Summary
Den nåværende protokollen beskriver ekstraksjonen av lumikan fra fosterhinnen (AM) og deres lagringsforhold som AM-ekstrakt (AME) ved -20 ° C, 4 ° C og romtemperatur (RT) i 6, 12, 20 og 32 dager for å kvantifisere proteiner og lumikankonsentrasjon.
Abstract
Lumican er en liten leucinrik proteoglykan i den humane fosterhinnen (AM) som fremmer hornhindeepitelisering og organisering av kollagenfibre, og opprettholder hornhindegjennomsiktighet. I dette arbeidet foreslås en metode for proteinekstraksjon fra AM for å oppnå lumikan. I tillegg vurderes stabiliteten til lumikan i AM-ekstraktet (AME) lagret ved forskjellige temperaturer og tidsperioder. 100 mg additiv tilvirkning ble tint og mekanisk de-epithelialisert. Den de-epithelialiserte AM ble frosset og knust til et fint pulver ble oppnådd, som ble oppløst med 2,5 ml saltvannsbuffer med proteasehemmere og sentrifugert for proteinekstraksjon. Supernatanten ble samlet opp og oppbevart ved -20 °C, 4 °C og romtemperatur (RT) i 6, 12, 20 og 32 dager. Etterpå ble lumikan kvantifisert i hver AME. Denne teknikken tillater en tilgjengelig og anskaffelig protokoll for lumikanutvinning fra AM. Lumicankonsentrasjonen ble påvirket av lagringstid og temperaturforhold. Lumikan i AME på 12 dager lagret ved -20 °C og 4 °C var signifikant høyere enn ved annen AME. Denne lumikanekstraksjonen kan være nyttig for å utvikle behandlinger og farmasøytiske løsninger. Ytterligere studier er nødvendig for å bestemme bruken av AME lumikan i reepitelisering og sårhelingsprosess.
Introduction
En av de mest brukte behandlingene for hornhinneaffeksjon er fosterhinnetransplantasjon; De siste årene har det imidlertid kommet nye forslag om bruk av ulike komponenter i fostervann som alternativ og adjuvant behandling. Blant de mest studerte komponentene i AM er de som er hentet fra AM-ekstraktet (AME)1,2,3,4,5,6,7. AM inneholder flere løselige faktorer som antiangiogene proteiner, interleukiner (IL), vevshemmere av metalloproteinaser (TIMPs), antiinflammatoriske proteiner mediert av TSG-6 som hemmer nøytrofile ekstracellulære feller, vekstfaktorer: epidermal vekstfaktor (EGF), transformerende vekstfaktor (TGF) (alfa og beta), keratinocytvekstfaktor (KGF), hepatocytvekstfaktor (HGF) og lumikan, som opprettholder hornhindegjennomsiktighet ved å regulere kollagenfibrillogenese1, 2,3,4,5,6,7,8,9.
Lumican er en liten leucinrik proteoglykan (SLRP), en av de viktigste ekstracellulære komponentene i interstitiell kollagenase i hornhinnen stroma-matrisen, ansvarlig for å organisere kollagenfibre og opprettholde hornhindegjennomsiktighet 4,10,11. Proteoglykaner er molekyler i den ekstracellulære matrisen (ECM), som er de viktigste i å utføre cellesignalering og opprettholde intracellulær homeostase12. ECM-proteiner har blitt rapportert å drive de cellulære prosessene for spredning, differensiering og migrasjon under sårheling11.
Bevis indikerer mulig deltakelse av lumikan i prosessen med hornhinde-reepitelialisering. Saika et al., i en studie, viste at etter en hornhinneskade kunne lumikan påvises i hornhinnen keratocytter mellom de første 8 timene og opptil 3 dager etter skade. Denne proteoglykanen presenterer den høyeste konsentrasjonen av lumikan på den andre og tredje dagen, og kan senere ikke oppdages på den syvende dagen13. Disse dataene antyder deltakelse av lumikan i aktiveringen av hornhinnen reepiteliseringsprosessen. På den annen side ble det i en annen studie rapportert at fraværet av lumikan forsinker reepitelialisering; Interessant nok kan tilsetning av lumikan akselerere reepiteliseringsprosessen 4,11,13. På samme måte har en nylig studie rapportert at lumikan kan modulere de inflammatoriske funksjonene til hornhinnen limbus fibroblaster14, noe som antyder en rolle for lumikan som en modulator av inflammatorisk, antifibrotisk og reepitelial respons. På samme måte kan lumikan modulere hornhinneresponsen ved å interagere med signalmolekyler som Fas-FasL. Også fraværet av lumikan i en knockout Lum-/- musemodell viste at mangelen på lumikansignalering forhindrer tilstrekkelig hornhindereparasjon15.
