Aquí se proporciona un protocolo detallado para establecer organoides mamarios humanos a partir de resecciones de tumores de mama derivados de pacientes o tejido mamario normal. El protocolo proporciona instrucciones completas paso a paso para el cultivo, la congelación y la descongelación de organoides mamarios derivados de pacientes humanos.
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Artículo de método
Establecimiento y cultivo de organoides mamarios derivados de pacientes
En este artículo
Resumen
Resumen
El cáncer de mama es una enfermedad compleja que se ha clasificado en varios subtipos histológicos y moleculares diferentes. Los organoides tumorales de mama derivados de pacientes desarrollados en nuestro laboratorio consisten en una mezcla de múltiples poblaciones de células derivadas de tumores y, por lo tanto, representan una mejor aproximación de la diversidad y el entorno de las células tumorales que las líneas celulares de cáncer 2D establecidas. Los organoides sirven como un modelo ideal in vitro , lo que permite las interacciones célula-matriz extracelular, que se sabe que desempeñan un papel importante en las interacciones célula-célula y la progresión del cáncer. Los organoides derivados de pacientes también tienen ventajas sobre los modelos de ratón, ya que son de origen humano. Además, se ha demostrado que recapitulan la heterogeneidad genómica, transcriptómica y metabólica de los tumores de los pacientes; Por lo tanto, son capaces de representar la complejidad tumoral, así como la diversidad del paciente. Como resultado, están preparados para proporcionar información más precisa sobre el descubrimiento y la validación de objetivos y los ensayos de sensibilidad a los medicamentos. En este protocolo, proporcionamos una demostración detallada de cómo se establecen los organoides mamarios derivados de pacientes a partir de tumores de mama resecados (organoides de cáncer) o tejido mamario derivado de la mamoplastia reductora (organoides normales). Esto es seguido por una descripción completa del cultivo de organoides 3D, expansión, paso, congelación, así como la descongelación de cultivos de organoides mamarios derivados de pacientes.
Introducción
El cáncer de mama (CB) es la neoplasia maligna más común en las mujeres, con 287,850 nuevos casos estimados para ser diagnosticados en los Estados Unidos en 20221. A pesar de los recientes avances en la detección temprana con exámenes anuales, terapias dirigidas y una mejor comprensión de la predisposición genética, prevalece como la segunda causa principal de muertes por cáncer en mujeres en los Estados Unidos, con > 40,000 muertes atribuidas al cáncer de mama anualmente1. El cáncer de mama se clasifica actualmente en múltiples subtipos basados en la evaluación histopatológica y molecular del tumor primario. Una mejor e....
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Protocolo
Las resecciones tumorales de pacientes con cáncer de mama, junto con el tejido normal distal y adyacente, se obtuvieron de Northwell Health de acuerdo con los protocolos IRB-03-012 e IRB 20-0150 de la Junta de Revisión Institucional, y con el consentimiento informado por escrito de los pacientes.
NOTA: Todos los procedimientos mencionados a continuación se realizaron en una sala BSL2 de cultivo de tejido de mamíferos designada para muestras de pacientes previa aprobación del comité de bioseguridad. Todos los procedimientos deben realizarse siguiendo protocolos de seguridad manteniendo condiciones asépticas en gabinetes de bioseguridad. Cada....
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Resultados
Hemos establecido un biobanco de organoides tumorales de mama derivados de pacientes que comprende varios subtipos11. Además, hemos establecido múltiples líneas organoides mamarias normales derivadas de muestras de tejido de mamoplastia reductora o mama normal adyacente/distal de pacientes con BC utilizando el enfoque descrito en la Figura 1.
Las diversas líneas organoides de tumores de mama derivados de pacientes difieren en su morfología .......
