Ölçme Caenorhabditis elegans Katı Medya Ömrü

Özet

Bu yazıda, UV öldürüldü bakteriyel gıda ile sağlam bir medya üzerinde muhafaza nematod ömrü ölçmek için genel bir protokol mevcut.

Özet

Yaşlanma, hücresel bileşenleri ve ölüm ile sonuçlanan organelleri ilerleyici bir bozulma ile karakterize dejeneratif bir süreç. Nematod

Protokol

Bölüm 1: hazırlayın nematod büyüme ortamı (NGM) plakaları.

Bu bölümde, ömrü deneyde kullanılmak üzere sağlam NGM plakaların hazırlanmasında açıklamaktadır. Ampisilin (Amp) ve NGM eklendi fluorodeoxyuridine (FUDR) hiçbir katkı maddesi ve Amp / FUDR tabak, içeren standart NGM tabak, temel bir ömrü deney iki tip plakalar gerektirir. Ampisilin yabancı bakteri bulaşmasını önlemek için kullanılır. FUDR, hücre bölünmesini inhibe yumurta üretimini azaltır, ve kuluçkalık yumurta engeller. Uzun ömürlü analiz için FUDR yetişkin kullanım ömrü etkileyecek ve birkaç gün büyüyen larva onları ayırmak için her solucanları aktarmak için gereksinimini ortadan kaldırır. Her iki tür plakaların E. ile seeded sonradan UV ışınlarına maruz tarafından öldürülen coli OP50 bakteri.

1. NGM (tarifi ve depolama notları için bkz: Bölüm 5) ve etiket petri tabak hazırlayın. NGM 10 ml başına 1 60 mm petri tabak gerekir. Önceden hazırlanmış katı NGM ile başlayan iseniz, 1.2 adıma geçin. Taze otoklavlanmış NGM ile başlayan iseniz, 1.4 adıma geçin.
2. Tamamen katı NGM 30 saniyelik bakliyat yüksek mikrodalga eritebilir. Kadar bina basınçlı gaz kabarcıklarını engellemek için bakliyat arasındaki Swirl medya.
3. 55 ° C su banyosu ya da soğutmak için bankta Yeri sıvı NGM.
4. Bir kez NGM ulaştığında 55 ° C, 150 mM FUDR 33 mcL ve 100 mg / ml, 100 ml NGM başına ampisilin (Amp / FUDR plakalar için) ve karıştırın girdap 100 mcL ekleyin. NGM plakaları için ek ilaçsız, 1.5 adıma doğrudan geçin.
5. Her 60 mm petri tabak içine steril tekniği, pipetle 10 ml NGM kullanma. Mümkünse kabarcıklar oluşturan kaçının. Kabarcıkları varsa, bunlar bir pipet kullanarak attı.
6. NGM katılaşmaya ve kuru izin kapaklarını bankta plakaları bırakın. Mümkünse, bakteri eklemeden önce 2 gün boyunca bankta plakaları bırakın ama plakaları er ihtiyaç vardır 1 gün çalışacaktır.
7. Günü plakaları E. taze bir çizgi tek bir koloni ile kurutma, tohum sıvı LB kültür bitirmeden önce LB agar coli OP50 bakteri. 60 mm plaka başına bir gecede OP50 kültürünün en az 1 ml hazırlamalıdır.
8. 37 Yeri OP50 kültür ° C çalkalayıcı ve bakteriler (kültür doygunluk ulaşmak olmalıdır) gece boyu büyümeye izin verir.
9. Pelet OP50 10 dakika boyunca 3.500 g iplik bakteri.
10. Süpernatant ve tekrar süspansiyon bakteri kültürü 10x konsantre% 90 çıkarın.
11. Pipet 100 mcL 10x konsantre OP50 kültür merkezi haline katılaşmış NGM plakalar. (Ideal bakteriler plaka duvarları yakınında gelmeden NGM merkezi alanı kapsamalıdır) gerekirse Swirl plakaları yavaşça bakteri kültürü yaymak için. Medya yüzey kusurları NGM içine yuva solucanlar izin verdiği ölçüde, NGM yüzeye pipet dokunmaktan kaçınmak için deneyin.
12. Bakteri kültürü katı NGM (genellikle 24 saat sürer) üzerinde kurumasına izin gecede bankta plakaları bırakın.
13. Kuruduktan sonra, plakaların yüzey bakterilerin büyüme durması için yeterli bir UV dozu maruz. Bir Stratagene UV Stratalinker 2400 kullanıyorsanız:
    • Yeri Stratalinker plakaları ve kapakları kaldırmak
    • Kapıyı kapatın ve Stratalinker açmak
    • Basın 'Enerji'
    • '9999 'Tuş takımını kullanarak girin
    • Press 'Başlat'
    • Plakalar yaklaşık 5 dakika süreyle UV ışınlarına maruz kalacağı
14. UV-öldürülmüş bakteri ile Tabaklar, 4 ° C 1 aya kadar baş aşağı saklanabilir.

