Summary
Detta protokoll beskriver extraktionen av lumikan från fosterhinnan (AM) och deras lagringsförhållanden som AM-extrakt (AME) vid -20 ° C, 4 ° C och rumstemperatur (RT) i 6, 12, 20 och 32 dagar för att kvantifiera dess proteiner och lumikankoncentration.
Abstract
Lumican är en liten leucinrik proteoglykan i det mänskliga fosterhinnan (AM) som främjar hornhinneepitelisering och organisering av kollagenfibrer, vilket upprätthåller hornhinnans transparens. I det aktuella arbetet föreslås en metod för proteinextraktion från AM för att erhålla lumican. Dessutom utvärderas stabiliteten hos lumican i AM-extraktet (AME) som lagras vid olika temperaturer och tidsperioder. 100 mg AM tinades och mekaniskt de-epiteliserades. Den de-epiteliserade AM frystes och krossades tills ett fint pulver erhölls, vilket solubiliserades med 2,5 ml saltlösningsbuffert med proteashämmare och centrifugerades för proteinextraktion. Supernatanten samlades in och lagrades vid -20 °C, 4 °C och rumstemperatur (RT) i 6, 12, 20 och 32 dagar. Därefter kvantifierades lumican i varje AME. Denna teknik möjliggör ett tillgängligt och förvärvbart protokoll för lumikanextraktion från AM. Lumicankoncentrationen påverkades av lagringstid och temperaturförhållanden. Lumican i AME på 12 dagar lagrad vid -20 °C och 4 °C var signifikant högre än annan AME. Denna lumican extraktion kan vara användbar för att utveckla behandlingar och farmaceutiska lösningar. Ytterligare studier behövs för att bestämma användningen av AME lumican i re-epitelisering och sårläkningsprocess.
Introduction
En av de mest använda behandlingarna för hornhinnans känslor är fosterhinnetransplantation; Under de senaste åren har dock nya förslag dykt upp för att använda olika komponenter i fostervävnad som alternativa och adjuvansbehandlingar. Bland de mest studerade komponenterna i additiv tillverkning är de som erhållits från AM-extraktet (AME)1,2,3,4,5,6,7. AM innehåller flera lösliga faktorer såsom antiangiogena proteiner, interleukiner (IL), vävnadshämmare av metalloproteinaser (TIMPs), antiinflammatoriska proteiner medierade av TSG-6 som hämmar neutrofila extracellulära fällor, tillväxtfaktorer: epidermal tillväxtfaktor (EGF), transformerande tillväxtfaktor (TGF) (alfa och beta), keratinocyttillväxtfaktor (KGF), hepatocyttillväxtfaktor (HGF) och lumican, som upprätthåller hornhinnans transparens genom att reglera kollagenfibrillogenes1, 2,3,4,5,6,7,8,9.
Lumican är en liten leucinrik proteoglykan (SLRP), en av de viktigaste extracellulära komponenterna i interstitiellt kollagenas i hornhinnans stromamatris, ansvarig för att organisera kollagenfibrer och upprätthålla hornhinnans transparens 4,10,11. Proteoglykaner är molekyler i den extracellulära matrisen (ECM), som är de viktigaste för att utföra cellsignalering och upprätthålla intracellulär homeostas12. ECM-proteiner har rapporterats driva de cellulära processerna för spridning, differentiering och migration under sårläkning11.
Bevis indikerar lumicans möjliga deltagande i processen med hornhinnans re-epitelisering. Saika et al., i en studie, visade att lumican efter en hornhinneskada kunde detekteras i hornhinnekeratocyter mellan de första 8 timmarna och upp till 3 dagar efter skada. Denna proteoglykan presenterar den högsta koncentrationen av lumikan på andra och tredje dagen och är därefter omöjlig att upptäcka den sjunde dagen13. Dessa data tyder på lumicans deltagande i aktiveringen av hornhinnans re-epiteliseringsprocess. Å andra sidan, i en annan studie, rapporterades att frånvaron av lumican försenar re-epitelisering; Intressant nog kan tillägg av Lumican påskynda re-epiteliseringsprocessen 4,11,13. På samma sätt har en ny studie rapporterat att lumican kan modulera de inflammatoriska funktionerna hos hornhinnan limbus fibroblaster14, vilket tyder på en roll för lumican som en modulator för det inflammatoriska, antifibrotiska och re-epiteliserande svaret. På samma sätt kan lumican modulera hornhinnans svar genom att interagera med signalmolekyler som Fas-FasL. Frånvaron av lumican i en knockout Lum-/- musmodell visade också att bristen på lumicansignalering förhindrar adekvat hornhinnereparation15.
