S. cerevisiae "adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

Özet

GFP-füzyon proteinleri yaygın konfokal mikroskobi organelleri görselleştirmek için kullanılır. Ancak, genellikle bireysel mutagenez organellerin morfolojisini etkileyen mutasyonlar için tarama gerektirir ve zaman alıcıdır. Burada, neredeyse 5.000 maya gerekli olmayan genlerin aynı anda organel-GFP işaretleri dahil etmek için bir yöntem göstermektedir.

Özet

Protein lokalizasyon veya organel morfolojisi incelemek için yüksek verimlilik yöntemleri protein etkileşimleri çalışmak için etkili bir araçtır ve moleküler yollarının kapsamlı bir anlayış elde etmenize yardımcı olabilir. Saccharomyces cerevisiae, zorunlu olmayan gen silme dizi gelişme, global olarak endoplazmik retikulum (ER) ve mitokondri kullanarak GFP (veya türevi) belirteçlerinin farklı gen geçmişleri gibi farklı organellerin morfoloji eğitim görebilirsiniz. Ancak, tek tek her mutant içeren GFP işaretleri, ayrı ayrı emek-yoğun bir süreçtir. Burada, bizim laboratuvarda rutin olarak kullanılan bir prosedür açıklanmaktadır. Yüksek yoğunluklu maya dizileri ve ilaç seçimi teknikleri işlemek için bir robot sistemi kullanarak, önemli ölçüde zaman gerekli kısaltmak ve tekrarlanabilirlik geliştirmek. Kısacası, biz robot çoğaltma iğneleyerek 4672 gerekli olmayan gen silme mutant bir yüksek yoğunluklu bir dizi GFP etiketli mitokondriyal bir işaretleyici (Apc1 GFP) kesişir. Diploid seçimi, sporlanma, çimlenme ve çift işaretleyici seçimi sayesinde, her iki allel kurtarabilirsiniz. Sonuç olarak, her haploid tek mutant Apc1-GFP genomik lokustaki dahil içerir. Şimdi, biz, gerekli olmayan tüm mutant arka planda mitokondri morfolojisi eğitim görebilirsiniz. Bu yüksek verimlilik yaklaşımı kullanarak, uygun bir çalışma ve genom bir ortamda miras ve organellerin oluşumu ilgili yollar ve genler tasvir.

Protokol

Gereç ve yöntem:

1. Maya suşları:
   • Acp1-GFP (GFP:: His): Acp1 C-terminali, GFP-etiketleme plazmid pKT128 (GFP ve HIS5 içerir) kullanarak PCR-aracılı homolog rekombinasyon tarafından oluşturulan oldu. Pozitif transformants konfokal mikroskopi ve koloni PCR tarafından teyit edildi. Boone laboratuarı (Tong ve Boone, 2006): suşu arka plan BY7043 (STE2pr lue2 lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 MAT alfa can1Δ).
   • Silme Mutant Array (DMA) (xxx:: KanR): gerekli olmayan genlerin yaklaşık 5.000 silme mutant bir dizidir. Tüm bu gerekli olmayan genlerin G418 elendikçe. Dizinin gerginlik arka plan BY4741 (Mata his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0). Bizim ....

Tartışma

Bu yöntem çeşitli mutant arka planla mitokondriyal marker, Acp1-GFP dahil verimli bir şekilde yardımcı olabilir. Robotik bir sistem kullanımına dayanır ve herhangi bir robot sistemi ile kullanmak için kolayca kabul edebilir. Bu işlem aynı zamanda belirteç diğer türleri birleştiren için kullanılabilir. Örneğin, ER görselleştirmek için, rutin marker Erg11-GFP kullanabilirsiniz. Temsili görüntü, bir mutant ve Acp1-GFP yapımcısı ile vahşi bir türü visualiz ed mitokondri morfolojisi çalışma konfokal mikroskobu ile. Mutant ke.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
SGA besiyerleri			Bu protokolde kullanılan büyüme besiyeri (YPD), LRK ve LHRK'yı içeren sentetik dropout besiyerleri (SD) ve zenginleştirilmiş sporülasyon besiyeri, maya moleküler biyolojisinde rutin olarak kullanılmaktadır. Detaylı açıklamalar için lütfen Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) kaynağına başvurun.