Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Kaynak: Smaa Koraym, Johns Hopkins Üniversitesi, MD, ABD
Bu deneyin ilk bölümünde, pH 7.0'da tamponlanmış bir sodyum fosfat çözeltisi hazırlayacaksınız. Monosodyum fosfat, eşlenik baz olan disodyum fosfat ile zayıf bir asittir. Ayarlanmamış monosodyum fosfat çözeltileri genellikle yaklaşık 4-6 arasında bir pH'a sahiptir.
Tamponlar, monosodyum fosfat için 6.8 ila 7.2 olan pKa'larına yakın yerlerde en etkilidir. Bu nedenle, tampon dengesinin genel bileşimini değiştirmeden dengeyi eşlenik baza doğru itmek için NaOH kullanacaksınız.
| NaH'nin molar kütlesi2PO4 = 119.98 g/mol | |
| Çözelti hacmi (mL) | 200 |
| Molarite (mM) | 50 |
| NaHmolleri 2PO4 (mol) | |
| İhtiyaç duyulan kütle (mg) | |
| 1 M NaOH (mL) başlangıç hacmi | |
| 1 M NaOH (mL) son hacmi | |
| Kullanılan NaOH hacmi (mL) | |
| İhtiyaç duyulan DI su hacmi (mL) | |
Tamponlar, belirli pH değerlerindeki bileşikleri değerlendirmek için kullanılabilir. Bu bölümde, nötr kırmızı göstergenin absorbans spektrumunu çeşitli tamponlarda kaydedeceksiniz. Nötr kırmızının protonlanmış formu kırmızıdır ve protondan arındırılmış form sarı-turuncudur, yani sırasıyla yeşil ve mavi-mor ışığı emerler. Bu nedenle, asidik ve bazik formlar farklı absorpsiyon dalga boylarına sahiptir. Protein bağlanması, nötr kırmızının özelliklerini değiştirerek hem absorbansını hem de pKa'sını değiştirir.
Serbest nötr kırmızının absorbans spektrumunu birkaç pH değerinde ölçtükten sonra, çözeltilere riboflavin bağlayıcı protein veya RP ekleyecek ve absorbansları tekrar ölçeceksiniz. Absorbans yoğunluğu konsantrasyon ile ilgilidir, bu nedenle laboratuvardan sonra serbest ve bağlı nötr kırmızının pKa'sını belirlemek için spektrumları kullanacaksınız.
| Küvet # | Tampon pH | Abs. λmax'ta (Serbest NRH+) | Abs. λmax'ta (Bağlı NRH) |
| 1 | 5.0 | ||
| 2 | 5.5 | ||
| 3 | 6.0 | ||
| 4 | 6.5 | ||
| 5 | 7.0 | ||
| 6 | 7.5 | ||
| 7 | 8.0 | ||
| 8 | 8.5 | ||
| 9 | 11 | ||
| 10 | blank |
Şimdi, nötr kırmızının pKa'larını belirlemek için absorbans verilerimizi analiz edelim.
| Ücretsiz NRH+ | Bağlı NRH+ | |
| λmaks (nm) | ||
| ΔA (nm) | ||
| Orta nokta (nm) | ||
| pKa |
Tablo 3'ü indirmek için buraya tıklayın
Bu deneyin ilk bölümünde, pH 7.0'da tamponlanmış bir sodyum fosfat çözeltisi hazırlayacaksınız. Monosodyum fosfat, eşlenik baz disodyum fosfat ile zayıf bir asittir. Ayarlanmamış monosodyum fosfat çözeltileri genellikle yaklaşık 4 ila 6 arasında bir pH'a sahiptir.
Tamponlar, monosodyum fosfat için 6.8 ila 7.2 olan pKa'larına yakın yerlerde en etkilidir. Bu nedenle, tampon dengesinin genel bileşimini değiştirmeden dengeyi eşlenik baza doğru itmek için sodyum hidroksit kullanacaksınız. Laboratuara başlamadan önce, 200 mililitre 50 milimolar çözelti yapmak için ihtiyaç duyacağınız monosodyum fosfat kütlesini hesaplayın.
Laboratuvarın bu bölümünde aşındırıcı ve toksik olan sodyum hidroksit kullanılır. Sodyum hidroksit dökerken ve taşırken dikkatli olun. Şimdi başlayalım.