Først og fremst tar denne metoden sikte på å demonstrere en gjennomførbar og tilnærmelig måte å trekke ut lumikan fra AM. Med denne fordelaktige metoden for lumikanekstraksjon er det mulig å oppnå lignende konsentrasjoner av proteiner, redusere behandlingstiden og gjøre det mer praktisk for etterforskere sammenlignet med tidligere studier16. Videre kan denne AME lumican brukes som en adjuvans for hornhindereparasjon og re-epithelialiseringsprosesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Institutional Review Board (Prosjekt nr. CEI-2020/06/04). Am ble hentet fra Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana amnion bank (fra avidentifiserte mennesker), som er utarbeidet som beskrevet av Chávez-García et al.17.
1. Fremstilling av fosterhinneekstraktet
- Få 100 mg AM fra amnion bank.
MERK: Ifølge en tidligere rapport utskiller 50 mg AM totalt 10 ng / ml lumikan14. For å oppnå en høyere konsentrasjon av lumikan, bruk 100 mg AM, tilsvarende et samlet areal på 32 cm2. - Hvis additiv tilvirkning er frossen, tine den ved romtemperatur.
MERK: Utfør følgende prosedyrer under en laminær strømningshette klasse II B. - Vask additiv tilvirkning i en petriskål med 10 ml steril balansert saltløsning (BSS, se materialtabell) i 2 minutter.
- Hell BSS i et beger.
- Gjenta trinn 3 og bekreft visuelt at glyserolmediet ikke finnes i petriskålen BSS.
MERK: Gjenta trinn 3. etter behov til glyserolmedium ikke er tilstede i petriskål BSS.
- Inkuber additiv tilvirkning med 10 ml dispase II (1,7 IE/ml, se materialtabell) ved 37 °C, 5 % CO2 i 30 minutter.
MERK: Dispase II er en nøytral protease med mild aktivitet over epitelceller. Dette enzymet skiller effektivt intakt epidermis fra dermis og isolerer intakte epitelark18. - Etter dispase inkubasjon, utfør en mekanisk de-epithelialization14 med en gummipolitimann (se Materialtabell). Bekreft de-epitelialisering ved mikroskopi visualisering.
MERK: Prosessen med de-epitelisering bekreftes i et omvendt mikroskop ved hjelp av 4x og 20x mål. Visualiser vevet for å utelukke tilstedeværelsen av et cellulært lag. - Vask AM i en petriskål med 10 ml BSS i 2 min. Hell BSS i et beger.
- Plasser de-epithelialized AM (dAM) i et 2 ml mikrosentrifugerør. Senk dAM i flytende nitrogen i 40 minutter.
- Jord den frosne dAM manuelt i 2-3 minutter i en forkjølt mørtel ved -85 °C til et fint pulver er oppnådd.
- I mørtelen oppløses dAM-pulveret med 2,5 ml proteaseinhibitorløsning (BSS med proteasehemmere).
Hver tablett proteasehemmer består av følgende blanding av enzymer: bukspyttkjertelekstrakt (0,02 mg/ml), termolysin (metalloprotease) (0,0005 mg/ml), chymotrypsin (0,002 mg/ml), trypsin (0,02 mg/ml) og papain (0,33 mg/ml) (se materialtabell). - Samle blandingen med en mikropipette, og rengjør mørtelveggene ved hjelp av en skalpellkniv. Plasser blandingen i et 5 ml rør.
- Bland godt med virvelen i 30 s.
- Homogeniser vevsblandingen ved sentrifugering ved 34 x g i 20 minutter ved 4 °C og sentrifuge umiddelbart ved 3360 x g i 20 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten som samles inn er AME (figur 1). Oppbevar 0,7 ml av hver AME i forskjellige 2 ml mikrosentrifugerør i 6, 12, 20 og 33 dager ved de forskjellige temperaturforholdene på -20 °C, 4 °C og romtemperatur (RT).
Figur 1: Prosess for AME-preparering og lumikankonsentrasjonsmåling . 100 mg additiv tilvirkning ble inkubert med dispase II ved 37 °C i 30 minutter og mekanisk deepitelisert. Den de-epithelialiserte AM ble vasket og nedsenket i flytende nitrogen i 40 minutter, og deretter knust til et fint pulver ble oppnådd, som ble oppløselig med 2,5 ml saltvannsbuffer med proteasehemmere og sentrifugert. Supernatanten ble samlet og lagret ved -20 °C, 4 °C og RT i 6, 12, 20 og 32 dager til total protein- og lumikankvantifisering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. AME-proteinkvantifisering
MERK: Kvantifiseringen av totalt protein i AME må utføres umiddelbart etter obtensjon. Kvantifiser proteiner ved hjelp av Lowry proteinanalyse og følg produsentens instruksjoner (se Materialtabell). Det anbefales at alle standarder og prøver analyseres i tre eksemplarer.
- Pipette 40 μL av hver prøve av AME i en 96-brønns mikroplate.
