Why is monosodium phosphate an effective buffer near pH 7?

Monosodium phosphate is effective near pH 7 because its pKa range is 6.8 to 7.2, which overlaps with the target pH. Buffers are most effective close to their pKa, where the weak acid and conjugate base are present in significant concentrations. This allows the buffer to resist pH changes when small amounts of acid or base are added.

What is the role of NaOH when preparing a monosodium phosphate buffer?

NaOH is added drop-wise to shift the equilibrium toward the conjugate base, disodium phosphate, without altering the overall buffer composition. Unadjusted monosodium phosphate solutions typically have a pH of 4–6, so NaOH raises the pH to the target value of 7.0 while maintaining the buffer's capacity to resist pH changes.

How do the protonated and deprotonated forms of neutral red differ in color and light absorption?

The protonated form of neutral red is red and absorbs green light, while the deprotonated form is yellow-orange and absorbs blue-violet light. These distinct absorption wavelengths allow researchers to track the ionization state of neutral red across different pH values using absorption spectroscopy.

How does protein binding affect the properties of neutral red?

Protein binding alters both the absorbance and pKa of neutral red. When riboflavin-binding protein binds to neutral red, the pKa increases by approximately one unit, indicating that bound-protonated neutral red is a weaker acid than free protonated neutral red by an order of magnitude.

What is the isosbestic point in an absorption spectrum?

The isosbestic point is the wavelength where all absorption spectra cross at a single point, regardless of pH. Recording this wavelength helps verify data quality and indicates a clean transition between the protonated and deprotonated forms of neutral red across the pH range tested.

How do you determine the pKa of neutral red from absorbance data?

Plot absorbance intensity at lambda max versus pH for both free and bound neutral red. Calculate the midpoint between the highest and lowest absorbance values, then find the pH at which this midpoint occurs on the plotted line. That pH value is the pKa of the compound.

Why is it important to handle cuvettes correctly during spectrophotometry?

Cuvettes must be held by their textured sides and have transparent sides wiped clean before measurement to ensure accurate absorbance readings. The transparent sides must align with the spectrophotometer's light beam. Proper handling prevents fingerprints and contamination that would interfere with light transmission and distort results.

Arabellek

Kavramlar Eğitmen Hazırlığı Öğrenci Protokolü

0 görüntülenme04:35 dk.

Tamponlar, güçlü asitlerin veya bazların eklenmesinden bağımsız olarak bir sistemde sabit bir pH'ı korumak için çalışan çözeltilerdir. Tamponların yokluğunda, bir çözeltiye güçlü bir asit veya bir bazın eklenmesi pH'ı önemli ölçüde değiştirir. Tamponlar günlük yaşamda çok önemlidir. Örneğin, kan bir tampon görevi görür ve 7.8'in üzerinde veya 6.8'in altında bir pH ölüme neden olabileceğinden, pH'ı 7.35 ile 7.45 arasında tutabilir.

Peki, bir tampon nasıl çalışır? Bir tampon, esasen zayıf bir asit veya baz ve onun eşlenik bazı veya birbiriyle dengede olan asittir. Örneğin, asetik asit ve sodyum asetattan yapılmış bir tampon alın. Tampon çözeltisi, zayıf bir asit ve eşlenik baz asetatı oluşturmak üzere ayrışan eşlenik tuzunu içerir. Çözelti asidiktir çünkü asetik asidin KA'sı, eşlenik bazın KB'sinden daha yüksektir.

Ayrışma sabitinin, K_a veya K_b'nin, bileşiğin sudaki ayrışması için denge sabiti olduğu için sırasıyla asit veya bazın gücünü tanımladığını unutmayın. Ayrışma sabiti aynı zamanda pK_a veya K_a'nın negatif günlüğü olarak da temsil edilebilir, burada pK_a ne kadar küçükse, asit o kadar güçlü olur. Aynısı pK_b için de geçerlidir, burada pK_b ne kadar küçükse, baz o kadar güçlü olur.