İlk olarak, bir laboratuvar önlüğü, su sıçramasına dayanıklı koruyucu gözlükler ve nitril eldivenler giyin. Ardından, 250 mililitrelik bir plastik yıkama şişesini deiyonize suyla doldurun. Sırasıyla nötr ve bazik sulu atıklar için iki adet 100 mililitrelik beheri etiketleyin.
Ardından, sağlanan tamponları kullanarak pH metrenizi kalibre edin. İşiniz bittiğinde probu saklama solüsyonunda saklayın. Şimdi, ihtiyaç duyacağınız monosodyum fosfatı elde etmek için analitik terazi alanına 400 mililitrelik bir beher getirin.
Bir parça tartı kağıdının darasını alın ve hesaplamalarınıza göre gerekli monosodyum fosfat miktarını ölçmek için temiz bir spatula kullanın. Monosodyum fosfat havadaki nemi emer, bu nedenle doğru bir ölçüm elde etmek için hızlı çalışın ve işiniz bittiğinde kabı sıkıca kapatın. Ölçtüğünüz monosodyum fosfat miktarını laboratuvar defterinize kaydedin.
Ardından, monosodyum fosfatı behere yerleştirin ve spatulayı bir laboratuvar mendili ile temizleyin. Çeker ocaklarınıza dönmeden önce tartı kağıdını ve laboratuvar mendilini atın. Şimdi, 175 mililitre deiyonize suyu ölçmek için dereceli bir silindir kullanın.
Suyu monosodyum fosfat kabına dökün ve manyetik bir karıştırma çubuğu ekleyin. Tuz tamamen eriyene ve çözelti homojen görünene kadar çözeltiyi bir karıştırma plakası üzerinde karıştırın. Bu genellikle iki ila üç dakika sürer.
Ardından, dereceli bir silindir ile 15 mililitre deiyonize su ölçün. Deiyonize suyu behere dökün ve çözeltiyi tekrar homojen görünene kadar karıştırmaya devam edin, bu genellikle bir ila iki dakika sürer. Ardından karıştırma motorunu kapatın.
pH probunu deiyonize su ile durulayın ve ardından sensör karıştırma çubuğunun üzerindeyken solüsyona sıkıştırın. Şimdi, 10 mililitrelik dereceli bir silindir ve saat camını dağıtım başlığına getirin ve 10 mililitre 1 molar sodyum hidroksit ölçün. Sodyum hidroksitinizi saat camıyla örtün ve dikkatlice çeker ocakınıza getirin.
Dereceli silindirdeki tam hacmi not edin. Ardından, monosodyum fosfat çözeltisini karıştırmaya devam edin. PH okumasını izlerken, karıştırma çözeltisine damla damla yavaşça sodyum hidroksit eklemek için tek kullanımlık bir pipet kullanın.
Tampon pH'ı 7.0'a ulaştığında, pipette bulunan sodyum hidroksiti dereceli silindire geri koyun. Ardından, dereceli silindirdeki ilk ve son hacimlerden eklediğiniz sodyum hidroksit hacmini hesaplayın. Toplam 200 mililitrelik bir çözelti hacmine ulaşmak için tamponunuza ne kadar deiyonize su eklemeniz gerektiğini belirlemek için bu hacmi 10 mililitreden çıkarın.
İhtiyacınız olan deiyonize suyu başka bir 10 mililitre dereceli silindirle ölçün ve tamponu yapmayı bitirmek için karıştırma çözeltisine ekleyin. pH sensörünü deiyonize suyla durulayın, saklama solüsyonu dolu kapakla kapatın ve probun fişini çekin veya kapatın. Bundan sonra, 250 mililitrelik bir polietilen şişeyi 50 milimolar monosodyum fosfat tamponu olarak etiketleyin, pH 7.0'Manyetik karıştırma çubuğunu çözeltiden almak için forseps kullanın.
Ardından, şişenin ağzına bir huni yerleştirin ve tampon çözeltisini şişeye dökün. Huniyi çıkarın ve şişeyi sıkıca kapatın. Artık absorpsiyon spektroskopisi bölümüne geçmeye hazırsınız.
Tamponlar, belirli pH değerlerindeki bileşikleri değerlendirmek için kullanılabilir. Bu bölümde, nötr kırmızı göstergenin absorbans spektrumunu çeşitli tamponlarda kaydedeceksiniz. Nötr kırmızının protonlanmış formu kırmızıdır ve protondan arındırılmış form sarı-turuncudur, yani sırasıyla yeşil ve mavi-mor ışığı emerler.