- Forbered en standardkurve i samme mikroplate ved hjelp av bovin serumalbumin (BSA) standard for en endelig BSA-konsentrasjon på 0-1,500 μg / ml (0, 1, 5, 25, 125, 250, 500, 750, 1,000 og 1,500 μg / ml).
- Pipette 200 μL av det modifiserte Lowry-reagenset til hver brønn. Bland den umiddelbart på en plateblander i 30 s.
- Dekk mikroplaten med aluminiumsfolie og inkuber den på RT i 10 minutter.
- Pipette 20 μL av 1x Folin-Ciocalteu reagens til hver brønn. Bland den umiddelbart på en plateblander i 30 s.
MERK: For å fremstille 1x Folin-Ciocalteu reagens, fortynn 2x (2N) reagens 1: 1 med ultrarent vann. Forbered 1x Folin-Ciocalteu reagens på samme bruksdag som det fortynnede reagenset er ustabilt. - Dekk mikroplaten fra lys med aluminiumsfolie og inkuber den ved RT i 30 min.
- Mål absorpsjonen av prøver ved 660 nm i et ELISA-platespektrometer (se materialtabell).
MERK: Farge kan måles ved bølgelengder mellom 650 nm og 750 nm. - Gjennomsnittlig 660 nm absorbansverdi for standard blanke prøver og trekk den fra andre 660 nm verdier av standard og ukjente prøver.
- Mål absorbansen med et ELISA-platespektrometer i endepunktmodus med lav risting i 10 s.
- Bruk standardkurven til å bestemme proteinkonsentrasjonen til hver ukjent prøve.
- For beregning av protein, bestem konsentrasjonen fra en lineal regresjonsgraf ved å bruke absorbansverdiene på Y-aksen mot konsentrasjonene i mg / ml på X-aksen for hver standard BSA-kurve.
- Oppnå ligningen for lineær regresjon og r-verdi for å beregne proteinkonsentrasjonen.
MERK: Resultatene uttrykkes som normaliserte relative konsentrasjonsverdier av totalt protein i forhold til mg AM (μg / ml protein / mg AM vev).
- Oppnå ligningen for lineær regresjon og r-verdi for å beregne proteinkonsentrasjonen.
3. Kvantifisering av Lumican i AME
MERK: Konsentrasjonen av lumikan må måles i AME lagret ved forskjellige lagringsforhold og tidsperioder. Kvantifiser lumican ved hjelp av sandwich ELISA og følg produsentens instruksjoner. Det anbefales at alle standarder og prøver analyseres i duplikat.
- Fortynn det humane lumikanfangstantistoffet (se materialtabell) til den anvendte konsentrasjonen i fosfatbufret saltvann (PBS).
MERK: Hetteglasset med fangstantistoff inneholder 120 mikrogram antistoff. Etter rekonstituering med 0,5 ml PBS, fortynn fangstantistoffet i en arbeidsløsning på 2 μg/ml.- Pipetter umiddelbart 100 μL per brønn av det fortynnede fangstantistoffet til en 96-brønns mikroplate. Omslutt platen og inkuber den over natten på RT.
- Aspirer hver brønn og vask den ved pipettering med 300 μL vaskebuffer: 0,05 % polyoksyetylensorbitanmonolaurat 20 i PBS, pH 7,2-7,4 (se materialtabell) ved bruk av en flerkanals pipetter. Gjenta tre ganger.
MERK: Etter siste vask, fjern eventuell gjenværende vaskebuffer ved å gå på tallerkenen og bank den forsiktig mot papirhåndklær. - Blokker plater ved å tilsette 300 μL reagensfortynningsmiddel: 1% BSA i PBS, pH 7,2-7,4, 0,2 μm filtrert (se materialtabell) til hver brønn. Inkuber ved RT i 1 time.
- Gjenta trinn 2.
- Forbered en standardkurve i en 96-brønns mikroplate ved hjelp av to ganger serielle fortynninger fra 0-8,000 pg / ml for endelige konsentrasjoner på 125, 250, 500, 1,000, 2,000, 4,000 og 8,000 pg / ml. ELISA lumican-settet inneholder en rekombinant lumikanstandard på 75 ng (se materialtabell).
- Tilsett 100 μL prøver og standardkurven i fangstantistoffbelagt 96-brønns mikroplate.
- Dekk mikroplaten og inkuber i 2 timer ved RT med lav omrøring i en kompakt rocker som opprettholder hastigheten mellom 2-3 o / min.
- Gjenta trinn 2.
- Tilsett 100 μL av det biotinylerte deteksjonsantistoffet (se materialtabell) til hver brønn. Dekk til fra lys og inkuber 2 timer ved RT med lav omrøring i en kompakt rocker som opprettholder hastigheten mellom 2-3 o / min.
MERK: Hetteglasset med biotinylert deteksjonsantistoff inneholder 24 mikrogram antistoff. Etter rekonstituering med 1,0 ml reagensfortynningsmiddel fortynnes det biotinylerte deteksjonsantistoffet i en arbeidsløsning på 400 ng/ml. - Gjenta trinn 2.
