İşleme Loblolly Çam PtGen2 cDNA Mikroarray

Summary

CDNA mikroarray PtGen2 Loblolly çam gen ekspresyon çalışmaları için geliştirilmiştir S. taeda Ve diğer kozalaklı türler. Burada, öncesi ve sonrası hibridizasyon teknikleri, daha iyi bir tutarlılık, eserler, ve alt arka planlar verim için bu dizi ile birlikte kullanılabilir taşıma ve yıkama.

Abstract

PtGen2 amplifiye Loblolly çam EST'ler içeren 26.496 özelliği cDNA mikroarray. Dizi, çam ve diğer kozalaklı türlerin gen ekspresyonu eğitim araştırmacılar tarafından kullanılmak üzere laboratuvarda üretilir. PtGen2 Loblolly çam gen bulma çabalarının bir sonucu olarak geliştirilen ve öncelikle kök dokuları tespit dizileri oluşur, ama aynı zamanda iğne ve kök ^1,2 PtGen2 farklı etiketli Cy-boya kozalaklı hedef cDNAs literatürde tarafından test edilmiştir amplifiye ve amplifikatör içermeyen dolaylı etiketleme yöntemleri ve hibridizasyon ve yıkama koşulları bir dizi test. Bu video bazı değişiklikler önceden geliştirilmiş yöntemler kullanılarak, hem de melezleme sonra, ön hibridizasyon öncesi ve sonrası slayt taşıma ve işleme üzerine odaklanmaktadır. ^3,4 Ayrıca dahil olanlar, sadece metin biçiminde, üretim için kullanılan protokoller, etiketleme ve hedef cDNA s kadar temiz yanı sıra yazılım hakkında bilgi downstream veri işleme için kullanılır.

PtGen2 tamamen kaldırmak için zor olabilir yüksek konsantrasyonlarda tuz içeren özel bir baskı tamponu ile yazdırılır. Slaytlar ön hibridizasyon için önce sıcak bir SDS çözümü ilk olarak yıkanır. Ön hibridizasyon sonra, slaytlar kalan tuzları kaldırma işleminin tamamlanması için çeşitli değişikliklere su kuvvetlice yıkanır. LifterSlips ™ sonra temizlenmiş ve slaytlar üzerinde konumlandırılmış ve cDNA etiketli dikkatle slaytta örnek eşit dağılımını sağlayan kılcal eylem yoluyla mikroarray üzerine yüklenen ve kabarcık esas şansını azaltır. Dizi hedefleri Hibridizasyon 48 ° C'de yüksek nem koşullarında yapılır. Hibridizasyon sonra, bir dizi standart yıkar 53 yapılır ° C ve oda sıcaklığında uzun zamanlar için. İşleme PtGen2 slaytlar bu tekniği kullanarak tuz azaltır ve SDS-elde edilen eserler genellikle dizi daha titiz bir şekilde işlenir. Birkaç farklı kozalaklı RNA kaynaklardan elde edilen hedeflere literatürde, bu işlem protokolü, daha az eser, azaltılmış arka plan verdi ve dizilerin farklı deneysel gruplar arasında daha tutarlı.

Protocol

(Not 1 - 4 Bölüm Video kanıtlanmış değil)

Cy-Etiketli Hedef cDNA hazırlanması

Aşağıda biz döllemeler mikroarray önce Loblolly çam toplam RNA ve dolaylı cDNA etiketleme cDNA sentezi için kullanılan bir protokoldür. Olmayan birkaç önemsiz değişiklikler yapılmış olmasına rağmen, aşağıdaki protokol Invitrogen Üst Simge Dolaylı cDNA Etiketleme Kit ile birlikte verilen kullanım kılavuzuna benzer.

Bölüm 1: İlk Strand cDNA Sentezi Reaksiyonu

1. Mix ve kullanmadan önce kısaca her kiti bileşeni spin.
2. Reaksiyonlar aşağıdaki gibi hazırlayın:
   • Xμl DEPC-H ₂ O <....

Discussion

PtGen2 öncelikle Loblolly çam araştırma topluluğu tarafından kullanılmak üzere tasarlanmış kısa bir süre önce geliştirilen, özel cDNA mikroarray. Üretilen ön sonuçları, bu nedenle çok değerli bir araç transkripsiyonel kuraklık stresine yanıt olarak ortaya çıkan olayların yanı sıra, deniz, çam, Pinus ^pinaster Şu anda 5,6 embriyo gelişimi sırasında meydana gelen değişiklikleri izleme gibi değerlendirilmesi için dizi göstermiştir yakın zamanda ⁵ PtGen2 olarak, Pinus ve diğer kozalakl.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ön hibridizasyon Tampon	Tamponu			5X SSC, %0.1 SDS, %1 BSA
Hibridizasyon Tamponu	Tamponu			%30 formamid, 5X SSC, 5X Denhardt' s,% 1 PoliA RNA (İnvitrojen, POLYA. GF), %0,1 SDS
Yıkama Çözeltisi #1	Tampon			1X SSC, %0,2 SDS, 43°'ye önceden ısıtın; C
Yıkama Çözeltisi #2	Tampon			0.1X SSC, %0.2 SDS
Yıkama Çözeltisi #3	Tampon			0.1X SSC
İzopropil Alkol	Reaktifi	Sigma-Aldrich	34959-2.5L
50mL Konik Tüpler	Diğer	Falcon BD	352070
15mL Konik Tüpler	Diğer	Falcon BD	352196	Santrifüjleme sırasında her 50 mL konik tüpün altına yerleştirilmiş bu veya benzer bir kapağı kullanın
Coplin Jar		Wheaton	900520
Boyama Kabı & Raf	Diğer	Wheaton	900200
Sığır serumundan elde edilen albümin (BSA)	Diğer	Sigma-Aldrich	A-9418
PolyA RNA		Invitrogen	POLYA.
SuperScriptTM Dolaylı cDNA Etiketleme	Kiti	Invitrogen	L1014-02
Turbo DNase Kiti		Ambion	AM1907
Sistemi
Cy-5 Boya	Reaktifi	GE Sağlık PA25001
Cy-3 Boya	Reaktifi	GE Sağlık PA23001
Kaldırıcı Fişleri™	Diğer	Erie Scientific	25X601
HybChambers	Ekipmanları	GeneMachines	JHYB200003