Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Özet

In situ hibridizasyon Tüm montaj, gelişim biyolojisi en yaygın olarak kullanılan teknikleri biridir. Burada, tek bir genin kesin ifadelerde desen analiz ve iki genin ifadesi etki çakışma belirlenmesi için çift floresan in situ hibridizasyon protokol yüksek çözünürlüklü sunuyoruz. Biz bir doku organizasyon vurgulamak için propidium iyodür nükleer karşı leke içerir.

Özet

Tüm montaj

Protokol

1. FİKSASYON

1. Fix 4 geceleme embriyolar ° C PBS içinde% 4 paraformaldehid (PFA).
2. Kaldır düzeltmek ve oda sıcaklığında (RT) 2 x PBS, her 5 dakika yıkayın.
3. Saatçi forseps kullanarak bir bardak depresyon plaka PBS Manuel dechorionate embriyolar. Polipropilen pipetler yapışabilir dechorionation sonra, embriyolar bir yangın parlatılmış cam Pasteur pipeti kullanılarak aktarılır.
4. Her 5 dakika için bir dizi% 25,% 50 ve PBS içinde% 75 metanol ile embriyo transferine.
5. % 100 metanol ile sıvı değiştirin, inkübasyon ve 5 dakika sonra taze metanol ile değiştirin.
6. En az bir saat için -20 ° C'de Yeri embriyolar. (Biz ge....

Tartışma

Burada sunulan protokol tipik bir alkalin fosfataz aracılı reaksiyon 30-45 dakika boyandıktan sonra temiz ve güçlü bir sinyal vermek problar ile iyi çalışır. Floresan in situ hibridizasyon protokolü performans öncesinde, her zaman bizim probları standart floresan olmayan protokolü (prob sentezi protokolü ile birlikte tamamlayıcı malzeme) kullanarak test edin. Zayıf problar kullanarak, floresan in situ hibridizasyon protokol az başarı oldu, ama bazı durumlarda mümkün olabilir. Β-katenin ³ immunolocalization in.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Paraformaldehit %16 çözeltisi, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710	1,33x PBS ile %4'e seyrelteyin (final 1x). 2ml'lik alikotlar halinde –20°C'de saklayın
Proteinaz K, rekombinant PCR grade	Roche Group	03115879001	Su içerisinde 20mg/ml stok çözelti hazırlayın. 1ml'lik alikotlar halinde –20°C'de saklayın
Bloklama Reaktanı	Roche Group	11096176001	1x maleik asit tamponu içerisinde %10'luk stok çözelti hazırlayın. 50ml'lik alikotlar halinde –20°C'de saklayın. Birden fazla dondurma/çözme döngüsünde stabildir.
Anti-Fluerescein-POD, Fab fragmentleri	Roche Group	11426346910	Alikotlayın ve -20°C'de saklayın. Bir çalışma alikotunu 4°C'de tutun.
Anti-Digoksinen-POD, Fab fragmentleri	Roche Group	11207739910	Yukarıdakilerle aynı.
TSA Plus Fluerescein sistemi	PerkinElmer, Inc.	NEL741001KT	TSA reaktanının her bir flakonunu yalnızca ihtiyaç duyulduğunda hazırlayın. 60μl DMSO içinde çözün. 4°C'de saklayın.
TSA Plus Cyanine5 sistemi	PerkinElmer, Inc.	NEL745001KT	Yukarıdakilerle aynı
TSA Plus Cyanine3 sistemi	PerkinElmer, Inc.	NEL744001KT	Yukarıdakilerle aynı
TSA Kiti #16 AlexaFluor647 tyramide (artı HRP-keçi-anti-tavşan IgG)	Molecular Probes, Life Technologies	T20926	Tyramide reaktanını 150μl DMSO içinde çözün, alikotlayın ve –20°C'de saklayın.
RNaz, DNaz içermez	Roche Group	11119915001	500μg/ml çözelti olarak tedarik edilir
Propidyum İyodür	Molecular Probes, Life Technologies	P-3566	Su içerisinde 1mg/ml çözelti olarak tedarik edilir.