- Tilsett 100 μL av arbeidsfortynningen av streptavidin-pepperrotperoksidase (HRP, se materialtabell) til hver brønn. Dekk mikroplaten fra lys og inkuber i 20 min ved RT.
MERK: Den reaktive streptavidin-HRP var 40 ganger konsentrert. Arbeidsløsningen 1x streptavidin- HRP ble laget med reagensfortynningsmiddel.
NOTAT: Unngå å plassere platen i direkte lys. - Gjenta trinn 2.
- Til slutt tilsett 100 μL substrattetrametylbenzidin (TMB, se materialtabell) løsning til hver brønn.
MERK: Klargjør TMB-oppløsning med et likt volum stabilisert hydrogenperoksid 30% oppløsning som følger med i settet.
MERK: Klargjør oppløsningen umiddelbart før bruk og oppretthold den ved romtemperatur. - Inkuber i 30 minutter på RT på et mørkt sted.
NOTAT: Unngå å plassere platen i direkte lys. Ikke aspirer TMB-oppløsningen, da det ikke er nødvendig med ytterligere vask. - Tilsett 50 μL 1N H2SO4 stoppløsning for å stoppe kolorimetrisk reaksjon. Knips forsiktig på platen for å sikre grundig blanding.
- Bestem umiddelbart absorbansen til hver brønn ved hjelp av en mikroplateleser satt til 450 nm i et ELISA-platespektrometer.
- Mål absorbansen med et ELISA-platespektrometer i endepunktmodus med lav risting i 10 s.
- Gjennomsnittlig absorbansverdi på 450 nm for standard blanke prøver og trekk den fra andre 450 nm verdier av standard og ukjente prøver.
- Bruk standardkurven til å bestemme lumikankonsentrasjonen til hver ukjent prøve.
- For beregning av lumikankonsentrasjon, lag en linjeregresjonsgraf ved å bruke absorbansverdiene på Y-aksen mot konsentrasjonene i pg / ml på X-aksen for hver standard lumikankurve.
- Oppnå ligningen for lineær regresjon og r-verdi for å beregne lumikankonsentrasjonen.
MERK: Konsentrasjonen av lumikan ble normalisert med hensyn til mg vev ekstrahert. Resultatene uttrykkes som normaliserte relative konsentrasjonsverdier for lumikan til mg AM (ng/ml lumikan/mg am-vev).
- Oppnå ligningen for lineær regresjon og r-verdi for å beregne lumikankonsentrasjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene rapporteres som middelverdi ± standardavvik (SD). Student t-tester og variansanalyse (ANOVA) ble utført. P-verdier < 0,05 ble ansett som statistisk signifikante. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av statistikkprogramvare (se Materialtabell).
Den totale proteinmengden i AME ble påvirket av tid og lagringsforhold. Den basale proteinkonsentrasjonen var lik blant alle AME; området for totalt protein var 2,7 ± 0,3 μg/ml uten signifikant forskjell mellom de evaluerte prøvene. Men når prøvene ble lagret i 12, 20 og 32 dager, ble det observert variasjon i proteinkonsentrasjon med hensyn til basal konsentrasjon. Interessant nok økte proteinkonsentrasjonen i AME ved 4 ° C og -20 ° C med hensyn til RT til enhver tid for lagring.
På samme måte, når proteinkonsentrasjonen ble sammenlignet mellom lagringstider, endret den seg etter 12, 20 og 32 dager. En signifikant forskjell (p < 0,05) ble funnet i AME på 32 og 20 dager ved 4 °C og -20 °C sammenlignet med RT-tilstanden (figur 2), noe som tyder på at temperatur er viktig for proteinbevaring i de forskjellige oppnådde AME.
Figur 2: Total proteinkonsentrasjon i AME påvirket av tid og lagringstemperatur. Konsentrasjonen av proteinekstraksjon på AME ble kvantifisert før og etter temperatur- og tidslagringsforhold. Lagringstiden som ble evaluert var 6 dager (svarte trekanter), 12 dager (rosa trekanter), 20 dager (lilla firkant) og 32 dager (brune sirkler) sammenlignet med tre forskjellige temperaturforhold (RT °C, 4 °C og -20 °C). Basal proteinkonsentrasjon var lik blant alle AME. Det var en signifikant forskjell i proteinkonsentrasjon i AME på 20 og 32 dager med hensyn til basalproteinkonsentrasjon ved forskjellige temperaturforhold. I hver tilstand n = 3. Data uttrykkes som median av μg/ml protein ± SE *p < 0,05 (S1 32 dager vs. S1 20, 12 og 6 dager ved 4 °C); (S1 32 dager vs. S1 20, 12 og 6 dager ved -20 °C). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Lumicankonsentrasjonen ble påvirket av lagringstid og temperaturforhold. Færre konsentrasjoner av lumikan ble funnet i AME lagret i 6, 20 og 32 dager, sammenlignet med 12 dagers lagring. Signifikant hadde AME på 12 dager en høyere konsentrasjon av lumikan enn 20 og 32 dagers lagring (p < 0,05).