I första hand syftar denna metod till att visa ett genomförbart och lättillgängligt sätt att extrahera lumican från AM. Med denna fördelaktiga metod för lumikanextraktion är det möjligt att erhålla liknande koncentrationer av proteiner, vilket minskar bearbetningstiden och gör det bekvämare för utredare jämfört med tidigare studier16. Dessutom kan denna AME-lumikan användas som ett adjuvans för hornhinnereparation och re-epiteliseringsprocesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla försöksförfaranden godkändes av den institutionella granskningsnämnden (projekt nr CEI-2020/06/04). AM erhölls från Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana amnion bank (från avidentifierade mänskliga ämnen), som är beredd enligt beskrivningen av Chávez-García et al.17.
1. Beredning av fosterhinneextraktet
- Få 100 mg AM från amnionbanken.
OBS: Enligt en tidigare rapport utsöndrar 50 mg AM totalt 10 ng/ml lumikan14. För att få en högre koncentration av lumican, använd 100 mg AM, vilket motsvarar en total yta på 32 cm2. - Om AM är frusen, tina den vid rumstemperatur.
OBS: Utför följande procedurer under en laminär flödeshuv klass II B. - Tvätta AM i en petriskål med 10 ml steril balanserad saltlösning (BSS, se materialtabell) i 2 minuter.
- Häll BSS i en bägare.
- Upprepa steg 3 och bekräfta visuellt att glycerolmedium inte finns i petriskålen BSS.
OBS: Upprepa steg 3. efter behov tills glycerolmedium inte finns i petriskålen BSS.
- Inkubera AM med 10 ml dispase II (1,7 IE/ml, se materialtabell) vid 37 °C, 5 %CO2 i 30 minuter.
OBS: Dispase II är ett neutralt proteas med mild aktivitet över epitelceller. Detta enzym separerar effektivt den intakta epidermis från dermis och isolerar intakta epitelark18. - Efter dispase inkubation, utför en mekanisk de-epitelisering14 med en gummipolis (se Materialförteckning). Bekräfta de-epitelisering genom mikroskopivisualisering.
OBS: Processen för de-epitelisering bekräftas i ett inverterat mikroskop med 4x och 20x mål. Visualisera vävnaden för att utesluta närvaron av något cellulärt skikt. - Tvätta AM i en petriskål med 10 ml BSS i 2 min. Häll BSS i en bägare.
- Placera den avepiteliserade AM (dAM) i ett 2 ml mikrocentrifugrör. Sänk ner dAM i flytande kväve i 40 minuter.
- Mal den frysta dAM manuellt i 2-3 minuter i en förkyld mortel vid -85 °C tills ett fint pulver erhålls.
- Solubilisera dAM-pulvret i morteln med 2,5 ml proteashämmare (BSS med proteashämmare).
OBS: Varje tablett proteashämmare består av följande blandning av enzymer: bukspottkörtelextrakt (0,02 mg / ml), termolysin (metalloproteas) (0,0005 mg / ml), chymotrypsin (0,002 mg / ml), trypsin (0,02 mg / ml) och papain (0,33 mg / ml) (se materialförteckning). - Samla blandningen med en mikropipett och rengör murbrukväggarna med hjälp av en skalpellkniv. Placera blandningen i ett 5 ml rör.
- Blanda väl med virveln i 30 s.
- Homogenisera vävnadsblandningen genom centrifugering vid 34 x g i 20 minuter vid 4 °C och centrifugera omedelbart vid 3360 x g i 20 minuter vid 4 °C.
- Den supernatant som samlas in är AME (figur 1). Förvara 0,7 ml av varje AME i olika 2 ml mikrocentrifugrör i 6, 12, 20 och 33 dagar vid de olika temperaturförhållandena -20 °C, 4 °C och rumstemperatur (RT).
Figur 1: Process för AME-beredning och mätning av lumikankoncentration. 100 mg AM inkuberades med dispase II vid 37 °C i 30 minuter och deeppilerades mekaniskt. Den avepiteliserade AM tvättades och nedsänktes i flytande kväve i 40 minuter och krossades sedan tills ett fint pulver erhölls, vilket solubiliserades med 2,5 ml saltlösningsbuffert med proteashämmare och centrifugerades. Supernatanten samlades in och lagrades vid -20 °C, 4 °C och RT i 6, 12, 20 och 32 dagar tills total protein- och lumikankvantifiering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. Kvantifiering av AME-protein
ANMÄRKNING: Kvantifieringen av det totala proteinet i AME måste utföras omedelbart efter obtention. Kvantifiera proteiner med Lowry-proteinanalys och följ tillverkarens instruktioner (se Materialförteckning). Det rekommenderas att alla standarder och prover analyseras i tre exemplar.
- Pipettera 40 μL av varje prov av AME till en 96-brunns mikroplatta.