Bölüm 2: zamanlanmış bir yumurta hayvanların yaş senkronize bir nüfus elde etmek için döşeme gerçekleştirin.

Bu bölümde ortak bir ambar güncel solucanları bir nüfusa üretir. Bu üreme aktif yetişkin için zaman belirli bir süre için bir plaka üzerine yumurtalarını bırakmak için izin ve bu yumurtaları geliştirmek için izin gerçekleştirilir.

1. (Isteğe bağlı), yaklaşık 20 genç erişkin solucanlar FUDR olmadan yeni bir NGM plaka aktarın. 25 ° C, solucanlar, tüm bakteri gıda yoluyla yaymak ve yemek sağlamak amacıyla plakaları bırakın. Yeni yumurtadan çıkan solucanlar bakteriyel gıda tüketilen edildikten sonra tutuklanan büyüme Dauer sahne girecek. Başlangıçta plaka transfer kaç solucanlar bağlı olarak, bir hafta içinde yaklaşık Dauer larva görmeye başlayacaksınız. Dauer larva 1 ay kadar bir sonraki adımlar için kullanılabilir.
2. FUDR olmadan taze NGM plaka (İsteğe bağlı) Transfer 20 30 Dauer larva. , 2 gün içinde üreme aktif yetişkin gıda Dauer larva varlığı haline gelecektir ve bundan sonra 25 üreme birkaç gün boyunca aktif kalır ° C
3. 10 ila 15 üreme aktif yetişkin FUDR olmadan yeni bir NGM plaka aktarın. Bu plaka Zamanlı yumurtlama (TEL) plaka olarak adlandırılır.
4. 25 ° C 6 saat için izin vermek için TEL plaka bırakınsolucanlar zaman yumurtalarını bırakmak için.
5. TEL plaka erişkin solucanlar çıkarın. Plaka yetişkin çıkarmadan önce yumurta için görsel olarak kontrol edilebilir. TEL plaka, solucanlar, yeterli sayıda yumurta koydu varsa erişkin solucanlar çıkarmadan önce 24 saat olmak üzere toplam 25 ° C kadar sol olabilir.
6. Place TEL plaka 20 ° C yumurtadan yumurta var ve solucanlar L4 larva dönemi (bu genellikle vahşi tip C. elegans için 2 gün sürer, ama yavaş gelişimi fenotipleri suşları için uzun sürebilir) için geliştirdiği kadar.

Bölüm 3: Puan hayvanların ömrü

Ölünceye kadar bu bölümde Bölüm 2 solucanlar yaş senkronize nüfus izleyin. Worms, yumurta üretimi ve bakteriyel kontaminasyonu önlemek için Amp / FUDR tabak tutulur ve dış uyaranlara yanıt vermeyen ölü olarak kabul edilir.