Når lumikankonsentrasjonen i AME ble sammenlignet mellom lagringstemperaturer, ble det funnet en høyere konsentrasjon av lumikan ved -20 °C og 4 °C i 12 dager (figur 3). Interessant nok ble det funnet en høyere (p < 0,05) konsentrasjon av lumikan i de 12 dagene AME hvis den ble lagret ved -20 ° C sammenlignet med 4 ° C.
Dette antyder at konsentrasjonen av lumikan påvirkes av temperaturforhold og lagringstid, noe som tyder på at riktig lagringstid og temperatur for å oppnå den høyeste konsentrasjonen av lumikan er 12 dager ved -20 ° C.
Figur 3: Total lumikankonsentrasjon ved AME påvirket av tid og lagringstemperatur. Lumicankonsentrasjonen ble påvirket av lagringstid og temperaturforhold. Konsentrasjonen av lumikan i AME ble kvantifisert før og etter temperatur- og tidslagringsforhold. Lagringstiden som ble evaluert var 6 dager (svarte trekanter), 12 dager (rosa trekanter), 20 dager (lilla firkant) og 32 dager (brune sirkler) sammenlignet med tre forskjellige temperaturforhold (RT °C, 4 °C og -20 °C). Lumican i AME på 12 dager var signifikant høyere sammenlignet med AME på 32, 20 og 6 dager, ved temperaturforhold på -20 °C og 4 °C. *p < 0,05 (S1 12 dager vs. S1 32, 20 og 6 dager ved 4 °C); p < 0,001 (S1 12 dager vs. S1 32, 20 og 6 dager ved -20 °C). Den høyeste konsentrasjonen av lumikan i AME var ved 12 dager lagret ved -20 °C. ++p < 0,01 (S1 12 dager 4 °C vs. S1 12 dager -20 °C). Det var ingen signifikant forskjell mellom lumikan i AME på 32 og 20 dager sammenlignet med lagringstemperaturforhold (n.s). Ved hver tilstand (n = 3) uttrykkes data som median av ng/ml protein. Data ble normalisert med hensyn til mg vev ± SE. (n.s.) ikke statistisk signifikans. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien ble tilstedeværelsen av lumikan analysert i AME og dens direkte korrelasjon med stabiliteten under forskjellige lagringsforhold. Interessant, når den totale proteinkonsentrasjonen i AME ble kvantifisert, økte proteinkonsentrasjonen etter lagring. Bevis tyder på tre mekanismer som kan endre proteinkonsentrasjonen i frossen lagring: kald denaturering, den frosne konsentrasjonen av løsemidler og isindusert delvis utfoldelse av proteinstruktur19. Fryseprosessen kan påvirke proteinkonsentrasjonen på lagringsprøver på grunn av krystalliseringen av væskefasen i prøven. Resultatene tyder på at dette kunne ha skjedd som en prosess med å fryse konsentrasjonen, påvirket av lagringstiden i fryseren. En høyere konsentrasjon av proteiner ble observert ved lengre lagringstider (32 og 20 dager) og ved de kaldeste temperaturene (4 °C og -20 °C). Perioden med den høyeste konsentrasjonen av protein hadde imidlertid ikke den høyeste konsentrasjonen av lumikan; Dette antyder at Lumikan kan påvirkes av frosne temperaturer og tidsforhold.
Ifølge resultatene var lumikankonsentrasjonen høyere og mer stabil ved 12 dagers lagring ved 4 °C og -20 °C. Likevel ble det funnet en mindre konsentrasjon av lumikan på 6 dager sammenlignet med 12 dager. Noen rapporter tyder på at proteinkonsentrasjonen kan endres etter frosne lagringsforhold20. Resultatene kan skyldes en termodynamisk mekanisme kalt isindusert delvis utfoldelse av proteinstruktur, som skjer under frysing av prøver. Samspillet mellom proteiner og vann i de vandige løsningene reduserer samspillet med andre molekyler. Krystalliseringsprosessen av vann under frosne forhold tillater proteiner og noen funksjonelle regioner å samhandle med andre molekyler19. Ved det ovennevnte, etter 12 dager med frysing av lumikan i en vandig løsning, kan det være i stand til å interagere med antistoffene som er tilstede i ELISA-kvantifiseringssettet for å resultere i en høyere konsentrasjon. På den annen side, sannsynligvis på den sjette dagen, kunne lumican ha vært bortgjemt i den vandige løsningen.