- Bered en standardkurva i samma mikroplatta med hjälp av BSA-standard (bovint serumalbumin) för en slutlig BSA-koncentration på 0–1 500 μg/ml (0, 1, 5, 25, 125, 250, 500, 750, 1 000 och 1 500 μg/ml).
- Pipettera 200 μL av det modifierade Lowry-reagenset till varje brunn. Blanda den omedelbart på en tallriksblandare i 30 s.
- Täck mikroplattan med aluminiumfolie och inkubera den vid RT i 10 minuter.
- Pipettera 20 μL 1x Folin-Ciocalteu-reagens till varje brunn. Blanda den omedelbart på en tallriksblandare i 30 s.
OBS: För att bereda 1x Folin-Ciocalteu-reagens, späd 2x (2N) reagens 1:1 med ultrarent vatten. Bered 1x Folin-Ciocalteu-reagenset samma användningsdag som det utspädda reagenset är instabilt. - Täck mikroplattan från ljus med aluminiumfolie och inkubera den vid RT i 30 minuter.
- Mät provernas absorbans vid 660 nm i en ELISA-plattspektrometer (se materialförteckning).
OBS: Färg kan mätas vid våglängder mellan 650 nm och 750 nm. - Medelvärde för 660 nm absorbansvärdet för standardblindproverna och subtrahera det från andra 660 nm-värden för standardprover och okända prover.
- Mät absorbansen med en ELISA-plattspektrometer i ett slutpunktsläge med låg skakning i 10 s.
- Använd standardkurvan för att bestämma proteinkoncentrationen för varje okänt prov.
- För beräkning av protein, bestäm koncentrationen från ett linealt regressionsdiagram med hjälp av absorbansvärdena på Y-axeln mot koncentrationerna i mg / ml på X-axeln för varje standard BSA-kurva.
- Få ekvationen för linjär regression och r-värde för att beräkna proteinkoncentrationen.
OBS: Resultaten uttrycks som normaliserade relativa koncentrationsvärden för totalt protein i förhållande till mg AM (μg / ml protein / mg AM-vävnad).
- Få ekvationen för linjär regression och r-värde för att beräkna proteinkoncentrationen.
3. Kvantifiering av Lumican i AME
OBS: Koncentrationen av lumican måste mätas i AME som lagras under olika lagringsförhållanden och tidsperioder. Kvantifiera lumican med sandwich ELISA och följ tillverkarens instruktioner. Det rekommenderas att alla standarder och prover analyseras i två exemplar.
- Späd ut den humana lumikaninfångningsantikroppen (se materialförteckningen) till den använda koncentrationen i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
OBS: Infångningsantikroppsflaskan innehåller 120 μg antikropp. Efter beredning med 0,5 ml PBS, späd infångningsantikroppen vid en arbetslösning av 2 μg/ml.- Pipettera omedelbart 100 μL per brunn av den utspädda infångningsantikroppen till en 96-brunns mikroplatta. Bifoga plattan och inkubera den över natten vid RT.
- Aspirera varje brunn och tvätta den genom pipettering med 300 μL tvättbuffert: 0,05% polyoxietylensorbitanmonolaurat 20 i PBS, pH 7,2-7,4 (se materialtabell) med en flerkanalig pipator. Upprepa tre gånger.
OBS: Efter den sista tvätten, ta bort eventuell återstående tvättbuffert genom att sätta på plattan och knacka försiktigt på den mot pappershanddukar. - Blockera plattor genom att tillsätta 300 μL reagensutspädningsmedel: 1% BSA i PBS, pH 7,2-7,4, 0,2 μm filtrerat (se materialtabell) till varje brunn. Inkubera vid RT i 1 h.
- Upprepa steg 2.
- Förbered en standardkurva i en 96-brunns mikroplatta med tvåfaldiga seriella utspädningar från 0-8 000 pg/ml för slutliga koncentrationer på 125, 250, 500, 1 000, 2 000, 4 000 och 8 000 pg/ml. ELISA lumican kit innehåller en rekombinant lumican standard på 75 ng (se Materialförteckning).
- Tillsätt 100 μl prover och standardkurvan i den infångningsantikroppsbelagda 96-brunnsmikroplattan.
- Täck mikroplattan och inkubera i 2 timmar vid RT med låg omrörning i en kompakt vippa som håller hastigheten mellan 2-3 rpm.
- Upprepa steg 2.
- Tillsätt 100 μl av den biotinylerade detektionsantikroppen (se materialförteckningen) till varje brunn. Täck från ljus och inkubera 2 h vid RT med låg omrörning i en kompakt vippa som håller hastigheten mellan 2-3 rpm.
OBS: Den biotinylerade detektionsantikroppsflaskan innehåller 24 μg antikropp. Efter beredning med 1,0 ml reagensspädningsmedel späds antikroppen mot biotinylerad detektion till en arbetslösning av 400 ng/ml. - Upprepa steg 2.