Asetat tamponuna dönersek, sodyum hidroksit gibi güçlü bir baz eklersek, hidroksit iyonları çözeltide bulunan hidronyum iyonları ile reaksiyona girer. Bu, dengeye dönmek için daha fazla asetik asidin su ile reaksiyona girmesine ve böylece daha fazla hidronyum iyonu oluşturmasına neden olur. Hidroklorik asit gibi güçlü bir asit eklersek, çözeltide daha fazla hidronyum iyonu oluşur. Bu iyonlar, daha fazla asetik asit oluşturmak için asetat iyonları ile reaksiyona girer. Her iki durumda da çözelti pH'ında çok az değişiklik olur.

Her tamponun, bir çözeltiyi tamponlayabileceği belirli bir pH aralığına sahip olduğunu unutmayın. Burada asetik asit tamponumuz için bir titrasyon eğrisi gösteriyoruz. Arabelleğe alma aralığı vurgulanır. Bu bölge, tamponun pH'ının zayıf asidin KA'sı ve eşlenik bazın zayıf aside oranı ile belirlendiğini söyleyen Henderson-Hasselbalch denklemi ile belirlenir.

Bu pH'tan çok uzakta, tamponun zayıf asidi veya bazı tükenir ve pH'ı tamponlayamaz. Bu nedenle, uygulamanız için bir tampon seçerken, pK_a'sı istenen pH'a yakın olan bir tampon seçin.

Son olarak, tüm tamponların tamponlama kapasitelerinin bir sınırı vardır, bu da pH önemli ölçüde değişmeden önce tampon çözeltisine eklenebilecek asit veya baz miktarı anlamına gelir. Örneğin, asetik asit ve sodyum asetat tampon çözeltimize çok fazla asit eklersek, tüm asetat iyonlarını protonlaştıracağız ve çok sayıda hidronyum iyonu biriktireceğiz, böylece pH'ı düşüreceğiz.

Benzer şekilde, çok fazla baz eklersek, tüm asetik asidi protondan arındıracağız ve çok sayıda hidroksit iyonu biriktireceğiz, böylece pH'ı artıracağız. Bu nedenle, tamponlama kapasitesi, zayıf asit ve eşlenik tuzun konsantrasyonundan etkilenir. Bu nedenle, 1 molar asetat tamponu, 0.1 molar asetat tamponundan daha yüksek bir tamponlama kapasitesine sahiptir.

Bu laboratuvarda, çok çeşitli pH aralıklarına sahip tamponları hazırlayacak ve inceleyeceksiniz. Daha sonra, nötr kırmızı olarak adlandırılan bir pH göstergesinin pK_a'sını belirlemek için tamponlarınızı kullanacak ve riboflavin bağlayıcı protein eklendiğinde nötr kırmızının pK_a'sındaki değişikliği keşfedeceksiniz.

Print Procedure Steps

Kaynak: Smaa Koraym, Johns Hopkins Üniversitesi, MD, ABD

50 mM NaH₂PO₄ Tamponu Hazırlanıyor, pH 7

Bu deneyin ilk bölümünde, pH 7.0'da tamponlanmış bir sodyum fosfat çözeltisi hazırlayacaksınız. Monosodyum fosfat, eşlenik baz olan disodyum fosfat ile zayıf bir asittir. Ayarlanmamış monosodyum fosfat çözeltileri genellikle yaklaşık 4-6 arasında bir pH'a sahiptir.

Tamponlar, monosodyum fosfat için 6.8 ila 7.2 olan pKa'larına yakın yerlerde en etkilidir. Bu nedenle, tampon dengesinin genel bileşimini değiştirmeden dengeyi eşlenik baza doğru itmek için NaOH kullanacaksınız.

Deneye başlamadan önce, 50 mM'lik bir çözeltinin 200 mL'sini yapmak için ihtiyaç duyacağınız monosodyum fosfat kütlesini hesaplayın.

Tablo 1: 50 mM NaH₂PO₄ Tamponunun Hazırlanması, pH 7.0

NaH'nin molar kütlesi₂PO₄ = 119.98 g/mol
Çözelti hacmi (mL)	200
Molarite (mM)	50
NaH_{molleri 2}PO₄ (mol)
İhtiyaç duyulan kütle (mg)
1 M NaOH (mL) başlangıç hacmi
1 M NaOH (mL) son hacmi
Kullanılan NaOH hacmi (mL)
İhtiyaç duyulan DI su hacmi (mL)