I å fremme innovasjoner er bruken av AM den toppmoderne behandlingen for hornhinde-reepitelisering uavhengig av etiologi. Som nevnt er fordelene med AM enorme 21,22,23,24,25,26. Mange forfattere har vist fordelene med lumikan i AME, noe som gjør det til et rimelig alternativ spesielt for utviklingsland 1,2,3,4,5,6,7,8,9. For tiden er det mange fordeler med lumikan i AME; Dens bruk som behandling favoriserer hornhinde-reepitelialisering og forbedrer prognosen for hornhinnenesår 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. AM-transplantasjon (AMT) har blitt en behandling med store fordeler for å forbedre ulike hornhinnesykdommer24,25. Imidlertid er det noen kroniske følelser av hornhinnevevet, for eksempel vedvarende epiteldefekter (PED) og limbale stamcellemangler (LESCD), som krever konstant behandling og vedlikehold av tilstedeværelsen av biologiske faktorer som hjelper hornhindereparasjon21,24. For tiden er det ingen adjuvante behandlinger som tillater langsiktig vedlikehold av faktorene som frigjøres av AMT på hornhinnen. En konstant erstatning av AMT kunne imidlertid ikke anbefales for pasientsikkerhet26. Av denne grunn er det nødvendig å utvikle alternativer som gjør at AMTs funksjoner kan hjelpe og bidrar til å opprettholde tilstedeværelsen av faktorer som frigjøres av AM i hornhinnevevet som lumikan i lengre tid, med den hensikt å favorisere behandlingen av vedvarende problemer i hornhinnen27.
Lumican er en av faktorene som er tilstede i AM med antiinflammatoriske og antifibrotiske funksjoner, som har blitt rapportert å ha funksjoner i hornhinnenreparasjonsprosessen 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Det er derfor lumikan foreslår å være en god kandidat til å hjelpe til med å behandle hornhindekjærlighet; Imidlertid er det nødvendig med ytterligere forskning for å bestemme effekten av lumikan i AME for å oppnå hornhinde-reepitelialisering.
Lumican er et proteoglykan som har vist seg å regulere sekresjonen av ekstracellulære matriksforbindelser som kollagen; Det er også involvert i fibroblastaktivering og modulering av inflammatoriske celler og angiogeneseprosessen, som har en viktig rolle i sårheling. Ifølge resultatene kan lumikan ekstraheres fra AM-vev. Terapeutiske anvendelser av lumikan er mange; bruk av lumikan i AME tillater et oppnåelig terapeutisk alternativ for okulære lidelser 4,13. Den primære fordelen med å bruke AME er at den gir en enkel applikasjon som en aktuell behandling for den okulære overflaten, gitt dens vandige sammensetning. På samme måte kan andre proteiner med antiinflammatoriske og immunregulerende egenskaper finnes i komponentene ekstrahert fra AM-vevet, noe som kan gi en større fordel ved behandling av de-epithelialiserende problemer i øyet. For eksempel har andre antiinflammatoriske faktorer som TSG-6 tilstede i AM og cellulære komponenter tidligere blitt rapportert å ha immunregulerende egenskaper8. Herved kan en kombinert terapi av lumikan og andre ekstracellulære matriksforbindelser og immunmodulerende molekyler tilstede i AME være nyttig i reepiteliserings- og sårhelingsprosessen.
Denne metoden tar sikte på å demonstrere en enkel teknikk for proteinekstraksjon, nyttig for obtention av bountiful proteiner og faktorer. En av de kritiske hensynene til denne metoden er bruken av proteasehemmere, da det er grunnleggende for vellykket proteinekstraksjon, da AM er et vev med masse enzymatiske forbindelser for å forhindre proteinnedbrytning27. Bevis har rapportert at bruk av proteinhemmere sammen med en vandig løsning øker ekstraksjonen av andre faktorer, som HGF, i AM-vev26. Obtensjonen av et fint pulver etter frysing og jording av AM er nødvendig for optimal obtensjon av AME, da denne prosessen er egnet for vev og cellulær forstyrrelse av strukturer som trengs for ekstraksjon av cytosoliske og andre kjernefysiske forbindelser28,29.
Noen begrensninger ved denne ekstraksjonsmetoden er at AM-mengden som ble brukt, ikke kunne tillate en høyskala ekstraksjon. Denne protokollen tillater proteinekstraksjon fra en begrenset mengde vev; siden det ikke er bevis for at denne metoden tillater å oppnå en større mengde protein fra et større vevsområde. Feilsøking for å bli vurdert i forhold til andre ekstraksjonsmetoder er å bruke en passende konsentrasjon av proteasehemmer og inkubasjonstid, da overskytende enzymer kan påvirke proteiner30 og redusere teknikkens effekt.
En del av denne teknikken ble modifisert fra det som ble rapportert av Mahbod et al.16, som beskriver at gjentakelse av sentrifugerings- og ekstraksjonsprosessen øker proteinekstraksjonen. I motsetning til Mahbod rapporterte resultatene ikke proteinkonsentrasjon etter tre sykluser med sentrifugering. Når den totale proteinkonsentrasjonen ble bestemt, ble den redusert med 80% i en andre ekstraksjon og opptil 97% i en tredje ekstraksjon. Å utføre bare en ekstraksjon reduserer behandlingstiden og reduserer ikke mengden totalt protein. Med det foregående krever ekstraksjonsmetoden som er rapportert her bare ett sentrifugeringstrinn med gunstige resultater.
