Un modelo de trasplante de corazón de rata heterotópico neonatal para el estudio de la transición endotelial a mesenquimal
Summary
En este trabajo se presenta un modelo animal de fibrosis inducida por transición endotelial-mesenquimatosa, como se observa en defectos cardíacos congénitos como la estenosis aórtica crítica o el síndrome del corazón izquierdo hipoplásico, que permite la evaluación histológica detallada del tejido, la identificación de vías de señalización reguladoras y la prueba de opciones de tratamiento.
Abstract
La fibroelastosis endocárdica (EFE), definida por la acumulación de tejido subendocárdico, tiene un gran impacto en el desarrollo del ventrículo izquierdo (VI) e impide que los pacientes con estenosis aórtica crítica congénita y síndrome del corazón izquierdo hipoplásico (SHH) realicen una reparación quirúrgica anatómica biventricular curativa. La resección quirúrgica es actualmente la única opción terapéutica disponible, pero la EFE a menudo recurre, a veces con un patrón de crecimiento aún más infiltrativo en el miocardio adyacente.
Para comprender mejor los mecanismos subyacentes de la EFE y explorar estrategias terapéuticas, se desarrolló un modelo animal adecuado para pruebas preclínicas. El modelo animal tiene en cuenta que la EFE es una enfermedad del corazón inmaduro y se asocia con alteraciones del flujo, como lo respaldan las observaciones clínicas. Por lo tanto, el trasplante cardíaco heterotópico de corazones de donantes de ratas neonatas es la base de este modelo.
Se trasplanta un corazón de rata neonatal al abdomen de una rata adolescente y se conecta a la aorta infrarrenal y a la vena cava inferior del receptor. Mientras que la perfusión de las arterias coronarias preserva la viabilidad del corazón del donante, el estancamiento del flujo dentro del VI induce el crecimiento de EFE en el corazón muy inmaduro. El mecanismo subyacente de la formación de EFE es la transición de las células endoteliales endocárdicas a las células mesenquimales (EndMT), que es un mecanismo bien descrito de desarrollo embrionario temprano de las válvulas y los tabiques, pero también la principal causa de fibrosis en la insuficiencia cardíaca. La formación de EFE se puede observar macroscópicamente a los pocos días del trasplante. La ecocardiografía transabdominal se utiliza para monitorizar la viabilidad del injerto, la contractilidad y la permeabilidad de las anastomosis. Después de la eutanasia, se extrae el tejido EFE, que muestra las mismas características histopatológicas que el tejido EFE humano de pacientes con HLHS.
Este modelo in vivo permite estudiar los mecanismos de desarrollo de EFE en el corazón y probar opciones de tratamiento para prevenir esta formación de tejido patológico y brinda la oportunidad de un examen más generalizado de la fibrosis inducida por EndMT.
Introduction
La fibroelastosis endocárdica (EFE), definida por la acumulación de colágeno y fibras elásticas en el tejido subendocárdico, se presenta como un endocardio engrosado nacarado u opaco; La EFE experimenta un crecimiento más activo durante el período fetal y la primera infancia1. En un estudio de autopsia, el 70% de los casos con síndrome del corazón izquierdo hipoplásico (HLHS) se asociaron con la presencia de EFE2.
Las células que expresan marcadores de fibroblastos son la principal población celular en EFE, pero estas células también expresan concomitantemente marcadores endoteliales endocárdicos, lo que es una indicación del origen de estas células EFE. Nuestro grupo estableció previamente que el mecanismo subyacente de la formación de EFE implica un cambio fenotípico de células endoteliales endocárdicas a fibroblastos a través de la transición endotelial-mesenquimal (EndMT)3. La MTenda se puede detectar mediante tinción inmunohistoquímica doble para marcadores endoteliales como el grupo de diferenciación (CD) 31 o los marcadores de endotelio vascular (VE)-cadherina (CD144) y fibroblastos (p. ej., actina del músculo liso alfa, α-AME). Además, también establecimos previamente el papel regulador de la vía TGF-ß en este proceso con la activación de los factores de transcripción SLUG, SNAIL y TWIST3.