Tablo 1'i indirmek için buraya tıklayın

Başlamak için laboratuvar önlüğü, su sıçramasına dayanıklı koruyucu gözlükler ve eldivenler dahil olmak üzere gerekli kişisel koruyucu ekipmanı giyin. not: Laboratuvarın bu bölümünde aşındırıcı ve toksik olan NaOH kullanılır. NaOH dökerken ve taşırken dikkatli olun.
250 mL'lik bir plastik yıkama şişesini deiyonize suyla doldurun.
Biri nötr sulu atık ve diğeri temel sulu atık için olmak üzere iki adet 100 mL'lik beheri etiketleyin.
Sağlanan tamponları kullanarak pH metrenizi kalibre edin. İşiniz bittiğinde probu saklama solüsyonunda saklayın.
Tartım kağıdının darasını alın ve hesaplamalarınıza göre gereken monosodyum fosfat miktarını ölçmek için temiz bir spatula kullanın. Laboratuvar defterinize tam monosodyum fosfat miktarını kaydedin. not: Monosodyum fosfat havadaki nemi emer, bu nedenle doğru bir ölçüm elde etmek için hızlı çalışın ve işiniz bittiğinde kabı sıkıca kapatın.
Monosodyum fosfatı 400 mL'lik bir behere yerleştirin ve spatulayı bir laboratuvar mendiliyle temizleyin. Çeker ocaklarınıza dönmeden önce tartı kağıdını ve laboratuvar mendilini atın.
175 mL deiyonize suyu ölçmek için dereceli bir silindir kullanın. Suyu monosodyum fosfat kabına dökün ve manyetik bir karıştırma çubuğu ekleyin.
Tuz tamamen eriyene ve çözelti homojen görünene kadar çözeltiyi karıştırın. Bu genellikle 2 - 3 dakika sürer.
15 mL deiyonize suyu ölçün ve kabın içine dökün. Çözeltiyi tekrar homojen görünene kadar karıştırmaya devam edin (yaklaşık 1 – 2 dakika). Karıştırma motorunu kapatın.
pH probunu deiyonize suyla durulayın ve ardından sensör karıştırma çubuğunun üzerindeyken solüsyona sıkıştırın.
10 mL'lik dereceli bir silindir ve saat camını dağıtım başlığına getirin ve 10 mL 1 M NaOH ölçün. Dereceli silindirdeki tam hacmi not edin.
NaOH'nizi saat camıyla örtün ve dikkatlice çeker ocakınıza getirin.
Monosodyum fosfat çözeltisini karıştırmaya devam edin. PH okumasını izlerken, karıştırma çözeltisine damla damla yavaşça NaOH eklemek için tek kullanımlık bir pipet kullanın. Tampon pH'ı 7.0'a ulaştığında, pipette kalan NaOH'yi dereceli silindire geri koyun.
Arabelleğe eklediğiniz NaOH hacmini hesaplayın. Toplam 200 mL'lik bir çözelti hacmine ulaşmak için tamponunuza ne kadar deiyonize su eklemeniz gerektiğini belirlemek için bu hacmi 10 mL'den çıkarın.
Deiyonize suyu başka bir 10 mL dereceli silindirle ölçün ve tamponu yapmayı bitirmek için karıştırma çözeltisine ekleyin.
pH sensörünü deiyonize suyla durulayın, saklama solüsyonu dolu kapakla kapatın ve probunun fişini çekin veya kapatın.
250 mL'lik bir polietilen şişeyi '50 mM monosodyum fosfat tamponu, pH 7.0' olarak etiketleyin. Manyetik karıştırma çubuğunu çözeltiden alın.
Tampon çözeltisini etiketli şişeye dökmek için bir huni kullanın ve sıkıca kapatın.

Serbest ve Bağlı Nötr Kırmızının Absorpsiyon Spektroskopisi
Tamponlar, belirli pH değerlerindeki bileşikleri değerlendirmek için kullanılabilir. Bu bölümde, nötr kırmızı göstergenin absorbans spektrumunu çeşitli tamponlarda kaydedeceksiniz. Nötr kırmızının protonlanmış formu kırmızıdır ve protondan arındırılmış form sarı-turuncudur, yani sırasıyla yeşil ve mavi-mor ışığı emerler. Bu nedenle, asidik ve bazik formlar farklı absorpsiyon dalga boylarına sahiptir. Protein bağlanması, nötr kırmızının özelliklerini değiştirerek hem absorbansını hem de pKa'sını değiştirir.

