DNA İzolasyonu ve Restriksiyon Enzim Analizi

DNA ekstraksiyonu, DNA'nın hücrelerden çıkarılması ve saflaştırılmasıdır. İlk olarak, hücreler parçalanır - kırılır - genellikle fiziksel bozulma ve kimyasallarla, hücreyi ve nükleer zarları çözen bir deterjan gibi muamelenin bir kombinasyonu olsa da. SDS veya sodyum dodesil sülfat, bu zarları oluşturan proteinleri ve lipitleri çözündürerek çalışan, yaygın olarak kullanılan bir deterjandır. İçerikler daha sonra çevredeki çözeltiye serbestçe yüzebilir.

Daha sonra, DNA mevcut diğer moleküllerden ayrılmalıdır. Reaksiyona eklenen proteinaz K, peptit bağlarını parçalayacak ve kirletici proteinleri sindirecektir. Daha sonra numuneye tuz eklenir, bu da DNA'nın omurgasındaki negatif yüklü fosfat gruplarını stabilize eder ve buz gibi soğuk alkol ilavesinden sonra DNA'yı çözeltiden çökeltir. Beyaz çökelti, tüpün dibine çöktüğü bir santrifüjde döndürülerek toplanır. Yıkandıktan ve bir tampon çözelti içinde yeniden süspanse edildikten sonra, ekstrakte edilen DNA nihayet araştırma veya biyoteknoloji uygulamalarında kullanılabilir.

Bir bireye veya bireylere özgü DNA'daki yeni kalıpları tanımlayabilen DNA parmak izi gibi bazı biyoteknoloji uygulamaları, kısıtlama enzimlerinin kullanımını içerir. Restriksiyon enzimleri, DNA ile etkileşime giren ve belirli dizileri tanıyan moleküllerdir. Spesifik bölgeleri belirlendikten sonra DNA'yı keserler. Bu, ipliğin bir veya daha fazla doğrusal parçaya kesilmesine neden olacaktır. Ekstrakte edilen DNA, en sık bakterilerde bulunan dairesel bir DNA parçası olan bir plazmit ise, herhangi bir kesik, DNA'nın doğrusal bir parça veya parçalar oluşturmasına neden olacaktır. Farklı kısıtlama enzimleri farklı DNA dizilerini tanır, bu nedenle bunların bir kombinasyonunun kullanılması farklı fragmanların üretilmesine neden olabilir.

DNA parmak izinde, daha sonra bu parçaları DNA veya jel elektroforezi adı verilen bir teknik kullanarak inceleyebiliriz. Jelleri hazırlamak için, toz haline getirilmiş agaroz bir tampon ile karıştırılır ve çözünene kadar ısıtılır. Daha sonra ılık karışıma bir nükleotid boyası eklenir ve daha sonra bu çözelti döküm kalıbına dökülür. Kuyuları oluşturmak için bir tarak yerleştirilir. Katılaştığında jel, tamponla doldurulmuş bir jel kutusuna aktarılır ve tarak çıkarılır. Bilinen uzunluklara sahip boyalı DNA fragmanlarının bir referans karışımı olan DNA merdiveni, bir kuyucuğa eklenir ve ilgilenilen boyalı DNA örnekleri kalan kuyucuklara yüklenir. Kutu bir güç kaynağına bağlıdır ve gücün açılması, DNA nükleotidlerindeki negatif yüklü fosfat gruplarının jelden anoda, pozitif uca doğru göçünü indükler. Daha küçük parçalar, zorlukla göç eden büyük parçalardan daha hızlı hareket eder.

Çalışma tamamlandığında, DNA örneklerindeki nükleotid lekesini görselleştirmek için jel ultraviyole ışığa maruz bırakılır. Varlıkları, merdiven bantlarına göre göreceli konumlarına göre doğrulanabilir. Farklı dizilere sahip DNA'nın farklı yerlerde kesik bölgeleri olacağından, bu, bireyleri veya varyant DNA profillerini ayırt etmek için kullanılabilecek yeni bant desenleri veya parmak izleri üretebilir.

Bu laboratuvarda, deterjanların DNA izolasyonundaki önemini değerlendirmek için SDS'li ve SDS'siz bir tampon kullanarak DNA ekstraksiyonları gerçekleştirecek ve ardından elde edilen DNA profillerini incelemek için plazmit DNA'yı farklı restriksiyon enzimleri ile sindireceksiniz.