Yöntem makalesi

Bir In Vitro Cilt tahriş Testi (SIT) İnsan Epidermal (RHE) Model yeniden inşa

70.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/1366

⸱

13 Temmuz 2009

 ,  ,  ,  , 
1MatTek Corporation

Bu makalede

Özet

Bu video, Epiderm Deri irritasyon testi (Epiderm SIT) için geçerli göstermek In vitro, kozmetik ve ilaç maddeler de dahil olmak üzere cilt tahrişi testleri,.

Özet

Epiderm Deri irritasyon testi (Epiderm SIT) geliştirildi

Protokol

I. Doku Klima - Gün 0

  1. Epiderm EPI-200-SİT kiti aldıktan sonra, bütünlüğü için tüm kit bileşenleri (kit ayrıntılı bilgi için özel reaktifler ve ekipman Tablo bakınız) kontrol edin.
  2. Her üç Epiderm dokular için, bir tahlil orta 0.9 ml steril 6 plaka önceden doldurulmuş hazırlar.
  3. Epiderm dokular içeren 24 plaka içeren plastik torba steril koşullar altında, açık ve steril bir gazlı bez çıkarın.
  4. Epiderm doku içeren her eklemek kaldırmak ve 24 boş plaka ekleme yerleştirmek için steril forseps kullanın. Bu adım sırasında, steril filtre kağıdı blot nazik eklemek dış kenarlarına yapışır kalan nakliye agaroz çıkarın.
  5. Sonraki 5 dakika içinde, dokular görsel olarak kontrol edin. Tamamen sıvı ile kaplıdır kusurlu doku ya da doku kullanmayın.
  6. Steril pamuk uçlu çubuk yardımıyla, dokuların yüzey dikkatlice kurutun. Doğrudan doku dokunmamaya çalışın - kılcal etkileri doku yüzeyinin nemi çıkarmak için yeterli.
  7. Doku yüzeyinin kurutulduktan sonra, 6-kuyucuğu 0.9 mL tahlil orta önceden doldurulmuş üst satırındaki üç doku transferi. Ekler altında sıkışmış olan herhangi bir hava kabarcıkları serbest bırakın.
  8. 60 kuvöz içine ekler içeren 6-kuyucuğu yerleştirin ± 5 dakika ön-inkübasyon 37 ° ± 1 ° C, 5 ±% 1 CO 2,% 95 RH (Bağıl Nem).
  9. 60 ± 5 dk ön kuluçka dönemi sonunda, 6-plaka alt kuyulara üst kuyulardan ekler aktarın. Inkübatör geri tabak koyun (37 ± 1 ° C, 5 ±% 1 CO 2,% 95 RH) bir gece için ön-inkübasyon (18 ± 3 saat).
  10. Buzdolabında (5 ± 3 ° C). Tahlil orta geri kalanını yerleştirin. Gecelik ön inkübasyon sonrasında, test kimyasalları Epiderm dokulara uygulanabilir.

    Not: ön inkübasyon prosedürü (dokular Salı Çarşamba günü yerine gelirse gibi) geç doku teslim durumunda kısaltılabilir.