Serbest nötr kırmızının absorbans spektrumunu birkaç pH değerinde ölçtükten sonra, çözeltilere riboflavin bağlayıcı protein veya RP ekleyecek ve absorbansları tekrar ölçeceksiniz. Absorbans yoğunluğu konsantrasyon ile ilgilidir, bu nedenle laboratuvardan sonra serbest ve bağlı nötr kırmızının pKa'sını belirlemek için spektrumları kullanacaksınız.
- Laboratuvar not defterinize aşağıdaki tabloyu çizin. Küvetleri 1'den 10'a kadar numaralandırın ve kullanacağınız dokuz tampon pH değerini listeleyin. 10. küvet, deiyonize bir su boşluğu olacaktır. not: Küvetleri her zaman dokulu kenarlarından tutun ve küveti spektrofotometreye koymadan hemen önce şeffaf kenarlarını silin. Saydam kenarları spektrofotometredeki ışık huzmesi ile hizalamayı unutmayın.
  Tablo 2: Serbest ve Bağlı Nötr Kırmızının Absorbansı
  
  Küvet # Tampon pH Abs. λ_max'ta(Serbest NRH⁺) Abs. λ_max'ta (Bağlı NRH)
  1 5.0
  2 5.5
  3 6.0
  4 6.5
  5 7.0
  6 7.5
  7 8.0
  8 8.5
  9 11
  10 blank
  Tablo 2'yi indirmek için buraya tıklayın
- On adet 1,5 mL'lik küvet ve kapak edinin ve 1'den 10'a kadar olan kapakları laboratuvar not defterinizdeki tabloyla eşleşecek şekilde etiketleyin.
- 25 mL'lik bir kabı 'DIH2O' olarak etiketleyin ve deiyonize suyla doldurun.
- Nötr sulu atıklarınızı kanalizasyona boşaltın ve kabı 'sulu tampon atığı' olarak yeniden etiketleyin.
- Kullanılmış mikropipet uçları için 400 mL'lik bir beher etiketleyin.
- 1 mL'lik bir mikropipete bir uç takın ve 1000 μL deiyonize suyu küvet 10'a dağıtmak için kullanın. Bu sizin çözücü boşluğunuz.
- pH 7.0 monosodyum fosfat tamponunuzun 925 μL'sini küvet 5'e yerleştirin.
- Kalan boş küvetleri arabellek masasına getirin. Laboratuvar not defterinizdeki tablonun rehberliğinde, etiketli mikropipetleri kullanarak her bir tampondan 925 μL'yi uygun küvete dağıtın. Farklı tamponlar için aynı pipet ucunu kullanmamaya dikkat edin.
- İşiniz bittiğinde, arabellekleri çalışma tezgahınıza geri getirin. Orada, 75 μL'yi dağıtmak için 200 μL'lik bir mikropipet ayarlayın ve mikropipete bir uç takın.
- Dokuz tampon küvetinin her birine 75 μL nötr kırmızı dağıtın. Çözeltileri iyice karıştırmak için her küveti birkaç kez ters çevirin. not: Pipet ucunu bir tampona temas ederse değiştirin.
- Her arabellekle nötr kırmızıyı karıştırdıktan sonra, bir resim çekin veya çözeltilerin renklerini yazın.
- Elde tutulan bir spektrofotometreyi açın ve ışık kaynağının ısınmasına izin verin. Hazır olduğunda, serbest nötr kırmızı için dalga boyuna karşı absorbansı ölçmek için yeni bir deney oluşturun.
- Deiyonize su küvetini yerleştirin ve deiyonize suyun bir spektrumunu elde edin. Çözücü arka plan veya boş olarak ayarlayın.
- Ardından, boşluğu çıkarın ve nötr kırmızı küveti, en yüksek protonlanmış nötr kırmızı konsantrasyonuna sahip olacak en düşük pH tamponuna yerleştirin.
- Güçlü bir tepe göstermesi gereken bir spektrum edinin. Bu zirvenin en yüksek noktasına veya maksimuma karşılık gelen dalga boyunu belirleyin. Bu dalga boyunu laboratuvar not defterinize protonlanmış serbest nötr kırmızı için lambda max olarak kaydedin.