Denne teknikken kan brukes til å trekke ut andre faktorer og proteiner som er tilstede i AM og videre, for å skaffe faktorer fra andre kilder som dyr eller grønnsaker. Det kan også ha en applikasjon for å skaffe proteiner til å utføre grunnforskning eller til og med utvikling av formuleringer og behandlinger.
Disse resultatene tyder på at lumikan kan ekstraheres fra AM og lagres i 12 dager som AME under både -20 ° C og 4 ° C temperaturforhold. Det er viktig å vurdere halveringstiden for å oppnå de terapeutiske effektene av lumikan som AME. Ytterligere studier er nødvendig for å bestemme rollen som AME lumikan i hornhinneepitelceller og for å bestemme den ideelle dosen av lumikan for hornhinde-reepitelialisering.
Avslutningsvis antyder resultatene at det er mulig å oppnå faktorer som lumikan i AME. På samme måte påvirker temperatur- og lagringstidsforhold konsentrasjonen av lumikan som er tilstede i AME.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Studien ble finansiert av støtteprogrammet for forsknings- og teknologiske innovasjonsprosjekter fra Universidad Nacional Autonoma de Mexico (Grant No. PAPIIT IN203821), og Ministry of Education, Science, Technology and Innovation (Grant No. SECTEI 250/2019).
Acknowledgments
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N H2SO4 stop solution | R&D Systems | DY994 | |
| 100 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 1000 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 15 mm Petri dish | Symlaboratorios | ||
| 18 G Needle (1.2 mm x 40 mm) | BD Becton Dickinson | 305211 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | Z606340 | |
| 20 mL plastic syringe | BD Becton Dickinson | 302562 | |
| 20 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 20-200 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30119401 | |
| 96-well microplate | SARSTEDT | 821581 | |
| Aluminum foil | N/A | N/A | |
| Amniotic membrane | Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank | 100 mg | |
| Balanced salt solution | Bausch + Lomb | BSS-403802 | |
| Beaker | N/A | N/A | |
| BioRender | BioRender | figures design | |
| Compact Rocker | BioRad | 970822DD | Mod. 5202SD-BIO |
| complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail tablets |
Roche | 11 873 580 001 | Protease Inhibitor |
| Daiggner vortex Genie 2 | A.Daigger & Co. , INC | 22220A | |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | |
| ELISA plate spectrometer | Thermo Labsystems | 35401106 | Multiscan |
| Freezer | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc | version 9 | statistical analysis and graphic program |
| Human lumican DuoSet ELISA kit | R&D Systems | DY2846-05 | includes human Lumican capture antibody |
| Incubator | Forma Scientific | 3326 S/N 36481-7002 | |
| Inverted light Microscope | Olympus | 6A13921 | to confirm de-epithelialization Mod.CK2 |
| Laminar flow hood | Forma Scientific | 14753-567 | Mod.1184 |
| Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
| Mortar | N/A | N/A | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | ||
| Nitrogen Tank | Thermo Scientific | Mod. Biocan 20 | |
| Paper towels | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | R&D Systems | DY006 | |
| Pierce Modified Lowry Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23240 | |
| Plate sealers | R&D Systems | DY992 | |
| Reagent diluent | R&D Systems | DY995 | 1% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered |
| Refrigerated centrifuge | centurion scientific Ltd | 15877 | Mod. K2015R |
| Rubber policeman cell scraper | NEST | 710001 | for mechanical de-epithelialization |
| Scalpel knife | Braun | BB521 | No. 10 or 21 |
| Streptavidin-HRP 40-fold concentrated | R&D Systems | part 893975 | |
| Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solution | R&D Systems | DY999 | |
| Toothed tweezers | Invent Germany | 6b | inox |
| Ultrapure water | PISA | ||
| Wash buffer | R&D Systems | WA126 | 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4 |
References
- Jirsova, K., Jones, G. Amniotic membrane in ophthalmology: properties, preparation, storage and indications for grafting-a review. Cell and Tissue Banking. 18 (2), 193-204 (2017).
- Witherel, C., Yu, T., Concannon, M., Dampier, W., Spiller, K. Immunomodulatory effects of human cryopreserved viable amniotic membrane in a pro-inflammatory environment in vitro. Cellular and Molecular Bioengineering. 10 (5), 451-462 (2017).
- Ruiz-Cañada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating transforming growth factor-β signalling. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 808-820 (2017).
- Yeh, L., et al. Soluble lumican glycoprotein purified from human amniotic membrane promotes corneal epithelial wound healing. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (2), 479 (2005).
