Ein schnelles Verfahren für die Visualisierung von Live-immobilisierten Hefezellen

Summary

Eine schnelle Methode zur Visualisierung von wachsenden immobilisierten Hefezellen, hier zu fluoreszierenden Reporter bei der stillen Paarung loci HML und HMR angewendet

Abstract

Wir stellen Ihnen hier eine einfache, schnelle und extrem flexible Technik zur Immobilisierung und Visualisierung von wachsenden Hefezellen durch Epifluoreszenzmikroskopie. Die Technik ist ebenso für die Visualisierung von statischen Hefepopulationen oder Zeitverläufe Experimenten bis zu 10 Stunden in der Länge geeignet. My-Mikroskopie untersucht epigenetische Vererbung auf die stille Paarung loci in S. cerevisiae. Es gibt zwei stille Paarung loci, HML und HMR, die normalerweise nicht zum Ausdruck, wie sie in Heterochromatin verpackt sind. In der sir1 mutierten Hintergrund Schweigen ist geschwächt, so dass jeder Ort kann entweder in der ausdrücklichen oder zum Schweigen gebracht epigenetische Zustand sein, so in der Bevölkerung als Ganzes gibt es einen Mix aus Zellen verschiedener epigenetische Zustände für beide HML und HMR. My-Mikroskopie gezeigt, dass es keine Beziehung zwischen der epigenetische Zustand der HML und HMR in einer einzelnen Zelle. sir1 Zellen stochastisch Schalter epigenetische Staaten, Gründung Schweigen zu einem vorher zum Ausdruck locus oder Ausdruck einer zuvor zum Schweigen Locus. Meine Zeit natürlich Mikroskopie beobachtet einzelnen sir1 Zellen und ihrer Nachkommen, um die Frequenz eines jeden der vier möglichen epigenetischen Schalter, und damit die Stabilität der einzelnen epigenetische Zustände in sir1 Zellen des Gastes. Siehe auch Xu et al., Mol. Gen. Zell 2006.

Protocol

1. Immobilisierten Zellen für die Zeit natürlich Epifluoreszenzmikroskopie. Bitte beachten Sie, dass dieses Protokoll nur dann sinnvoll, wenn die Objektive des Mikroskops unter die Mikroskoptisch.
   
   
2. Legen Sie Zellen in der gewünschten Konzentration in flüssigen Medien auf eine lange Deckglas (ca. 24x50mm)
   
   
3. Cut eine Agar-Block in der gewünschten Größe aus einem synthetischen Medien Platte (diese haben eine geringere Autofluoreszenz) und Ort über die Zellen. Legen Sie die Seite der Agar-Block nicht mit einer Pinzette in Kontakt mit den Zellen behandelt.
   
   
4. Für kürzere Zeit-Verläufe (bis zu 3 Stunden), diese Einrichtung ist ausreichend. Wenn Zellen sich bewegen, wenn visualisiert am Mikroskop, um die Lautstärke von Zellen oder erhöhen Bereich der Agar-Block.
   
   
5. Für längere Zeit Kurse, einen Tropfen frischen flüssigen Medien auf der Oberseite des Agar-Block, und legen einen Objektträger auf dem Agar-Block. Diese Folie reduziert die Verdunstung durch die Spitze der Agar-Block. Falls gewünscht, können die Ränder der Agar-Block in Kontakt mit dem Deckglas mit Vaseline weiter zu reduzieren Feuchtigkeit abgedichtet werden. Ich habe dieses Set verwendet für Filme bis zu 9 Stunden lang, mit der sich teilenden Zellen in Wildtyp-Preisen.

Discussion

Dies ist ein schnelles Verfahren, dass Hefezellen immobilisiert, während immer noch um ein Wachstum. Wir haben das Wachstum der Hefe bis zu 10 Stunden gefolgt, mit der Hefe Anzeige Wildtyp Division Preise während des gesamten Experiments. Beachten Sie, dass dieses Setup das Objektiv unter dem Mikroskop Bühne werden muss.