro de sonda rectal y ajuste la temperatura de la almohadilla térmica para mantener la temperatura del lechón entre 101 y 103 ° F.

7. Grupo de experimentación; ligadura y perforación cecal (CLP) 25,28,29

NOTA: Para los lechones en el grupo de experimento, realice CLP para inducir sepsis polimicrobiana28 y monitoree al animal durante 12 h después de la cirugía para permitir suficiente tiempo para que se produzca una sepsis grave. El registro transdérmico de la TFG comienza a las 8 h después de la ligadura cecal para permitir 4 h de grabación.

  1. Use una cuchilla quirúrgica para crear una incisión vertical paramediana izquierda de 5-6 cm, ya que el ciego en cerdos se encuentra en la fosa paralumbar izquierda30. Diseccionar las capas de la pared abdominal, evitando lesiones en los vasos epigástricos superficiales.
  2. Una vez que se incide la capa peritoneal, use un retractor para mejorar el acceso a las estructuras intrabdominales.
  3. Identificar el colon espiral en el cuadrante superior izquierdo del abdomen. Traza el colon espiral, caudal y dorsalmente, para localizar el ciego. El íleon se ve uniéndose al colon espiral en la base del ciego.
  4. Ligate el ciego justo distal a la unión ileocecal (Figura 1).
  5. Con una aguja de 18 G, haga siete punciones en el ciego y extruya las heces en el área peritoneal.
  6. Cierre el abdomen en capas con una sutura de seda 3.0 usando puntos simples interrumpidos o continuos. También se puede usar una grapadora para cerrar la capa de piel si está disponible.

8. Grupo falso

  1. Siga los pasos 7.2-7.4 como se indica arriba. Después de identificar el ciego, colóquelo intacto y cierre la pared abdominal de manera similar.
  2. Monitoree los lechones en el grupo simulado durante 12 h para eliminar cualquier sesgo de confusión atribuido a la exposición prolongada a la anestesia.

9. Configuración del dispositivo de TFG transdérmica

  1. Después de 8 h de ligadura cecal, prepárese para iniciar la medición transdérmica de la TFG.
  2. Utilice la versión 3.0 del software de servicio MB para ajustar la frecuencia de muestreo en el dispositivo GFR. Brevemente, conecte el dispositivo transdérmico de TFG al software de la computadora mediante el conector USB. Abra el software, haga clic en conectar y ajuste el tiempo a 4000 ms. Haga clic en escribir para guardar la configuración.
    NOTA: Esto da hasta 6 h de tiempo total de muestreo. En los cerdos, la TFG transdérmica se completa en 4 h. Para experimentos que requieren muestreo de hasta 12 h, elija la opción de 8000 ms.
  3. Fije los parches adhesivos de doble cara con una ventana transparente al dispositivo. Conecte el dispositivo a un lado, asegurándose de que el diodo emisor de luz se superponga a la ventana transparente para permitir la detección del trazador.
  4. Afeite el área que recubre la pared torácica lateral. Conecte la batería al dispositivo e inmediatamente pegue el parche adhesivo con el dispositivo en su lugar y asegúrese de que esté bien asegurado (Figura 2). Dado que los lechones están profundamente anestesiados, la cinta puede ser innecesaria para mantener el dispositivo en su lugar.
    NOTA: El parche adhesivo solo es suficiente para asegurarlo. Sin embargo, en procedimientos donde el animal sería manipulado, se activaría, o donde la anestesia podría ser interrumpida, podría ser importante aplicar una cinta. Un vendaje también podría ser un enfoque alternativo31.
  5. Se requiere un registro basal de 3-5 min antes de administrar FITC-sinistrin.

10. Preparación e inyección de FITC-sinistrin

  1. Preparar una mezcla de FITC-sinistrin con solución salina hasta una concentración final de 50 mg/ml. La dosis administrada al lechón es de 20 mg/kg. FITC-sinistrin se suministra en forma de polvo.
    NOTA: La FITC-sinistrina también se puede administrar a través de un catéter venoso periférico insertado en la vena auricular. Es esencial alcanzar un nivel máximo alto mediante la administración de FITC-sinistrin como un bolo de empuje a través del catéter venoso de la vena femoral.
  2. Coloque la jeringa con medicamento en un lado de una llave de parada de tres vías y una descarga salina en el otro lado de la llave de parada. Empuje el FITC-sinistrin e inmediatamente siga con un bolo salino de 5 ml antes de cerrar la llave de parada de tres vías a la vena del lechón.