- Tillsätt 100 μl av arbetsutspädningen av streptavidin-pepparrotsperoxidas (HRP, se materialförteckning) till varje brunn. Täck mikroplattan från ljus och inkubera i 20 minuter vid RT.
OBS: Den reaktiva streptavidin-HRP var 40-faldig koncentrerad. Arbetslösningen 1x streptavidin- HRP gjordes med reagensutspädningsmedel.
OBS: Undvik att placera plattan i direkt ljus. - Upprepa steg 2.
- Slutligen tillsätt 100 μL substrattetrametylbenzidin (TMB, se materialförteckning) lösning till varje brunn.
OBS: Förbered TMB-lösningen med en lika stor volym stabiliserad väteperoxid 30% lösning som tillhandahålls i satsen.
OBS: Förbered lösningen omedelbart före användning och håll den vid rumstemperatur. - Inkubera i 30 minuter vid RT på en mörk plats.
OBS: Undvik att placera plattan i direkt ljus. Aspirera inte TMB-lösningen eftersom ingen ytterligare tvätt behövs. - Tillsätt 50 μl 1N H2S04-stopplösning för att stoppa kolorimetrisk reaktion. Knacka försiktigt på plattan för att säkerställa noggrann blandning.
- Bestäm omedelbart absorbansen för varje brunn med hjälp av en mikroplattläsare inställd på 450 nm i en ELISA-plattspektrometer.
- Mät absorbansen med en ELISA-plattspektrometer i ett slutpunktsläge med låg skakning i 10 s.
- Medelvärde för 450 nm absorbansvärdet för standardblindproverna och subtrahera det från andra 450 nm-värden för standardprover och okända prover.
- Använd standardkurvan för att bestämma lumikankoncentrationen för varje okänt prov.
- För beräkning av lumikankoncentrationen, gör ett linealt regressionsdiagram med hjälp av absorbansvärdena på Y-axeln mot koncentrationerna i pg / ml på X-axeln för varje standard lumikankurva.
- Få ekvationen för linjär regression och r-värde för att beräkna lumikankoncentrationen.
OBS: Koncentrationen av lumican normaliserades med avseende på mg extraherad vävnad. Resultaten uttrycks som normaliserade relativa koncentrationsvärden för lumican till mg AM (ng/ml lumican/mg AM-vävnad).
- Få ekvationen för linjär regression och r-värde för att beräkna lumikankoncentrationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultat redovisas som medelvärde ± standardavvikelse (SD). Studentens t-tester och variansanalys (ANOVA) utfördes. P-värden < 0,05 ansågs statistiskt signifikanta. Statistisk analys utfördes med hjälp av statistikprogramvara (se materialförteckning).
Den totala proteinmängden i AME påverkades av tid och lagringsförhållanden. Den basala proteinkoncentrationen var liknande bland alla AME; intervallet för totalt protein var 2,7 ± 0,3 μg/ml utan någon signifikant skillnad mellan de utvärderade proverna. När proverna lagrades i 12, 20 och 32 dagar observerades emellertid variation i proteinkoncentration med avseende på basalkoncentration. Intressant nog ökade proteinkoncentrationen i AME vid 4 ° C och -20 ° C med avseende på RT vid alla lagringstider.
På samma sätt, när proteinkoncentrationen jämfördes mellan lagringstiderna, förändrades den efter 12, 20 och 32 dagar. En signifikant skillnad (p < 0,05) hittades i AME på 32 och 20 dagar vid 4 °C och -20 °C jämfört med RT-tillståndet (figur 2), vilket tyder på att temperaturen är viktig för proteinbevarande i de olika erhållna AME.
Figur 2: Total proteinkoncentration i AME påverkas av tid och lagringstemperatur. Koncentrationen av proteinextraktion på AME kvantifierades före och efter temperatur- och tidslagringsförhållanden. Lagringstiden som utvärderades var 6 dagar (svarta trianglar), 12 dagar (rosa trianglar), 20 dagar (lila fyrkant) och 32 dagar (bruna cirklar) jämfört med tre olika temperaturförhållanden (RT °C, 4 °C och -20 °C). Basal proteinkoncentration var liknande bland alla AME. Det fanns en signifikant skillnad i proteinkoncentration i AME på 20 och 32 dagar med avseende på basal proteinkoncentration vid olika temperaturförhållanden. I varje villkor n = 3. Data uttrycks som median för μg/ml protein ± SE *p < 0,05 (S1 32 dagar jämfört med S1 20, 12 och 6 dagar vid 4 °C); (S1 32 dagar jämfört med S1 20, 12 och 6 dagar vid -20 °C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Lumicankoncentrationen påverkades av lagringstid och temperaturförhållanden. Färre koncentrationer av lumican hittades i AME som lagrades i 6, 20 och 32 dagar, jämfört med 12 dagars lagring. Signifikant hade AME på 12 dagar en högre koncentration av lumican än 20 och 32 dagars lagring (p < 0,05).