La MTenda es un proceso fisiológico que ocurre durante el desarrollo cardíaco embrionario y conduce a la formación de los tabiques y las válvulas a partir de las almohadillas endocárdicas4, pero también causa fibrosis orgánica en la insuficiencia cardíaca, la fibrosis renal o el cáncer y desempeña un papel clave en la aterosclerosis vascular 5,6,7,8. La EndMT en la fibrosis cardíaca se regula principalmente a través de la vía TGF-β, como hemos reportado nosotros y otros 3,9. Se han descrito diversos estímulos para inducir la MTenda: inflamación 10, hipoxia11, alteraciones mecánicas 12 y alteraciones del flujo, incluyendo alteraciones del flujo sanguíneo intracavitario 13, y la MTenda también puede ser consecuencia de una enfermedad genética 14.
Este modelo animal se desarrolló utilizando los componentes clave del desarrollo de EFE cardíaca, que son la inmadurez y las alteraciones del flujo sanguíneo intracavitario, específicamente el estancamiento del flujo. La inmadurez se cumplió utilizando corazones de ratas neonatos como donantes, ya que se sabe que las ratas neonatas son inmaduras en su desarrollo inmediatamente después del nacimiento. El trasplante cardíaco heterotópico ofrecía la provisión de restricción del flujo intracavitario15.
Desde un punto de vista clínico, este modelo animal permite investigar mejor el impacto de la MTenM en el ventrículo izquierdo (VI) en crecimiento. La restricción del crecimiento impuesta al corazón fetal y neonatal a través de la formación de EFE inducida por EndMT16 impide que los pacientes con obstrucciones del tracto de salida del ventrículo izquierdo (VOVE), como la estenosis aórtica crítica congénita y el síndrome del corazón izquierdo hipoplásico (HLHS), puedan realizar una reparación quirúrgica biventricular anatómica curativa17. Este modelo animal facilita el estudio de los mecanismos celulares y la regulación de la formación de tejidos a través de la EndMT y permite probar opciones de tratamiento farmacológico 3,18.
La ecocardiografía transabdominal se utiliza para monitorizar la viabilidad del injerto, la contractilidad y la permeabilidad de las anastomosis. Después de la eutanasia, la formación de EFE se puede observar macroscópicamente dentro de los 3 días posteriores al trasplante. El tejido EFE presenta las mismas características histopatológicas que el tejido EFE humano de pacientes con OVCE.
Por lo tanto, este modelo animal, aunque desarrollado para uso pediátrico en el espectro de HLHS, se puede aplicar en el estudio de diversas enfermedades basadas en el mecanismo molecular de EndMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este modelo animal de trasplante heterotópico de corazón de rata donante neonatal en el abdomen del receptor crea la posibilidad de estudiar la fibrosis derivada de EndMT a través de una evaluación histológica detallada del tejido, identificar vías de señalización reguladoras y probar opciones de tratamiento. Dado que EndMT es el mecanismo subyacente para las enfermedades fibróticas del corazón, este modelo tiene un gran valor en el campo de la cirugía cardíaca pediátrica y más allá. En este modelo, muchos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada por Additional Ventures – Single Ventricle Research Fund (SVRF) y Single Ventricle Expansion Fund (a I.F.) y una beca Marietta Blau de la OeAD-GmbH de fondos proporcionados por el Ministerio Federal de Educación, Ciencia e Investigación de Austria BMBWFC (a G.G.).
Materials
| Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000 | CWE, Inc. | 12-03100 | small animal ventilator |
| aSMA | Sigma | A2547 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Axio observer Z1 | Carl Zeiss | inverted microscope | |
| Betadine Solution | Avrio Health L.P. | 367618150092 | |
| CD31 | Invitrogen | MA1-80069 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DemeLON Nylon black 10-0 | DemeTECH | NL76100065F0P | 10-0 Nylon suture |
| ETFE IV Catheter, 18G x 2 | TERUMO SURFLO | SR-OX1851CA | intubation cannula |
| Micro Clip 8mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6471 | microvascular clamps |
| Nylon black monofilament 11-0 | SURGICAL SPECIALTIES CORP | AA0130 | 11-0 Nylon |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | Embedding medium for frozen tissue specimen |
| p-SMAD2/3 | Invitrogen | PA5-110155 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC. | 000A3467 | oblique shelf for intubation |
| Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0 | Braintree Scientific | NC9201231 | Silk suture |
| Slug/Snail | Abcam | ab180714 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18" | Ethicon | J493G | 5-0 Vicryl |
| Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18" | Ethicon | J492G | 6-0 Vicryl |
| VE-Cadherin | Abcam | ab231227 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Zeiss OPMI 6-SFR | Zeiss | Surgical microscope | |
| Zen, Blue Edition, 3.6 | Zen | inverted microscope software |
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