- Navas, A., et al. Anti-Inflammatory and anti-fibrotic effects of human amniotic membrane mesenchymal stem cells and their potential in corneal repair. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 906-917 (2018).
- Magaña-Guerrero, F., Domínguez-López, A., Martínez-Aboytes, P., Buentello-Volante, B., Garfias, Y. Human amniotic membrane mesenchymal stem cells inhibit neutrophil extracellular traps through TSG-6. Scientific Reports. 7, 12426 (2017).
- Garfias, Y., Zaga-Clavellina, V., Vadillo-Ortega, F., Osorio, M., Jimenez-Martinez, M. Amniotic membrane is an immunosuppressor of peripheral blood mononuclear cells. Immunological Investigations. 40 (2), 183-196 (2010).
- Koob, T., et al. Biological properties of dehydrated human amnion/chorion composite graft: implications for chronic wound healing. International Wound Journal. 10 (5), 493-500 (2013).
- Miyagi, H., Thomasy, S., Russell, P., Murphy, C. The role of hepatocyte growth factor in corneal wound healing. Experimental Eye Research. 166, 49-55 (2018).
- Chen, S., Mienaltowski, M., Birk, D. Regulation of corneal stroma extracellular matrix assembly. Experimental Eye Research. 133, 69-80 (2015).
- Karamanou, K., Perrot, G., Maquart, F., Brézillon, S. Lumican as a multivalent effector in wound healing. Advanced Drug Delivery Reviews. 129, 344-351 (2018).
- Theocharis, A., et al. Cell-matrix interactions: focus on proteoglycan-proteinase interplay and pharmacological targeting in cancer. FEBS Journal. 281 (22), 5023-5042 (2014).
- Saika, S., et al. Role of lumican in the corneal epithelium during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 275 (4), 2607-2612 (2000).
- Domínguez-López, A., et al. Amniotic membrane conditioned medium (AMCM) reduces inflammatory response on human limbal myofibroblast, and the potential role of lumican. Molecular Vision. 27, 370-383 (2021).
- Vij, N., Roberts, L., Joyce, S., Chakravarti, S. Lumican regulates corneal inflammatory responses by modulating Fas-Fas Ligand signaling. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (1), 88 (2005).
- Mahbod, M., et al. Amniotic membrane extract preparation: What is the best method. Journal of Ophthalmic and Vision Research. 9 (3), 314-319 (2014).
- Chávez-García, C., et al. Ophthalmic indications of amniotic membrane transplantation in Mexico: an eight years Amniotic Membrane Bank experience. Cell and Tissue Banking. 17 (2), 261-268 (2015).
- Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
- Bhatnagar, B. S., Bogner, R. H., Pikal, M. J. Protein stability during freezing: separation of stresses and mechanisms of protein stabilization. Pharmaceutical Development and Technology. 12 (5), 505-523 (2007).
- McClain, A. K., McCarrel, T. M. The effect of four different freezing conditions and time in frozen storage on the concentration of commonly measured growth factors and enzymes in equine platelet-rich plasma over six months. BMC Veterinary Research. 15 (1), 292 (2019).
- Tamhane, A., et al. Evaluation of amniotic membrane transplantation as an adjunct to medical therapy as compared with medical therapy alone in acute ocular burns. Ophthalmology. 112 (11), 1963-1969 (2005).
- Shtein, R., et al. Autologous serum-based eye drops for treatment of ocular surface disease. Ophthalmology. 127 (1), 128-133 (2020).
- Shahriari, H., Tokhmehchi, F., Reza, M., Hashemi, N. Comparison of the effect of amniotic membrane suspension and autologous serum on alkaline corneal epithelial wound healing in the rabbit model. Cornea. 27 (10), 1148-1150 (2008).
- Schuerch, K., Baeriswyl, A., Frueh, B., Tappeiner, C. Efficacy of amniotic membrane transplantation for the treatment of corneal ulcers. Cornea. 39 (4), 479-483 (2019).
- Chen, H., et al. Amniotic membrane transplantation for persistent corneal ulcers and perforations in acute fungal keratitis. Cornea. 25 (5), 564-572 (2006).
- Guo, Q., et al. A comparison of the effectiveness between amniotic membrane homogenate and transplanted amniotic membrane in healing corneal damage in a rabbit model. Acta Ophthalmologica. 89 (4), 315-319 (2011).
- Sabater, A., Perez, V. Amniotic membrane use for management of corneal limbal stem cell deficiency. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 363-369 (2017).
- Ahmad, T., et al. Autolysis of bovine skin, its endogenous proteases, protease inhibitors and their effects on quality characteristics of extracted gelatin. Food Chemistry. 265, 1-8 (2018).
- Mullegama, S. V., et al. Nucleic acid extraction from human biological samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
- Skog, M., et al. The effect of enzymatic digestion on cultured epithelial autografts. Cell Transplantation. 28 (5), 638-644 (2019).