II. Kimyasal maruz kalma - 1. Gün

  1. Sadece 0.9 ml başına iyi tahlil orta üst sıra dolum testi kimyasal başına bir adet 6-plaka hazırlayın.
  2. Yaklaşık 5 dakika planlanan kimyasallara maruz kalmadan önce, inkübatör öncesi klimalı dokular içeren 6 kuyucuğu çıkarın.
  3. Dokuların yüzey değerlendirin ve steril pamuk ipuçlarını kullanarak herhangi bir nem kaldırmak.
  4. Tüm 6 plaka kapakları test malzeme kodları veya isimleri ile etiketleyin.
  5. Doz 1 dakikalık aralıklarla test kimyasallar ile dokuların maruz kaldıktan sonra test kimyasalları durulama kolaylaştırmak için. Son doku dozlanarak kadar, steril kaput dozajlanarak dokuların plakaları tutun.
  6. Sıvı kimyasallar test etmek için doku tepesinde, doğrudan çözüm 30 mcL dağıtmak ve naylon mesh dokuların yüzey üzerine yerleştirin. Gerekirse, cam Pasteur pipeti başkanlığındaki ampul kullanarak mesh yavaşça yerleştirin. Doku yüzey üzerine basmayın.
  7. Test yarı katı için, doğrudan doku tepesinde 30 mcL dağıtmak için olumlu bir deplasman pipet kullanın. Pasteur pipeti ile gerekli yayılmasını kimyasal doku yüzeyinin mümkün olduğunca karşılamak için ise
  8. Katı maddeler için, test maddesi, uygulama kısa bir süre önce, doku yüzeyinin steril DPBS 25 mcL ile nemlendirin. Bu test kimyasal doku yüzeyine temas artıracaktır. Ince öğütülmüş test materyali yaklaşık 25 mg ile 25 mg kalibre keskin uygulama kaşığı (veya başka uygun bir araç) doldurun. Katı test doku yüzeyine kimyasal uygulayın. Gerekirse kaşık, tamamen boşaltmak için Pasteur Pipet başkanlığında bir ampul kullanın. Katı yüzey üzerinde yayılmasını geliştirmek için ekler yavaşça sallayın.
  9. Mum kıvamında test maddeler için, 8 mm çapında parçası düz "gibi çerez form ve doku, daha önce steril DPBS ile ıslatılmış tepesinde yer deneyin. Test maddesi ve doku arasındaki iletişim artırmak için "çerez", paslanmaz çelik veya plastik yardımı ile tartın.
  10. Negatif kontrol ve kontrol dokulara pozitif kontrol olarak% 5 SDS olarak DPBS uygulayın.
  11. Son doku dozaj sonra 35 için tüm plakaları ± 1 dakika transfer, nemlendirilmiş inkübatör (37 ± 1 ° C, 5 ±% 1 CO 2,% 95 RH).
  12. 35 sonra 37 ° ± 1 dakika inkübasyon ° C inkübatör tüm plakaları çıkarın. Plakalar steril kaput içine koyun ve 60 dakika kimyasal maddelere maruz kalma süresi, ilk dozajlanarak doku tamamlanana kadar bekleyin.
  13. Daha sonra (sigorta şirketlerini olumsuz bir dakikalık zaman aralığı başına eklemek kullanarak yıkama prosedürü başlatmake her ekleme için toplam maruz kalma süresi) 60 dakika olduğunu.
  14. Dokuların steril DPBS ile durulama için bir yıkama şişesi kullanın. Daha sonra, geri kalan ile devam 15 kez eklemek doku DPBS sürekli kullanarak doldurun ve (Not boş naylon örgü dokular için, doku yüzeyinin 5 kez yıkayın ve örgü, keskin sivri forseps ile dikkatli bir şekilde kaldırmak 10 yıkama).
  15. 15. 150 ml DPBS tamamen daldırın, insert 3 kez yıkama şişesi kullanarak yıkayın ve test malzemesi kalan kaldırmak için sallamak sonra.
  16. Son olarak, içeriden bir doku eklemek yıkayın ve bir kez steril DPBS ile dışarıdan.
  17. Ekleme hafifçe sallayarak ve steril kurutma kağıdı blot doku DPBS herhangi bir aşırı çıkarın.
  18. Daha önce tahlil orta önceden dolu yeni 6-plaka, lekelenen doku ekler aktarın. (14-18) Tüm bu adımları her ekleme için 1 dakika içinde yapılmalıdır.
  19. Son doku durulanır sonra, steril bir pamuk ile her doku yüzeyine dikkatlice kurulayın çubukla uçlu.
  20. Inkübatör dokuların sonraki 24 ± 2 saat inkübe (37 ± 1 ° C, 5 ±% 1 CO 2,% 95 RH).

    Not: Her tahlil teknisyen aşağıda açıklandığı gibi, protokolü takip edebilmek için, tek bir test run (set) negatif ve pozitif kontroller de dahil olmak üzere fazla 6 testi maddelerin test olmamalıdır

III. Orta tokuş - 2. Gün

  1. 24 saat sonra ± 2 saat sonrası inkübasyon, 6-plaka, 0.9 ml medya ile önceden doldurulmuş alt kısmında ekler transfer. Üst sıralarda yer alan medya, ek uç noktaları (sitokinler, kemokinler vb.) Analizi için toplanan olabilir. İkincil sonlanım noktaları Analizi isteğe bağlıdır.
  2. Post-inkübasyon ile devam edin (37 ± 1 ° C, 5 ±% 1 CO 2,% 95 RH) başka bir 18 ± 3 saat.