11. Registro transdérmico de TFG

  1. Mantenga el dispositivo conectado al lechón durante 4 h. Durante este tiempo, mantenga el lechón bajo anestesia usando dosis intermitentes de α-cloralosa a una concentración de 20 mg / kg para evitar cualquier artefacto de movimiento.
  2. Al final de las 4 h, retire el dispositivo y desconecte inmediatamente la batería.

12. Medición de la TFG

  1. Conecte el dispositivo transdérmico de TFG al ordenador mediante el conector USB proporcionado por el proveedor.
  2. Abra el software de lectura para recuperar datos del dispositivo. Guarde los datos sin procesar haciendo clic en la secuencia: conectar, leer, cambiar el nombre y guardar. Como se indica en el manual, procese y evalúe los datos guardados en el software de análisis.
  3. Brevemente, abra la versión 3.0 del software e importe los datos. Ajuste las posiciones de desplazamiento, inicio y fin utilizando los marcadores automatizados. Quite los artefactos si es necesario y haga clic en Ajustar. Esto proporciona una lectura que muestra el aclaramiento de FITC-sinistrina en minutos (t1/2). El t1/2 se utiliza posteriormente para calcular la TFGt32,33 de la siguiente manera:
    Equation 1
    NOTA: En consulta con el fabricante, el factor de conversión utilizado para los cerdos es 20 (lo que indica que el 20% del peso corporal es espacio extracelular), en comparación con 21,33 en ratas (TFGt en ml / min) y 14.616,8 en ratones (TFGt en μL / min). Esto se debe a que la TFG se mide con precisión en función del líquido extracelular 34,35, que a su vez depende del peso corporal36.

13. Eutanasia de lechones

  1. Recolectar 3 ml de sangre después de 12 h de CLP para un análisis bioquímico adicional.
  2. Eutanasia del lechón administrando 0,2 mL/kg de mezcla premezclada de pentobarbital sódico al 20% y fenitoína sódica por vía intravenosa.
  3. Cosechar el riñón derecho para el estudio histopatológico antes de llevar al lechón a la morgue.

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Representative Results

En esta sección, presentamos por primera vez, los datos representativos del uso de TFG transdérmica en cerdos neonatales. Se utilizó un modelo de ligadura y punción cecal que previamente ha demostrado disminuir la función renal28. En consecuencia, planteamos la hipótesis de que en nuestros cerdos CLP, debería haber una caída aguda de la TFG correspondiente a la LRA, y esto debería detectarse en el dispositivo transdérmico de TFG como un aumento del tiempo de aclaramiento (t1/2), validando así su uso en cerdos. Se incluyeron siete lechones machos, tres simulados y cuatro sepsis. Los dos grupos tenían pesos comparables (Figura 3A). Como era de esperar28, 12 h sepsis aumentó los niveles séricos de proteína C reactiva (PCR), un marcador de bacteriemia y sepsis (Figura 3B). Se muestran curvas representativas de aclaramiento de FITC-sinistrina en lechones simulados vs sépticos (Figura 4 A, B), con LRA que se muestra superponiendo las curvas simulada y sepsis (Figura 4C). La LRA se muestra por un aumento de la superficie bajo la curva para los cerdos CLP. Esto se puede ver visiblemente cuando la curva simulada se coloca en la curva CLP. La vida media promedio para FITC-sinistrin en los grupos de simulacro y sepsis fue de 114 y 537 minutos, respectivamente (Figura 5A). La TFG promedio en el grupo simulado fue de 5,1 mL/min/100 gm del peso corporal, mientras que en el grupo de sepsis, fue de 1,06 mL/min/100 gm del peso corporal (Figura 5B). Se excluyó un animal adicional ya que la sonda fue desplazada, lo que alteró la curva de despeje y el tiempo. Mientras que la creatinina sérica de 12 h (un biomarcador de lesión renal aguda) no cambió en el grupo simulado, se incrementó de ~ 0,6 a 1,08 mg/dL en los cerdos sépticos (Figura 6).