När lumikankoncentrationen i AME jämfördes mellan lagringstemperaturer hittades en högre koncentration av lumican om den förvarades vid -20 °C och 4 °C i 12 dagar (figur 3). Intressant nog hittades även en högre (p < 0,05) koncentration av lumican under 12 dagars AME om den förvarades vid -20 ° C jämfört med 4 ° C.
Detta tyder på att koncentrationen av lumican påverkas av temperaturförhållanden och lagringstid, vilket tyder på att lämplig lagringstid och temperatur för att uppnå den högsta koncentrationen av lumican är 12 dagar vid -20 °C.
Figur 3: Total lumikankoncentration i AME påverkas av tid och lagringstemperatur. Lumicankoncentrationen påverkades av lagringstid och temperaturförhållanden. Koncentrationen av lumican i AME kvantifierades före och efter temperatur- och tidslagringsförhållanden. Lagringstiden som utvärderades var 6 dagar (svarta trianglar), 12 dagar (rosa trianglar), 20 dagar (lila fyrkant) och 32 dagar (bruna cirklar) jämfört med tre olika temperaturförhållanden (RT °C, 4 °C och -20 °C). Lumican i AME på 12 dagar var signifikant högre jämfört med AME på 32, 20 och 6 dagar, vid temperaturförhållanden på -20 °C och 4 °C. *p < 0,05 (S1 12 dagar jämfört med S1 32, 20 och 6 dagar vid 4 °C); p < 0,001 (S1 12 dagar jämfört med S1 32, 20 och 6 dagar vid -20 °C). Den högsta koncentrationen av lumican i AME var vid 12 dagar lagrad vid -20 °C. ++p < 0,01 (S1 12 dagar 4 °C jämfört med S1 12 dagar -20 °C). Det fanns ingen signifikant skillnad mellan lumican i AME på 32 och 20 dagar jämfört med lagringstemperaturförhållanden (n.s). I varje tillstånd (n = 3) uttrycks data som medianen för ng/ml protein. Data normaliserades med avseende på mg vävnad ± SE. (n.s.) inte statistisk signifikans. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie analyserades närvaron av lumican i AME och dess direkta korrelation med dess stabilitet under olika lagringsförhållanden. Intressant nog, när den totala proteinkoncentrationen i AME kvantifierades, ökade proteinkoncentrationen efter lagring. Bevis tyder på tre mekanismer som kan förändra proteinkoncentrationen i fryst lagring: kall denaturering, den frusna koncentrationen av lösta ämnen och isinducerad partiell utveckling av proteinstruktur19. Frysningsprocessen kan påverka proteinkoncentrationen på lagringsprover på grund av kristalliseringen av vätskefasen i provet. Resultaten tyder på att detta kan ha inträffat som en process för att frysa koncentrationen, påverkad av lagringstiden i frysen. En högre koncentration av proteiner observerades vid längre lagringstider (32 och 20 dagar) och vid de kallaste temperaturerna (4 °C och -20 °C). Perioden med den högsta koncentrationen av protein hade emellertid inte den högsta koncentrationen av lumican; Detta tyder på att Lumican kan påverkas av frusna temperaturer och tidsförhållanden.
Enligt resultaten var lumikankoncentrationen högre och stabilare vid 12 dagars lagring vid 4 °C och -20 °C. Icke desto mindre, en mindre koncentration av lumican hittades vid 6 dagar jämfört med 12 dagar. Vissa rapporter tyder på att proteinkoncentrationen kan förändras efter frysta lagringsförhållanden20. Resultaten kan orsakas av en termodynamisk mekanism som kallas isinducerad partiell utveckling av proteinstrukturen, vilket händer under frysning av prover. Samspelet mellan proteiner och vatten i de vattenhaltiga lösningarna minskar deras interaktioner med andra molekyler. Kristallisationsprocessen av vatten under frusna förhållanden tillåter proteiner och vissa funktionella regioner att interagera med andra molekyler19. Genom det ovan nämnda, efter 12 dagars frysning av lumikan i en vattenhaltig lösning, skulle den kunna interagera med antikropparna som finns i ELISA-kvantifieringssatsen för att resultera i en högre koncentration. Å andra sidan, förmodligen på sjätte dagen, kunde lumikanen ha varit avskild i vattenlösningen.