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Discusión
Nuestro laboratorio ha empleado con éxito los protocolos anteriores para establecer organoides a partir de resecciones o raspados tumorales ingenuos. También hemos utilizado este protocolo para desarrollar organoides normales a partir de tejido mamario obtenido a través de mamoplastias reductoras o de tejido mamario normal adyacente o distal de pacientes con cáncer. Alrededor de 30 a 40 % de los tumores primarios resecados dieron lugar a cultivos de organoides tumorales exitosos a largo plazo (paso 8 >). Las lín.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio Spector por las discusiones críticas a lo largo de este trabajo. Agradecemos a Norman Sachs y Hans Clevers (Hubrecht Institute, Países Bajos) por proporcionarnos inicialmente su protocolo de cultivo de organoides. Reconocemos los Recursos Compartidos de Histología y Microscopía del Centro Oncológico de CSHL por sus servicios y experiencia técnica (NCI 2P3OCA45508). Agradecemos al Dr. Qing Gao por su ayuda con la preparación de muestras histológicas. Estamos agradecidos por el apoyo de la Dra. Karen Kostroff (Northwell Health) por proporcionar muestras de tumores de pacientes. También apreciamos los esfuerzos del eq....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos cónicos de 15 mL | VWR | 525-1068 | |
| 175 cm2 matraz para cultivo de tejidos | VWR (Corning) | 29185-308 | |
| 37 ° Baño | |||
| 37 ° C Incubadora de CO2 | |||
| m Filtro) | Millipore Sigma SCGP00525 | SCGP00525 | |
| 500 mL Unidad de Filtro de Flujo Rápido, 0.2 y micro; membrana membrana aPES, 75 mm de diámetro | Nalgene | 566-0020 | |
| placas de cultivo de 6 pocillos | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
| 75 cm2 matraz de cultivo de tejidos | VWR (Corning) | 29185-304 | |
| Placas opacas de 96 pocillos | Corning | 353296 | para ensayo CTG |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B-27 suplemento | Life Technologies | ||
| BioTek Lector de microplacas híbrido Synergy H4 | Fisher Scientific (Agilent) | Para ensayo de luciferasa dual y ensayo CTG | |
| BSA fracción V (7,5%) | Reactivo Thermo | 15260037 | |
| Cell Titer-Glo (CTG) | Promega | G9683 | Ensayo de viabilidad de células luminiscentes |
| Centrífuga | Eppendorf | 5804 | |
| Colagenasa de Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Tipo IV |
| Crioetiquetas | Amazon | DTCR-1000 | Cryo-Tags Térmicas Directas, Blanco, 1.05 x 0.5 " |
| Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
| Countess 3 Contador de celdas automatizado | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
| DMEM, alto contenido de glucosa, piruvato | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
| Sistema de ensayo indicador de luciferasa dual | Promega | E1910 | |
| Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
| Factor de crecimiento epidérmico (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| FGF-10 (humano) | Peprotech | 100-26 | |
| FGF-7/KGF (humano) | Peprotech | 100-19 | |
| GlutaMax | Life Technologies | ||
| HEK293T celdas | ATCC | CRL-3216 | Para el ensayo TOPFlash |
| Células HEK293T-HA-Rspondin1-Fc | R& D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-FC 293T Células |
| HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
| Heregulinaβ-1 (humano) | Peprotech | 100-03 | |
| Matrigel Factor de Crecimiento Reducido (GFR) Matriz de Membrana Basal (~10 mg/mL de concentración de proteína) | Corning | 356231 | Libre de rojo de fenol, libre de LDEV; matriz de membrana basal |
| Sr. Frosty Contenedor de congelación celular | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
| Kit de detección de micoplasma | Lonza | LT07-418 | |
| N-acetil-l-cisteína | Millipore Sigma | A9165 | |
| Nalgene Unidades de filtro desechables estériles de flujo rápido con membranas PES | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Nicotinamida | Millipore Sigma | N0636 | |
| Noggin (humano) | Peprotech | 120-10C | |
| P1000, P200, P10 pipetas con puntas | |||
| P38 Inhibidor de MAPK (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
| Parafilm | película transparente | ||
| Penicilina-Estreptomicina | Life Tecnologías | 15140122 | |
| plásmido1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
| plásmido2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
| plásmido3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
| pluriStrainer 200 µ m | pluriSelect | 43-50200-01 | |
| Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
| congelación para cultivo celular | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 medio de | congelación celular |
| Tampón de lisis de glóbulos rojos | Millipore Sigma | 11814389001 | |
| Medios acondicionados R-spondin | Propios o comerciales de Peprotech | 120-38 | |
| Bisturí (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
| Agitador (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
| TGF-β inhibidor del receptor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
| Tinción azul de tripán (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Enzima TrypLE Express (1X), rojo de fenol | Célula de 12605028 Life Technologies | reactivo de disociación | |
| X-tremeGENE 9 reactivo de transfección de ADN | Millipore Sigma | 6365779001 | |
| Y-27632 Dihidrocloruro (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |
Referencias
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
- Greenwalt, I., Zaza, N., Das, S., Li, B. D. Precision Medicine and Targeted Therapies in Breast Cancer. Surgical Oncology Clinics of N....
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Reimpresiones y permisos