Figure 1
Figura 1: Cirugía de ligadura de ciego. (A) Cecum identificado y llevado al exterior. (B) Ciego ligado en la base con una corbata de seda antes de perforar con una aguja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Fijación del dispositivo transdérmico a la piel. (A) Piel afeitada antes de la fijación del parche adhesivo. (B) Dispositivo transdérmico de TFG conectado al parche adhesivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Resultados representativos. (A ) Peso de los lechones utilizados en este estudio y ( B ) Niveles séricos de proteína C reactiva (PCR) en lechones machos simulados y sépticos con ventilación mecánica (prueba t no pareada). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Curvas representativas de aclaramiento de FITC-sinistrina en lechones machos simulados y sépticos ventilados mecánicamente. (A ) 12 h simulada, (B) 12 h sepsis. Los cerdos sépticos presentan deterioro de la función renal, como lo demuestra un aumento del área bajo la curva. Los puntos de datos negros representan datos sin procesar, las líneas azules el ajuste de tres compartimentos, las líneas verdes los intervalos de confianza del 95% y la línea roja los datos filtrados. (C) Superposición de curvas representativas para reflejar el grado de divergencia con respecto a la línea de base en cerdos sépticos. La curva de sepsis (roja) mostró un aclaramiento mínimo de FITC-sinistrin, lo que indica IRA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Resultados representativos. (A ) Vida media de FITC-sinistrina y ( B) parcelas de TFG en lechones machos simulados y sépticos con ventilación mecánica (prueba t no pareada). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Creatinina sérica en lechones machos simulados y sépticos ventilados mecánicamente. (Prueba ANOVA unidireccional). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este documento describe los pasos prácticos para determinar la función renal en cerdos utilizando los monitores de TFG transdérmicos miniaturizados y FITC-sinistrin en un modelo de cerdo neonatal anestesiado con ventilación mecánica. Artículos anteriores han establecido protocolos experimentales de TFG transdérmica en roedores11,12,14, pero no existen protocolos en cerdos.

Recientemente, ha habido un impulso para explorar modelos animales alternativos para resolver enfermedades intratables y aliviar la carga de la enfermedad renal en los seres humanos. Desafortunadamente, muchos de estos enfoques han tenido limitaciones traslacionales debido al tamaño, las diferencias anatómicas y fisiológicas. La anatomía renal y la fisiopatología de los roedores tienen grandes diferencias en comparación con los humanos37. Dado que los sistemas humano y porcino comparten características anatómicas y funcionales similares, el modelo porcino puede ser un modelo fisiopatológico más realista de las enfermedades humanas38,39. Los cerdos ahora se usan ampliamente para delinear la fisiopatología y en el desarrollo de fármacos. Con la publicación del genoma porcino, junto con la producción transgénica exitosa de modelos específicos de enfermedades, el modelo porcino puede asumir un papel más crítico en la investigación traslacional40,41.

El aclaramiento de inulina sigue siendo el medio más aceptado para la determinación de la TFG, pero no es práctico en modelos animales grandes debido a la necesidad de infusión continua de inulina, cateterismo de la vejiga y su naturaleza lenta y engorrosa42. La creatinina sérica y el nitrógeno ureico en sangre (BUN) se utilizan comúnmente para medir la función renal en estudios preclínicos, pero debido a que la creatinina se secreta en los túbulos y la urea se reabsorbe cada vez más en la deshidratación, estos marcadores han demostrado ser pobres en la estimación de la función renal 5,43. Fundamentalmente, se encontró que la secreción tubular de creatinina causa sobreestimación de la TFG cuando se utiliza como marcador de la función renal en los cerdos6. Además, debido a su hábito corporal, es más probable que se observe un aumento en la creatinina en modelos animales grandes en comparación con los roedores. Un estudio en ratones reveló un aumento de 1,5 veces en la creatinina sérica 6 h después de la ligadura cecal44. Anteriormente, mostramos un aumento de la creatinina en cerdos neonatos a las 6 h después de la CLP28. En este estudio, mantuvimos a los animales durante un período más largo, ~ 12 horas después de la ligadura cecal para permitir suficiente tiempo para una LRA significativa y un aumento posterior de la creatinina. Al igual que en nuestro estudio anterior, confirmamos la inducción de sepsis por un aumento en los niveles séricos de PCR, un marcador de inflamación y sepsis. En este estudio, y como muestran artículos anteriores, la gravedad de la sepsis después de CLP depende de la duración de la ligadura y del número de punciones44.