För att främja innovationer är användningen av AM den toppmoderna behandlingen för hornhinnans re-epitelisering oavsett etiologi. Som tidigare nämnts är fördelarna med AM stora 21,22,23,24,25,26. Många författare har visat fördelarna med lumican i AME, vilket gör det till ett prisvärt alternativ specifikt för utvecklingsländer 1,2,3,4,5,6,7,8,9. För närvarande finns det många fördelar med lumican i AME; Dess användning som behandling gynnar hornhinnans re-epitelisering och förbättrar prognosen för hornhinnesår 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. AM-transplantation (AMT) har blivit en behandling med stora fördelar för att förbättra olika hornhinnesjukdomar24,25. Det finns emellertid vissa kroniska känslor i hornhinnevävnaden, såsom ihållande epiteldefekter (PED) och limbala stamcellsbrister (LESCD), som kräver konstant behandling och underhåll av närvaron av biologiska faktorer som hjälper hornhinnan att reparera21,24. För närvarande finns det inga adjuvansbehandlingar som möjliggör långsiktigt underhåll av de faktorer som frigörs av AMT på hornhinnans yta. En konstant ersättning av AMT kunde dock inte rekommenderas för patientsäkerhet26. Av denna anledning är det nödvändigt att utveckla alternativ som gör det möjligt för AMT: s funktioner att hjälpa och hjälper till att upprätthålla närvaron av faktorer som frigörs av AM i hornhinnevävnaden, såsom lumican under en längre tid, med avsikt att gynna behandlingen av ihållande problem i hornhinnan27.
Lumican är en av de faktorer som finns i AM med antiinflammatoriska och antifibrotiska funktioner, som har rapporterats ha funktioner i hornhinnans reparationsprocess 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Det är därför lumican föreslår att man är en bra kandidat för att hjälpa till att behandla hornhinnans känslor; emellertid, ytterligare forskning krävs för att bestämma effekten av lumican i AME för att uppnå hornhinnans re-epitelisering.
Lumican är en proteoglykan som har visat sig reglera utsöndringen av extracellulära matrisföreningar som kollagen; Det är också involverat i fibroblastaktivering och modulering av inflammatoriska celler och angiogenesprocessen, som har en viktig roll i sårläkning. Enligt resultaten kan lumican extraheras från AM-vävnad. Terapeutiska tillämpningar av lumican är många; användningen av lumikan i AME möjliggör ett uppnåeligt terapeutiskt alternativ för okulära störningar 4,13. Den främsta fördelen med att använda AME är att det ger en enkel applikation som en topisk behandling för ögonytan, med tanke på dess vattenhaltiga sammansättning. På samma sätt kan andra proteiner med antiinflammatoriska och immunregulatoriska egenskaper hittas inom komponenterna extraherade från AM-vävnaden, vilket kan ge en större fördel vid behandling av de-epitelialiserande problem i ögat. Till exempel har andra antiinflammatoriska faktorer såsom TSG-6 närvarande i AM och cellulära komponenter tidigare rapporterats ha immunreglerande egenskaper8. Härmed kan en kombinerad behandling av lumikan och andra extracellulära matrisföreningar och immunmodulerande molekyler som finns i AME vara användbar i re-epitelialiserings- och sårläkningsprocessen.
Denna metod syftar till att demonstrera en enkel teknik för proteinutvinning, användbar för obtention av rikliga proteiner och faktorer. En av de kritiska övervägandena för denna metod är användningen av proteashämmare, eftersom det är grundläggande för framgångsrik proteinextraktion eftersom AM är en vävnad med massor av enzymatiska föreningar för att förhindra proteinnedbrytning27. Bevis har rapporterat att användning av proteinhämmare tillsammans med en vattenlösning ökar extraktionen av andra faktorer, såsom HGF, i AM-vävnad26. Obtentionen av ett fint pulver efter frysning och jordning av AM är nödvändig för optimal obtention av AME, eftersom denna process är lämplig för vävnad och cellulär störning av strukturer som behövs för extraktion av cytosoliska och andra kärnföreningar28,29.
Några begränsningar med denna extraktionsmetod är att den använda AM-kvantiteten inte kunde tillåta en storskalig extraktion. Detta protokoll tillåter proteinextraktion från en begränsad mängd vävnad; Eftersom det inte finns några bevis för att denna metod möjliggör att erhålla en större mängd protein från ett större vävnadsområde. Felsökning som ska övervägas i jämförelse med andra extraktionsmetoder är att använda en lämplig koncentration av proteashämmare och inkubationstid, eftersom överskottsenzymerna kan påverka proteiner30 och minska teknikens effektivitet.
En del av denna teknik modifierades från den som rapporterades av Mahbod et al.16, som beskriver att upprepning av centrifugerings- och extraktionsprocessen ökar proteinutvinningen. I motsats till Mahbod rapporterade resultaten inte proteinkoncentration efter tre centrifugeringscykler. När den totala proteinkoncentrationen bestämdes minskade den med 80% vid en andra extraktion och upp till 97% vid en tredje extraktion. Att utföra endast en extraktion minskar bearbetningstiden och minskar inte mängden totalt protein. Med föregående kräver extraktionsmetoden som rapporteras här endast ett centrifugeringssteg med gynnsamma resultat.
