Hier wird eine neue Version der Expansionsmikroskopie (ExM), Magnify, vorgestellt, die für eine bis zu 11-fache Expansion modifiziert wurde, eine umfassende Palette von Biomolekülklassen bewahrt und mit einer Vielzahl von Gewebetypen kompatibel ist. Es ermöglicht die Untersuchung der nanoskaligen Konfiguration von Biomolekülen mit herkömmlichen beugungsbegrenzten Mikroskopen.
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Methodenartikel
Universelle molekulare Retention mit 11-facher Expansionsmikroskopie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die nanoskalige Bildgebung biologischer Proben kann das Verständnis der Krankheitspathogenese verbessern. In den letzten Jahren hat sich die Expansionsmikroskopie (ExM) als effektive und kostengünstige Alternative zur optischen Superauflösungsmikroskopie erwiesen. Sie wurde jedoch durch den Bedarf an spezifischen und oft kundenspezifischen Verankerungsmitteln zur Beibehaltung verschiedener Biomolekülklassen im Gel und durch Schwierigkeiten bei der Erweiterung klinischer Standardprobenformate, wie z. B. formalinfixiertes, in Paraffin eingebettetes Gewebe, eingeschränkt, insbesondere wenn größere Expansionsfaktoren oder konservierte Proteinepitope gewünscht werden. Hier beschreiben wir Magnify, eine neue ExM-Methode zur robusten bis zu 11-fachen Expansion in einer Vielzahl von Gewebetypen. Durch die Verwendung von Methacrolein als chemischer Anker zwischen dem Gewebe und dem Gel hält Magnify mehrere Biomoleküle wie Proteine, Lipide und Nukleinsäuren im Gel zurück und ermöglicht so die breite nanoskalige Abbildung von Geweben auf herkömmlichen optischen Mikroskopen. Dieses Protokoll beschreibt Best Practices, um eine robuste und rissfreie Gewebeexpansion zu gewährleisten, sowie Tipps für die Handhabung und Bildgebung von stark expandierten Gelen.
Einleitung
Biologische Systeme weisen strukturelle Heterogenität auf, von den Gliedmaßen und Organen bis hin zu Proteinen auf der Nanoskala. Daher erfordert ein vollständiges Verständnis der Funktionsweise dieser Systeme eine visuelle Untersuchung über diese Größenskalen hinweg. Die Beugungsgrenze des Lichts stellt jedoch eine Herausforderung bei der Visualisierung von Strukturen dar, die kleiner als ~200-300 nm auf einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop sind. Darüber hinaus stellen optische Superauflösungsmethoden 1,2,3, wie z. B. die stimulierte Emissionsverarmung (STED), die photoaktivierte Lokalisierungsmikroskopie (PALM), die ....
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Protokoll
Alle Versuchsverfahren mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee der Carnegie Mellon University genehmigt. Menschliche Gewebeproben wurden kommerziell gewonnen.
1. Herstellung der Stammreagenzien und -lösungen
HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie eine Liste der verwendeten Reagenzien.
- Bereiten Sie die Gelierstocklösungen vor. Diese werden unmittelbar vor dem Gelierschritt kombiniert.
- Die Monomer-Stammlösung (4 g/100 mL N,N-Dimethylacrylami....
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Ergebnisse
Wenn das Protokoll erfolgreich abgeschlossen wurde (Abbildung 1), erscheint die Probe nach der Hitzedenaturierung klar und flach. Jede Faltung oder Faltenbildung deutet auf eine unvollständige Homogenisierung hin. Eine erfolgreich expandierte Probe ist 3-4,5-mal größer als vor der Expansion in 1x PBS und 8-11-mal größer, wenn sie vollständig in ddH2Oexpandiert ist. Abbildung 3 zeigt Beispiele für Pre- und Post-Expansionsbilder einer 5 μm dicken FFPE-H.......
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Diskussion
Hier stellen wir das Magnify-Protokoll17 vor, eine ExM-Variante, die mehrere Biomoleküle mit einem einzigen chemischen Anker zurückhalten und anspruchsvolle klinische FFPE-Proben durch Hitzedenaturierung bis zu 11-fach erweitern kann. Zu den wichtigsten Änderungen in diesem Protokoll, die es von anderen ExM-Protokollen unterscheiden, gehören die Verwendung eines neu formulierten Gels, das auch bei vollständiger Expansion mechanisch robust bleibt, sowie die Verwendung von Methacrolein als Biomolekü.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären die folgenden, konkurrierenden finanziellen Interessen: Y.Z., A.K., Z.C. und B.R.G. haben mehrere Erfindungen im Zusammenhang mit Magnify und ExM erfunden.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der Carnegie Mellon University und der D.S.F. Charitable Foundation (Y.Z. und X.R.), den National Institutes of Health (N.I.H.) Director's New Innovator Award DP2 OD025926-01 und der Kauffman Foundation.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 4-Hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-Well-Glasbodenplatte (#1,5 Deckglas) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamid | Sigma Aldrich | A8887 | Gel-Monomer-Komponente |
| Ammoniumpersulfat (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/ml) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylenglykolmonododecylether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Nichtionisches Tensid |
| Diamantmesser Nr. 88 CM | Allgemeine Werkzeuge | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | ||
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) 0,5 M | VWR | BDH7830-1 | Homogenisierungspuffer |
| Zange | |||
| Glycin Sigma | Aldrich | G8898 | Homogenisierungspuffer Komponente |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Verankerungsmittel |
| Micro cover Glas #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glas #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylendiamin (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | Beschleuniger |
| N,N′-Methylenbisacrylamid (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel-Monomer-Komponente |
| N,N-Dimethylacrylamid (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel-Monomer-Komponente |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Zellkulturschale | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well-Zellkulturschale | Thermo Fisher | 140675 | |
| 15mL Konischer | Thermo Fisher 339651 | ||
| 50mL Konischer | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Pinsel | |||
| pH-Messgerät | |||
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 10x Lösung | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylenglykol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K ( | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Rasierklinge | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Mikrozentrifugenröhrchen 2,0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Natriumacrylat (SA) | AK Scientific | R624 | Gel-Monomer-Komponente |
| Natriumazid | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Natriumchlorid | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Natriumcitrat tribasisches Dihydrat | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Natriumdodecylsulfat (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenisierungspuffer Komponente |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenisierungspuffer Komponente |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Harnstoff | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenisierungspuffer Komponente |
| Xylole | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| Poly-L-Lysin | Sigma Aldrich | P8920 |
Referenzen
- Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhar....
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Nachdrucke und Genehmigungen