Un protocolo para medir la TFG en cerdos usando Iohexol ha sido previamente validado en cerdos37, pero en contraste, el procedimiento transdérmico de TFG es una mejora notable. Es menos engorroso, evita el muestreo repetido de sangre u orina, y ofrece una ventana en tiempo real a la función renal y la posibilidad de mediciones repetidas y seriadas en el mismo animal45. Este estudio proporciona pautas prácticas para la determinación transdérmica de la TFG en cerdos.

Según lo establecido por otros grupos, los pasos más críticos son la correcta fijación del dispositivo al animal y la inyección en bolo de FITC-sinistrin. El dispositivo de medición debe estar bien fijado a la superficie de la piel para evitar artefactos de movimiento en la traza. Debido a que los cerdos son menos peludos que los roedores, no se requiere el uso de una crema depilatoria. Un afeitado limpio con una cortadora podría ser todo lo que se necesita. Esto minimiza el aumento asociado a la depilación en la vida media de FITC-sinistrin, cuyo mecanismo es desconocido12. Para una fijación adecuada, se requiere un parche adhesivo de doble cara y cinta adhesiva para mantener el dispositivo en su lugar. Las ubicaciones óptimas de colocación del dispositivo son la pared torácica lateral y la región abdominal ventral. Estas áreas se correlacionaron con menos artefactos de movimiento.

Al inyectar el FITC-sinistrin, se debe inyectar la dosis correcta y completa en un movimiento fluido en la vena. Cuando la inyección se interrumpe y se reinicia, crea múltiples "mini-picos" en la curva de holgura. La vena de la cola se usa rutinariamente para roedores pequeños, pero la vena auricular del oído ofrece una ruta más accesible y prominente en los cerdos. Se puede colocar una cánula en la vena del oído para múltiples mediciones en cerdos conscientes. Una distinción importante a tener en cuenta en el tiempo de muestreo es que, a diferencia de los roedores (~ 1-2 h), los cerdos duran más (~ 4 h), lo que se aproxima al tiempo que tarda FITC-sinistrin en eliminarse de la circulación. Hasta donde sabemos, este es el primer documento que detalla la TFG transdérmica a través de la eliminación de FITC-sinistrin en cerdos. Por lo tanto, no existen citas como referencia. El tiempo de medición utilizado ~ 4h se obtuvo, a través de consultas con el fabricante. Este tiempo de muestreo es comparable a un estudio previo que validó la TFG transdérmica en otros mamíferos no roedores14.

Al evaluar la TFG transdérmica en lechones, hay algunos factores que deben considerarse. Se sabe que los modelos de un compartimento sobreestiman significativamente la TFG46; Utilizamos el modelo cinético de tres compartimentos que es más preciso, proporcionando comunicación tridireccional del marcador inyectado por vía intravenosa entre el plasma, el espacio extracelular y los componentes más profundos46. Además, estos son lechones ventilados mecánicamente bajo anestesia muy profunda durante ~ 12 h. Dado que la anestesia influye en la función renal47,48, podría valer la pena tenerla en cuenta en procedimientos que requieren sedación prolongada o donde las maniobras experimentales requieren anestesia adicional junto con la monitorización de la TFG. Finalmente, y quizás lo más importante, los lechones neonatales tienen sistemas renales aún en desarrollo con nefronas inmaduras que funcionan a una fracción del animal adulto49. Así, demuestran menor TFG y función renal50.

Como se indicó anteriormente, la TFG transdérmica en cerdos no es una medida absoluta de las concentraciones de sinistrina en la sangre. Es sólo una estimación de la desintegración de la fluorescencia a lo largo del tiempo12. El uso de un factor de conversión intenta mitigar esto, expresando la TFG en ml/min. Sin embargo, debido a que el factor de conversión depende del espacio extracelular, que a su vez depende del peso corporal34,35,36, es posible que existan grandes variaciones si el peso no es controlado, o si el espacio extracelular no está definido con precisión 51,52.