Denna teknik kan användas för att extrahera andra faktorer och proteiner som finns i AM och vidare för att erhålla faktorer från andra källor som djur eller grönsaker. Det kan också ha en applikation för att erhålla proteiner för att utföra grundforskning eller till och med utveckling av formuleringar och behandlingar.
Dessa resultat tyder på att lumican kan extraheras från AM och lagras i 12 dagar som AME under både -20 °C och 4 °C temperaturförhållanden. Det är viktigt att överväga dess halveringstid för att uppnå de terapeutiska effekterna av lumican som AME. Ytterligare studier behövs för att bestämma rollen av AME lumican i hornhinnans epitelceller och för att bestämma den ideala dosen av lumican för hornhinnans re-epitelisering.
Sammanfattningsvis tyder resultaten på att det är möjligt att erhålla faktorer som lumikan i AME. På samma sätt påverkar temperatur- och lagringstidsförhållandena koncentrationen av lumikan som finns i AME.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Studien finansierades av stödprogrammet för forsknings- och tekniska innovationsprojekt vid Universidad Nacional Autonoma de Mexico (bidrag nr PAPIIT IN203821) och ministeriet för utbildning, vetenskap, teknik och innovation (bidrag nr SECTEI 250/2019).
Acknowledgments
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N H2SO4 stop solution | R&D Systems | DY994 | |
| 100 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 1000 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 15 mm Petri dish | Symlaboratorios | ||
| 18 G Needle (1.2 mm x 40 mm) | BD Becton Dickinson | 305211 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | Z606340 | |
| 20 mL plastic syringe | BD Becton Dickinson | 302562 | |
| 20 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 20-200 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30119401 | |
| 96-well microplate | SARSTEDT | 821581 | |
| Aluminum foil | N/A | N/A | |
| Amniotic membrane | Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank | 100 mg | |
| Balanced salt solution | Bausch + Lomb | BSS-403802 | |
| Beaker | N/A | N/A | |
| BioRender | BioRender | figures design | |
| Compact Rocker | BioRad | 970822DD | Mod. 5202SD-BIO |
| complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail tablets |
Roche | 11 873 580 001 | Protease Inhibitor |
| Daiggner vortex Genie 2 | A.Daigger & Co. , INC | 22220A | |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | |
| ELISA plate spectrometer | Thermo Labsystems | 35401106 | Multiscan |
| Freezer | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc | version 9 | statistical analysis and graphic program |
| Human lumican DuoSet ELISA kit | R&D Systems | DY2846-05 | includes human Lumican capture antibody |
| Incubator | Forma Scientific | 3326 S/N 36481-7002 | |
| Inverted light Microscope | Olympus | 6A13921 | to confirm de-epithelialization Mod.CK2 |
| Laminar flow hood | Forma Scientific | 14753-567 | Mod.1184 |
| Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
| Mortar | N/A | N/A | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | ||
| Nitrogen Tank | Thermo Scientific | Mod. Biocan 20 | |
| Paper towels | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | R&D Systems | DY006 | |
| Pierce Modified Lowry Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23240 | |
| Plate sealers | R&D Systems | DY992 | |
| Reagent diluent | R&D Systems | DY995 | 1% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered |
| Refrigerated centrifuge | centurion scientific Ltd | 15877 | Mod. K2015R |
| Rubber policeman cell scraper | NEST | 710001 | for mechanical de-epithelialization |
| Scalpel knife | Braun | BB521 | No. 10 or 21 |
| Streptavidin-HRP 40-fold concentrated | R&D Systems | part 893975 | |
| Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solution | R&D Systems | DY999 | |
| Toothed tweezers | Invent Germany | 6b | inox |
| Ultrapure water | PISA | ||
| Wash buffer | R&D Systems | WA126 | 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4 |
References
- Jirsova, K., Jones, G. Amniotic membrane in ophthalmology: properties, preparation, storage and indications for grafting-a review. Cell and Tissue Banking. 18 (2), 193-204 (2017).
- Witherel, C., Yu, T., Concannon, M., Dampier, W., Spiller, K. Immunomodulatory effects of human cryopreserved viable amniotic membrane in a pro-inflammatory environment in vitro. Cellular and Molecular Bioengineering. 10 (5), 451-462 (2017).
- Ruiz-Cañada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating transforming growth factor-β signalling. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 808-820 (2017).
- Yeh, L., et al. Soluble lumican glycoprotein purified from human amniotic membrane promotes corneal epithelial wound healing. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (2), 479 (2005).
- Navas, A., et al. Anti-Inflammatory and anti-fibrotic effects of human amniotic membrane mesenchymal stem cells and their potential in corneal repair. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 906-917 (2018).