1. Numaralı seribaşı Amp / FUDR plakaları L4 larva transferi. Her bir gerginlik ya da koşulu test için, plaka başına 25-30 solucanlar ile 2-3 tabak kurmak için tipik bir örneğidir. C. Görüntüler elegans yaşam evrelerinde referans verilmektedir (Şekil 1) ¹
2. Place Amp / FUDR plakaları 20 ° C 24 saat boyunca.
3. 24 saat sonra, görsel, solucanlar, medya, ve bakteri değerlendirmek. Aşağıdakilerden herhangi birini görülmektedir taze Amp / FUDR plakaları solucanlar transferi:
   • Worms bakteriyel gıda yemiş. Erken, ömrü deney solucanlar tükenmiş olan bakterileri önlemek için bir hafta 1 ila 2 kez transfer edilebilir olacaktır.
   • Larvaların önemli bir kısmı mevcuttur. Bu genellikle solucanlar L4s yerine genç yetişkinler olarak Amp / FUDR plakaları ve FUDR yürürlüğe girmiştir önce bazı yumurtalarını bırakmak için mümkün olduğu bir göstergesidir. FUDR genellikle tam yetişkin içine büyüyen larva önlemek, ancak bazen bir kaç yetişkin içine büyümek ve deney hayvanları ile karıştırılmamalıdır olacak.
   • Canlı / büyüyen bakteriler gözlenir. Genel olarak, Amp ve UV-öldürme arada hiçbir canlı bakteri deney kontamine sağlayacaktır, ancak zaman zaman ortaya çıkar.
   • Mantar büyüme medya görülmektedir. Yeterince erken yakalanmış ise, mantar üremesine genellikle bir pipet veya spatula kullanarak kesip olabilir. Bir kere, birkaç milimetre çapında yeni bir plaka solucanlar aktarmak için genellikle daha kolaydır daha büyük olması yetişir.
   • Diseksiyon kapsamı kullanarak, her solucan, canlı ya da ölü olup olmadığını belirlemek.
   • Plaka hafifçe dokunun. Solucan dinlenmesine tepki olarak hareket ederse canlıdır.
   • Solucan başkanı bölgeye dokunarak levha, zoom için yanıt vermezse.
   • Platin transfer mızrapla solucan kafasını hafifçe dokunun. Puan başını hareket ettirerek yanıt vermemesi durumunda ölü olarak solucan.
   • Ölü solucanlar plaka çıkarılabilir.
4. Canlı ve ölü bir tarih ve solucanlar sayısını kaydedin.
5. 20 ° C'ye kadar plakaları dön
6. Tüm solucanların ölmüş kadar tekrarlayın 3.3 3.6 sayesinde her 2 ila 3 gün adımları.

Bölüm 4: Temsilcilik Sonuçları.

Bir nematod ömrü deneyi tarafından üretilen ham veri, numaralarını içeren test her bir suş için canlı ve ölü solucanları tarihleri ​​bir liste. Her gün ölen sayısı solucanlar genellikle, bir hayatta kalma eğrisi (Şekil 2B olarak grafiksel olarak çizilen her gün canlı solucanlar oranı (Şekil 2A), hesaplamak için ters; Zamanlı yumurtlama günü 0. gün olarak kabul edilir .) Çalışmada her bir solucan için ömrü, her gün ölen solucanlar sayısı hesaplanır ve suşları arasında karşılaştırma için ortalama ve medyan yaşam süresi hesaplamak için kullanılabilir. Her gün canlı solucanlar sayısı sayımı ömrü analizi doğrudan kullanılmaz. Worms katı ortam üzerinde muhafaza bazen 'kaçmak', ya da medya altındaki plaka veya aşağı duvar ya tarama. Her gün canlı solucanlar deney kurs boyunca pek çok solucan, nasıl kaçtı sayısını belirlemek için kullanılabilir. Kaçmak Solucanlar genellikle analiz kaldırılır. N2, C. için bir kriter olarak, tipik bir medyan yaşam süresi 20 UV-öldürülmüş bakteri muhafaza elegans yabani tip gerilim ° C yumurtadan ölçülen yaklaşık 25 gündür.

Bölüm 5: Çözümler

Nematodu Büyüme Medya (NGM), 100 ml:
Birleştirin:
0,3 g	NaCl
0.25 g	Pepton
2 g	Agar
40 dakika otoklav ve soğuması ile 55 ° C, sonra ekliyorum:
100 mcL	1 M MgSO 4
100 mcL	5 mg / ml Kolesterol
100 mcL	1 M CaCl2
1.625 ml	1.5 M KPI pH 6.0
Sıvı NGM oda sıcaklığında plakaları dökmek için hemen kullanılabilir veya sağlamlaştırmak için izin ve uzun vadeli saklanır.

Luria Broth (LB), 1L:
10 g	BactoTryptone
5 g	Maya Ekstraktı
10 g	NaCl
10 ml	1 M Tris pH: 8.0
1 L	deiyonize su
Otoklav ve oda sıcaklığında saklayın.

1 M MgSO 4, 300 mL:
73,95 g	MgSO 4
300 mL	deiyonize su
Otoklav ve oda sıcaklığında saklayın.

5 mg / ml Kolesterol, 200 mL:
1 g	kolesterol
200 mL	% 100 etanol
Sterilize Filtre ve oda sıcaklığında muhafaza.