Además, la pigmentación de la piel parece afectar el aclaramiento transdérmico de FITC-sinistrina12,31. En nuestros estudios, encontramos que los cerdos pigmentados mostraron una disminución de la señal. En un caso, no detectamos señal en un cerdo de color intensamente oscuro. Sin embargo, dado que la señal de fondo tiende a reducirse en animales pigmentados12, encontramos que los valores de TFG fueron en gran medida comparables. Una solución a esto es optar por áreas de color más claro de la piel al colocar el dispositivo. Dado que estos cerdos se utilizaron en gran medida en un modelo quirúrgico de enfermedad, con varias formas de iluminación y fuentes de calor involucradas, se deben tener en cuenta los posibles artefactos de movimiento en las trazas de TFG a través de la luz reflejada absorbida de la piel circundante12. Una solución a esto podría ser minimizar la luz infrarroja durante la grabación o cubrir los dispositivos con papel de aluminio.

En resumen, este estudio ofrece un método simple y confiable para medir la tasa de filtración glomerular en cerdos neonatos utilizando la medición transdérmica del aclaramiento de FITC-sinistrina. Además, nuestros datos respaldan la utilidad del sistema para evaluar la función renal en los entornos de lesión renal aguda.

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Disclosures

Ninguno.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por las subvenciones R01 DK120595 y R01 DK127625 de los Institutos Nacionales de Salud otorgadas al Dr. Adebiyi. El contenido de este documento es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. Gracias al Dr. Daniel Schock-Kusch, director de MediBeacon GmbH, por sus consejos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha - Chloralose Sigma-Aldrich C0128-25G Used for maintanining anesthesia
Black braided silk  3-0 Surgical Specialties SP117 Silk tie for blood vessel traction and ligation
Centrifugation machine AccuSpin 8C Fischer Scientific 75-008-821 Used to extract plasma from whole blood sample
Endotracheal Tube 3.0 uncuffed Progressive Medical International 1109021995 Inserted through tracheostomy
FITC-Sinistrin 1.0 g MediBeacon Inc. FTCF S001 Store at room temp and protect from light
GEM Premier 3000 Blood gas analyzer Instrumentation Laboratory 5700 For bedside blood gas analysis
Heating Pad medium size 20 in x 29 in Adroit Medical Systems V029 Connects to heat therapy pump
HTP-Heat Therapy Pump Adroit Medical Systems HTP Allows you to set temperature as needed.
IDEXX Catalyst One IDEXX Laboratories 89-92525-00 Plasma creatinine analysis
Invasive blood pressure catheter 3.5Fr Millar SPR-524 Inserted in femoral artery
IV adminstration set with flow regulator True Care TCRTCBINF033G Used to connect IV fluid bag to vein catheter
Ketamine Covetrus 68317 Used for induction of Anesthesia
MediBeacon analysis software version 3.0 MediBeacon Inc. N/A Software program used for analysing data to obtain sinistrin clearance half life and curve
Millex-GV Syringe Filter Unit 0.22 µm Millipore Sigma SLGVR33RS Syringe filter for chloralose injection
Neonate/Infant Ventilator Sechrist Millennium 20409 Connected to air supply to provide ventilation through endotracheal tube
Phenobarbital Sodium + Phenytoin Sodium (Euthasol) Covetrus 72934 Used for euthanasia
Ringer Lactate 500 mL bag Baxter 2B2323Q Maintanence fluid infusion
Sterile Gloves Henry Schein 104-5920 Used by operator during surgery
Sterile Gown Halyard Health 95021 Used by operator during surgery
Steril Towel Medline 42131704 Used as drape to maintaine sterile field when operating
Suture 3-0 silk reverse cutting needle Ethicon NC1842168 Used for suturing abdominal wall layers
Transdermal Mini GFR Monitor MediBeacon Inc. TDM004 Battery and USB connector included in package
Transdermal monitor adhesive patch MediBeacon Inc. PTC-SM001 Doubl sided adhesive patch for GFR probe
Umbilical Tape 1/8 in x 20 yds Fisher Scientific NC9303017 To secure endotracheal tube
Venous Catheter size PE/5 Micro medical tubing BB31695 For femoral vein cannulation
Xylazine Covetrus 61035 Used for induction of anesthesia

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Medicina Número 187
Medición transdérmica de la tasa de filtración glomerular en lechones ventilados mecánicamente
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Fanous, M. S., Afolabi, J. M.,… More

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