Bu nedenle, asidik ve bazik formlar farklı absorpsiyon dalga boylarına sahiptir. Protein bağlanması, nötr kırmızının özelliklerini değiştirerek hem absorbansını hem de pKa'sını değiştirir. Serbest nötr kırmızının absorbans spektrumunu birkaç pH değerinde ölçtükten sonra, çözeltilere riboflavin bağlayıcı protein veya RP ekleyecek ve absorbansları tekrar ölçeceksiniz.
Absorbans yoğunluğu konsantrasyon ile ilgilidir, bu nedenle laboratuvardan sonra serbest ve bağlı nötr kırmızının pKa'sını belirlemek için spektrumları kullanacaksınız. Bu bölüme başlamadan önce, laboratuvar not defterinize küvet numarasını, tampon pH'ını, serbest protonlanmış nötr kırmızı için lambda maksimumunda absorbansı ve bağlı protonlanmış nötr kırmızı için lambda max'ta absorbasyonu listeleyen bir tablo çizin. Küvetleri 1'den 10'a kadar numaralandırın ve kullanacağınız dokuz tampon pH değerini listeleyin.
10. küvet, deiyonize bir su boşluğu olacaktır. Küvetleri her zaman dokulu kenarlarından tutun ve küveti spektrofotometreye koymadan hemen önce şeffaf kenarlarını silin. Saydam kenarları spektrofotometredeki ışık huzmesi ile hizalamayı unutmayın.
Şimdi başlayalım. On adet 1,5 mililitrelik küvet ve kapak edinin ve 1'den 10'a kadar olan kapakları laboratuvar not defterinizdeki tabloya uyacak şekilde etiketleyin. 25 mililitrelik bir kabı DIH2O' olarak etiketleyin ve deiyonize su ile doldurun.
Ardından, nötr sulu atıklarınızı kanalizasyona akıtın ve kabı sulu tampon atığı olarak yeniden etiketleyin'Ayrıca, kullanılmış mikropipet uçları için 400 mililitrelik bir beher etiketleyin. Ardından, 1 mililitrelik bir mikropipete bir uç takın ve 1000 mikrolitre deiyonize suyu küvet 10'a dağıtmak için kullanın. Bu sizin çözücü boşluğunuz olacaktır.
Şimdi ucu çıkarın, mikropipeti 925 mikrolitre dağıtacak şekilde ayarlayın ve yeni bir uç takın. 925 mikrolitre pH 7.0 monosodyum fosfat tamponunuzu küvet beşe yerleştirin. Ucu çıkarın ve küveti kapatın.
Ardından, kalan boş küvetleri tampon masasına getirin. Laboratuvar not defterinizdeki tablonun rehberliğinde, etiketli mikropipetleri kullanarak her bir arabellekten 925 mikrolitreyi uygun küvete dağıtın. Farklı tamponlar için aynı pipet ucunu kullanmamaya dikkat edin.
İşiniz bittiğinde, arabellekleri tezgahınıza geri getirin. Orada, 75 mikrolitreyi dağıtmak için 200 mikrolitrelik bir mikropipet ayarlayın ve mikropipete bir uç takın. Şimdi, başka bir öğrenci grubuyla paylaşılabilecek bir şişe veya nötr kırmızı çözelti tüpü edinin.
Dokuz tampon küvetinin her birine 75 mikrolitre nötr kırmızı dağıtın. Pipet ucunu bir tampona temas ederse değiştirin. Pipet ucunu çıkarın ve işiniz bittiğinde küvetlerin kapağını kapatın.
Şimdi, çözeltileri iyice karıştırmak için her küveti birkaç kez ters çevirin. Nötr kırmızıyı her arabellekle karıştırdıktan sonra, bir resim çekin veya çözeltilerin renklerini yazın. Ardından, elde tutulan bir spektrofotometreyi açın ve ışık kaynağının ısınmasını bekleyin.
Hazır olduğunda, serbest nötr kırmızı için dalga boyuna karşı absorbansı ölçmek için yeni bir deney oluşturun. Ardından, deiyonize su küvetini yerleştirin. Deiyonize suyun bir spektrumunu elde edin ve bunu bir çözücü arka plan veya boş olarak ayarlayın.
Ardından, işlenmemiş parçayı spektrofotometreden çıkarın ve nötr kırmızı küveti, en yüksek protonlanmış nötr kırmızı konsantrasyonuna sahip olacak en düşük pH tamponuna yerleştirin. Güçlü bir tepe göstermesi gereken bir spektrum edinin. Bu zirvenin en yüksek noktasına veya maksimuma karşılık gelen dalga boyunu belirleyin.