1 M CaCl 2, 500 ml:
27,75 g	CaCl 2
500 mL	deiyonize su
Sterilize Filtre ve oda sıcaklığında muhafaza.

1.5 M KPI pH 6.0, 1L:
Birleştirin:
31.4 g	KPI dibazik
179,6 g	KPI tekbazlı
850 mL	deiyonize su
Isı KPI çözüm çözünmesi için karıştırma sırasında. 10 N NaOH ile pH 6,0 'a ayarlayın.
1 L. deiyonize su ekleyin
Otoklav ve oda sıcaklığında saklayın.

1 M Tris, pH 8.0:
60,57 g	Tris
400 mL	deiyonize su
HCl ile pH 8.0 ayarlayın.
500 mL deiyonize su ekleyin.
Sterilize Filtre ve oda sıcaklığında muhafaza.

150 mM Fluorodeoxyuridine (FUDR), 10 ml:
0,3693 g	FUDR
10 ml	steril deiyonize su
-20 ° C'de muhafaza

100 mg / ml ampisilin (Amp), 10 ml:
1 g	Ampisilin
10 ml	steril deiyonize su
-20 ° C'de muhafaza

50 mg / ml Carbenicillin (Carb), 10 ml:
500 mg	Carbenicillin
10 ml	steril deiyonize su
-20 ° C'de muhafaza

1 M İzopropil β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG), 10 ml:
2.38 g	IPTG
10 ml	steril deiyonize su
-20 ° C'de muhafaza

Şekil 1. C. Aydınlık alan görüntüler yumurta da dahil olmak üzere elegans yaşam evreleri, dört larva aşamaları (L1-L4) ve yetişkin. Tüm paneller, yetişkin bir erkek (Wood (1988) Image), sağ alt hariç hermafroditlerde göstermektedir.

C. Şekil 2 Temsilcisi sonuçları elegans ömrü deneyi daf-2 genindeki bir mutasyon içeren bir yük vahşi tip suşu N2 karşılaştırarak. (A) toplanan solucanların yumurtaları beri gün sayısı da dahil olmak üzere veriler, her gün görülen ölü solucanlar sayısını, ve her gün hayatta kalan orijinal numunenin yüzdesi (ölü solucanlar günlük sayıları hesaplanan) gösteren bir tablo . (B) Survival ve (A) ömrü verilere karşılık gelen eğriler.

Şekil 3 genç ve yaşlı yetişkin C arasında lipofusin Temsilcisi karşılaştırma elegans. Aydınlık alan görüntülerin sağ ve sol DAPI kanal floresan görüntüler gösterilir. En paneller 4 gün eski bir solucan ve alt paneller (yumurta ölçülen gibi) 11 gün eski solucan göstermektedir.

Tartışma

Uzun ömürlü genetik kontrol C. yaygın olarak incelenmiştir elegans, büyük ölçüde ömrü tespit edilebilir olan kolaylığı ve hızı nedeniyle. Bu makalede açıklanan protokol C. tekrarlanabilir ömrü veri elde etmek için temel bir çerçeve tanımlar elegans ve relatednematode türler için de uygulanabilir. ^2, bu işlemler çok çeşitli şartlar altında ömrü ölçmek için adapte edilebilir basit bazı değişiklikler yaparak . Burada RNA enterferans (RNAi), bakteriyel yoksunluk diyet kısıtlama...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Agar	Reaktif	Fisher Scientific	DF0145-17-0 (214530)
Ampisilin	Reaktif	MidSci	0339
BactoTripton	Reaktif	Fisher Scientific	DF0123-17-3 (211705)
BactoPeptone	Reaktif	Fisher Scientific	DF0118-17-0 (211677)
CaCl2	Reaktif	Fisher Scientific	NC9699248 (1332-01)
Karbenisilin	Reaktif	Altın Biyoteknolojisi	C0109
Kolesterol	Reaktif	Sigma-Aldrich	C75209
Fluorodeoksiyuridin (FUDR)	Reaktif	Sigma-Aldrich	F0503
İzopropil β-d-Tiogalaktopyranosid (IPTG)	Reaktif	Altın Biyoteknolojisi	I2481C5
KPi Dibasic	Reaktif	Fisher Scientific	5087862 (3252-01)
KPi Monobasic	Reaktif	Fisher Scientific	5087861 (3246-01)
MgSO4	Reaktif	Fisher Scientific	NC9561800 (2500-01)
NaCl	Reaktif	Fisher Scientific	S251
Tris	Reaktif	Sigma-Aldrich	T1503
Maya Ekstraktı	Reaktif	Fisher Scientific	DF0886-17-0 (288620)