Aquí se presenta una nueva versión de microscopía de expansión (ExM), Magnify, que está modificada para una expansión de hasta 11 veces, conservando una amplia gama de clases de biomoléculas y es compatible con una amplia gama de tipos de tejidos. Permite la interrogación de la configuración a nanoescala de biomoléculas utilizando microscopios convencionales limitados por difracción.
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Artículo de método
Retención molecular universal con microscopía de expansión de 11 veces
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Resumen
Resumen
Las imágenes a nanoescala de especímenes biológicos pueden mejorar la comprensión de la patogénesis de la enfermedad. En los últimos años, se ha demostrado que la microscopía de expansión (ExM) es una alternativa eficaz y de bajo coste a la microscopía óptica de superresolución. Sin embargo, se ha visto limitado por la necesidad de agentes de anclaje específicos y, a menudo, personalizados para retener diferentes clases de biomoléculas dentro del gel y por las dificultades para expandir los formatos de muestras clínicas estándar, como el tejido fijado en formol e incluido en parafina, especialmente si se desean factores de expansión más grandes o epítopos de proteínas preservados. Aquí, describimos Magnify, un nuevo método ExM para una expansión robusta de hasta 11 veces en una amplia gama de tipos de tejidos. Al utilizar metacroleína como anclaje químico entre el tejido y el gel, Magnify retiene múltiples biomoléculas, como proteínas, lípidos y ácidos nucleicos, dentro del gel, lo que permite la obtención de imágenes a nanoescala de los tejidos en microscopios ópticos convencionales. Este protocolo describe las mejores prácticas para garantizar una expansión de tejido robusta y sin grietas, así como consejos para manipular y obtener imágenes de geles altamente expandidos.
Introducción
Los sistemas biológicos exhiben heterogeneidad estructural, desde las extremidades y los órganos hasta los niveles de proteínas a nanoescala. Por lo tanto, una comprensión completa del funcionamiento de estos sistemas requiere un examen visual a través de estas escalas de tamaño. Sin embargo, el límite de difracción de la luz causa desafíos en la visualización de estructuras más pequeñas que ~200-300 nm en un microscopio de fluorescencia convencional. Además, los métodos ópticos de superresolución 1,2,3, como el agotamiento de la emisión estimulada (STED), la microscopía de localización fotoactivad....
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Protocolo
Todos los procedimientos experimentales con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Carnegie Mellon. Se obtuvieron muestras de tejido humano de forma comercial.
1. Preparación de los reactivos y soluciones madre
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista de los reactivos utilizados.
- Prepare las soluciones madre gelificantes. Estos se combinarán inmediatamente antes del paso de gelificación.
- ....
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Resultados
Si el protocolo se ha completado con éxito (Figura 1), la muestra aparecerá clara y plana después de la desnaturalización por calor; Cualquier pliegue o arruga indica una homogeneización incompleta. Una muestra expandida con éxito será de 3 a 4,5 veces más grande que antes de la expansión en 1x PBS y de 8 a 11 veces más grande cuando esté completamente expandida en ddH2O. La Figura 3 muestra imágenes de ejemplo antes y después de la expansión de una m.......
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Discusión
Aquí, presentamos el protocolo Magnify 17, una variante ExM que puede retener múltiples biomoléculas con un solo anclaje químico y expandir muestras clínicas FFPE desafiantes hasta11 veces con desnaturalización por calor. Los cambios clave en este protocolo que lo distinguen de otros protocolos ExM incluyen el uso de un gel reformulado que permanece mecánicamente robusto incluso cuando está completamente expandido, así como el uso de metacroleína como anclaje de la biomolécula. Los pasos más críti.......
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Divulgaciones
Los autores declaran los siguientes intereses financieros contrapuestos: Y.Z., A.K., Z.C. y B.R.G. inventaron varias invenciones relacionadas con Magnify y ExM.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Universidad Carnegie Mellon y la Fundación Benéfica D.S.F. (Y.Z. y X.R.), los Institutos Nacionales de Salud (N.I.H.) Premio al Nuevo Innovador del Director DP2 OD025926-01, y la Fundación Kauffman.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 4-hidroxi-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | Inhibidor | |
| de 176141 Placa de fondo de vidrio de 6 pocillos (cubreobjetos #1.5) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrilamida | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Componente de monómero |
| Persulfato de amonio (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Iniciador |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaetilenglicol mono dodecil éter (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Surfactante no iónico |
| Cuchillo de diamante Nº 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | ||
| Etilendiaminotetraacético ácido (EDTA) 0,5 M | VWR | BDH7830-1 | Componente tampón de homogeneización |
| Pinzas | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Componente tampón de homogeneización |
| Heparina | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Metacroleína | Sigma Aldrich 133035 | Agente de anclaje | |
| Micro cubierta Vidrio #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cubierta Vidrio #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetrametiletilendiamina (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Metilenebisacecrilamida (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Componente de monómero de gel |
| N,N-dimetilacrilamida (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Componente del monómero |
| Nunclon 4 pocillos x 5 mL Plato de cultivo celular MultiDish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon Plato de cultivo celular de 6 pocillos | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Thermo Fisher cónico | 339651 | ||
| Nunc™ 50mL Cónico | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Pincel Medidor | |||
| pH Solución | |||
| salina tamponada de fosfato (PBS), 10x Solución | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polietilenglicol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinasa K ( Grado de biología molecular) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Hoja de afeitar | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Tubos de microcentrífuga 1,5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Tubos de microcentrífuga Safelock 2,0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Acrilato de sodio (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Componente |
| Azida de sodio | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Cloruro de sodio | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Citrato de sodio tribásico dihidratado | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Dodecil sulfato de sodio (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Componente tampón de homogeneización |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Tampón de homogeneización Componente |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Tampón de homogeneización Componente |
| Xilenos | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poli-L-lisina | Sigma Aldrich | P8920 |
Referencias
- Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhar....
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Reimpresiones y permisos