Bu dalga boyunu laboratuvar not defterinize protonlanmış serbest nötr kırmızı için lambda max olarak kaydedin. Verileri kaydedin ve küveti çıkarın. Absorbansı not defterinize kaydedin, ardından aynı prosedürü kullanarak 2'den 9'a kadar olan küvetler için spektrumları toplayın.
Spektrumların tümü, izosbestik nokta adı verilen tek bir noktada kesişmelidir. Bu noktanın dalga boyunu laboratuvar not defterinize kaydedin. Bu noktada bir spektrum geçmezse, küveti boşaltın ve temizleyin, taze bir numune hazırlayın ve tekrar deneyin.
9 küvetin tümü için spektrum toplamayı bitirdiğinizde, verileri kaydedin ve dışa aktarın. Ardından, bağlı nötr kırmızı için dalga boyuna karşı absorbansı ölçmek için yeni bir deney oluşturun. 200 mikrolitrelik mikropipete yeni bir uç takın ve ortak bir riboflavin bağlayıcı protein kabı elde edin.
Boşluk da dahil olmak üzere her küvete 75 mikrolitre riboflavin bağlayıcı protein çözeltisi ekleyin. Ucu çıkarın, küvet kapaklarını sabitleyin ve çözeltileri karıştırmak için küveti birkaç kez ters çevirin. Şimdi, küveti 10 spektrofotometreye yerleştirin ve çözücü boşluğu olarak ayarlayın.
Ardından, en düşük pH örneğinin bir spektrumunu elde edin ve en yoğun tepe noktasının maksimumuna karşılık gelen dalga boyunu belirleyin. Protonlanmış bağlı nötr kırmızının lambda maksimumu olarak laboratuvar defterinize kaydedin. Bundan sonra, 2'den 9'a kadar olan küvetler için ücretsiz nötr kırmızı numuneler için yaptığınız gibi spektrumlar elde edin.
Tablonuzdaki protonlanmış nötr kırmızı için lambda max'taki yoğunlukları, izosbestik noktadaki dalga boyuyla birlikte kaydedin. İşiniz bittiğinde verilerinizi kaydedin, daha sonra analiz etmek üzere dışa aktarın ve spektrofotometreyi kapatın. Mikropipetleri, uç kutularını, pH metreyi ve spektrofotometreyi kaldırın.
Kullanılmış pipet uçlarınızı onaylı bir atık kabına veya çöp kutusuna atın. Şimdi, küvetleri sulu tampon atık kabına boşaltın ve küvetleri deiyonize su ile behere durulayın. Çeker ocakta, fazla sodyum hidroksiti temel atığa boşaltın ve dereceli silindiri suyla durulayın.
Temel sulu atıkları, diğer sulu atıklarla birlikte bol musluk suyu ile kanalizasyona yıkayın. Cam eşyalarınızı, küvet kapaklarınızı ve karıştırma çubuğunuzu laboratuvar standart prosedürlerinize göre yıkayın. Son olarak, çalışma yüzeylerinizi nemli bir kağıt havluyla temizleyin ve kullanılmış kağıt havluları ve laboratuvar mendillerini laboratuvar çöpüne atın.
Şimdi, nötr kırmızının pKa'larını belirlemek için absorbans verilerimizi analiz edelim. İlk olarak, her iki yoğunluk verisi setini de y ekseninde lambda maks'ta absorbans yoğunluğu ve x ekseninde pH ile noktalar düz çizgilerle birleştirilecek şekilde çizin. Ardından, her veri serisi için başlangıç ve bitiş absorbans yoğunlukları arasındaki farkı hesaplayın.
Bunu, her seri için başlangıç ve bitiş absorbansları arasındaki absorbansı veya absorbans orta noktalarını hesaplamak için kullanın. Şimdi, her çizgide orta noktanın nerede oluştuğunu bulun ve o noktadaki pH değerini belirleyin. Bu pH değerleri, serbest ve bağlı nötr kırmızının pKa'larıdır.
Burada, serbest ve bağlı nötr kırmızı arasında yaklaşık 1'lik bir pKa artışı görüyoruz, bu da bağlı protonlanmış nötr kırmızının, büyüklük sırasına göre serbest protonlanmış nötr kırmızıdan daha zayıf bir asit olduğunu gösteriyor.