- Verileri kaydedin ve küveti çıkarın. Absorbansı dizüstü bilgisayarınıza kaydedin, ardından aynı prosedürü kullanarak 2 - 9 arasındaki küvetler için spektrumları toplayın.
- İzosbestik noktanın dalga boyunu laboratuvar not defterinize kaydedin. Tüm spektrumların tek bir dalga boyunda kesiştiği yer burasıdır. Bu noktada bir spektrum geçmezse, küveti boşaltın ve temizleyin, taze bir numune hazırlayın ve tekrar deneyin.
- Dokuz küvetin tümü için spektrum toplamayı bitirdikten sonra verileri kaydedin ve dışa aktarın.
- Bağlı nötr kırmızı için dalga boyuna karşı absorbansı ölçmek için yeni bir deney oluşturun.
- 200 μL'lik mikropipete yeni bir uç takın ve boşluk da dahil olmak üzere her küvete 75 μL riboflavin bağlayıcı protein solüsyonu ekleyin. Ucu çıkarın, küvet kapaklarını sabitleyin ve çözeltileri karıştırmak için küveti birkaç kez ters çevirin.
- Küvet 10'u spektrofotometreye yerleştirin ve çözücü boşluğu olarak ayarlayın.
- En düşük pH örneğinin spektrumunu elde edin ve en yoğun tepe noktasının maksimumuna karşılık gelen dalga boyunu belirleyin. Protonlanmış bağlı nötr kırmızının lambda maksimumu olarak laboratuvar defterinize kaydedin.
- 2 - 9 arasındaki küvetler için spektrumları, ücretsiz nötr kırmızı numuneler için yaptığınız gibi alın. Tablonuzdaki protonlanmış nötr kırmızı için lambda max'taki yoğunlukları, izosbestik noktadaki dalga boyuyla birlikte kaydedin.
- İşiniz bittiğinde, verilerinizi kaydedin, daha sonra analiz etmek üzere dışa aktarın ve spektrofotometreyi kapatın.
- Tüm ekipmanı kaldırın ve kullanılmış pipet uçlarınızı onaylı bir atık kabına veya çöp kutusuna atın.
- Küvetleri sulu tampon atık kabına boşaltın ve küvetleri deiyonize su ile behere durulayın.
- Fazla NaOH'yi temel atığa boşaltın ve dereceli silindiri suyla durulayın.
- Temel sulu atıkları, diğer sulu atıklarla birlikte bol musluk suyuyla kanalizasyona akıtın.
- Cam eşyalarınızı, küvet kapaklarınızı ve karıştırma çubuğunuzu laboratuvar standart prosedürlerinize göre yıkayın. Çalışma yüzeylerinizi nemli bir kağıt havluyla temizleyin ve kullanılmış kağıt havluları ve laboratuvar mendillerini laboratuvar çöpüne atın.
Results
Şimdi, nötr kırmızının pKa'larını belirlemek için absorbans verilerimizi analiz edelim.

Tablo 3: Nötr Kırmızı pKa'ların Belirlenmesi

Ücretsiz NRH⁺ Bağlı NRH⁺
λ_maks (nm)
ΔA (nm)
Orta nokta (nm)
pKa

Tablo 3'ü indirmek için buraya tıklayın
- Her iki yoğunluk verisi setini, noktalar düz çizgilerle birleştirilecek şekilde, y ekseninde lambda maksimumunda ve x ekseninde pH'ta absorbans yoğunluğu ile çizin.
- Her veri serisi için başlangıç ve bitiş absorbans yoğunlukları arasındaki farkı hesaplayın.
- Her seri için başlangıç ve bitiş absorbansları arasındaki absorbansı veya absorbans orta noktalarını belirleyin.
- Her satırda orta noktanın nerede oluştuğunu bulun ve bu noktadaki pH değerini belirleyin. Bu pH değerleri, serbest ve bağlı nötr kırmızının pKa'larıdır.
- Burada, serbest ve bağlı nötr kırmızı arasında yaklaşık bir pKa'lık bir artış görüyoruz, bu da bağlı protonlanmış nötr kırmızının, büyüklük sırasına göre serbest protonlanmış nötr kırmızıdan daha zayıf bir asit olduğunu gösteriyor.