- Magaña-Guerrero, F., Domínguez-López, A., Martínez-Aboytes, P., Buentello-Volante, B., Garfias, Y. Human amniotic membrane mesenchymal stem cells inhibit neutrophil extracellular traps through TSG-6. Scientific Reports. 7, 12426 (2017).
- Garfias, Y., Zaga-Clavellina, V., Vadillo-Ortega, F., Osorio, M., Jimenez-Martinez, M. Amniotic membrane is an immunosuppressor of peripheral blood mononuclear cells. Immunological Investigations. 40 (2), 183-196 (2010).
- Koob, T., et al. Biological properties of dehydrated human amnion/chorion composite graft: implications for chronic wound healing. International Wound Journal. 10 (5), 493-500 (2013).
- Miyagi, H., Thomasy, S., Russell, P., Murphy, C. The role of hepatocyte growth factor in corneal wound healing. Experimental Eye Research. 166, 49-55 (2018).
- Chen, S., Mienaltowski, M., Birk, D. Regulation of corneal stroma extracellular matrix assembly. Experimental Eye Research. 133, 69-80 (2015).
- Karamanou, K., Perrot, G., Maquart, F., Brézillon, S. Lumican as a multivalent effector in wound healing. Advanced Drug Delivery Reviews. 129, 344-351 (2018).
- Theocharis, A., et al. Cell-matrix interactions: focus on proteoglycan-proteinase interplay and pharmacological targeting in cancer. FEBS Journal. 281 (22), 5023-5042 (2014).
- Saika, S., et al. Role of lumican in the corneal epithelium during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 275 (4), 2607-2612 (2000).
- Domínguez-López, A., et al. Amniotic membrane conditioned medium (AMCM) reduces inflammatory response on human limbal myofibroblast, and the potential role of lumican. Molecular Vision. 27, 370-383 (2021).
- Vij, N., Roberts, L., Joyce, S., Chakravarti, S. Lumican regulates corneal inflammatory responses by modulating Fas-Fas Ligand signaling. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (1), 88 (2005).
- Mahbod, M., et al. Amniotic membrane extract preparation: What is the best method. Journal of Ophthalmic and Vision Research. 9 (3), 314-319 (2014).
- Chávez-García, C., et al. Ophthalmic indications of amniotic membrane transplantation in Mexico: an eight years Amniotic Membrane Bank experience. Cell and Tissue Banking. 17 (2), 261-268 (2015).
- Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
- Bhatnagar, B. S., Bogner, R. H., Pikal, M. J. Protein stability during freezing: separation of stresses and mechanisms of protein stabilization. Pharmaceutical Development and Technology. 12 (5), 505-523 (2007).
- McClain, A. K., McCarrel, T. M. The effect of four different freezing conditions and time in frozen storage on the concentration of commonly measured growth factors and enzymes in equine platelet-rich plasma over six months. BMC Veterinary Research. 15 (1), 292 (2019).
- Tamhane, A., et al. Evaluation of amniotic membrane transplantation as an adjunct to medical therapy as compared with medical therapy alone in acute ocular burns. Ophthalmology. 112 (11), 1963-1969 (2005).
- Shtein, R., et al. Autologous serum-based eye drops for treatment of ocular surface disease. Ophthalmology. 127 (1), 128-133 (2020).
- Shahriari, H., Tokhmehchi, F., Reza, M., Hashemi, N. Comparison of the effect of amniotic membrane suspension and autologous serum on alkaline corneal epithelial wound healing in the rabbit model. Cornea. 27 (10), 1148-1150 (2008).
- Schuerch, K., Baeriswyl, A., Frueh, B., Tappeiner, C. Efficacy of amniotic membrane transplantation for the treatment of corneal ulcers. Cornea. 39 (4), 479-483 (2019).
- Chen, H., et al. Amniotic membrane transplantation for persistent corneal ulcers and perforations in acute fungal keratitis. Cornea. 25 (5), 564-572 (2006).
- Guo, Q., et al. A comparison of the effectiveness between amniotic membrane homogenate and transplanted amniotic membrane in healing corneal damage in a rabbit model. Acta Ophthalmologica. 89 (4), 315-319 (2011).
- Sabater, A., Perez, V. Amniotic membrane use for management of corneal limbal stem cell deficiency. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 363-369 (2017).
- Ahmad, T., et al. Autolysis of bovine skin, its endogenous proteases, protease inhibitors and their effects on quality characteristics of extracted gelatin. Food Chemistry. 265, 1-8 (2018).
- Mullegama, S. V., et al. Nucleic acid extraction from human biological samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
- Skog, M., et al. The effect of enzymatic digestion on cultured epithelial autografts. Cell Transplantation. 28 (5), 638-644 (2019).