IV. MTT Canlılık Testi - 3. Gün

  1. Etiket iki kimyasal adları veya kodları ile 24 kuyucuğu. Bir plaka MTT ile doku inkübasyon hizmet ve çıkarma adım için.
  2. MTT konsantre çözülme (5 mg / ml) ve MTT seyreltici ile seyreltilmesi MTT çözüm hazırlayın. MTT çözümün nihai konsantrasyonu 1 mg / ml.
  3. Pipet 300 mcL 24 plaka her kuyuya MTT çözüm.
  4. Inkübatör 6 kuyucuğu çıkarın blot kağıt üzerine ekler alt blot ve MTT ile önceden doldurulmuş 24 plaka içine aktarabilirsiniz.
  5. Inkübatörde 24 plaka koyun (37 ± 1 ° C, 5 ±% 1 CO 2,% 95 RH) ve 3 saat inkübe ± 5 dk. Strictly 3 saat uymak ± 5 dakika inkübasyon süresi farklı MTT okumaları arasındaki sapma önlemek için.
  6. MTT inkübasyon tamamlandığında, yavaşça tüm kuyulardan MTT orta aspire bir emme pompası kullanın.
  7. Yedek DPBS kuyulardan ve tekrar aspire. Bu durulama iki kez daha tekrarlayın ve dokuların son aspirasyon sonra kuru olduğundan emin olun.
  8. Yıkar, yeni bir 24-plaka ekler transferinden sonra. Her ekleme yavaşça içine 2 ml ekstrenin solüsyonu (Isopropanol) pipetleme ekler bırakın. Düzeyi, böylece tamamen dokuların daldırarak ucun üst kenarları üzerinde artacak.
  9. Ekstrenin buharlaşma etkisizleştirmek için 24-iyi plaka Seal (örneğin Parafilm veya sızdırmazlık çanta kullanarak). Bir tabak çalkalayıcı (~ 120 rpm) hafif sallayarak ile oda sıcaklığında en az 2 saat boyunca dokular MTT ayıklayın. Gecelik çıkarma sallayarak olmadan da kullanılabilir.
  10. Ekstraksiyon süresi tamamlandıktan sonra, delmek bir enjeksiyon iğnesi veya ampul Pasteur pipeti boncuklu ve özü eklemek alındığı kuyuya çalışmasına izin ekler.
  11. Delinirse eklemek atın ve homojen kadar iyi ve aşağı üç kez çözüm pipetle.
  12. Her doku için, 96 sıra düz bir alt mikrotiter plate mor formazan çözümün iki 200 mcL alikotları transfer. Bu video protokolü ile birlikte Çizelgede verilen sabit plaka tasarımı göre çoğaltır aktarın. Boşlukları, izopropanol kullanın.
  13. Bir referans filtre olmadan bir dalga boyu 570 nm (540-580) kullanarak 96-plaka spektrofotometre MTT özler optik yoğunluk (OD) okuyun.
  14. Otomatik hesaplama sonuçları (Şekil 1) Çizelgede sonuçları girin.
  15. MTT testi ile belirlenen yüzde doku canlılığı negatif kontrol göre <% 50 ise bir test kimyasal tahriş edici (R38 veya GHS kategori 2) olarak etiketlenir.

    Not: MTT toksik, böylece kullanırken koruyucu eldiven giymek emin olun. MTT ve onun kadar koruyunEtkin çözüm ışıktan, MTT beri ışığa karşı hassastır. Hazırlandıktan sonra bir kaç saat içinde zamanla düşürür çünkü MTT çözüm kullanın.

V. Testi Kalite Denetimleri

  • Epiderm EPI-200-SİT kit Kabul Kriterleri:

    In vitro RHE modelleri (8) doğrulama işlemi sırasında değil, zaman içinde tutarlı, yüksek kaliteli veri sağlamalıdır. Uzun vadeli tahlil tekrarlanabilirlik ve performans sağlamak için önerilen kurallar "performans için her bir lot örnekleme doku veya hücrelerin tam karakterizasyonu, ..., ve test performansı tutarlılığı güvence sağlamak için düzenli kontrolleri ve benchmark kimyasalların kullanımı" (9) . Buna ek olarak, aşağıda ana hatlarıyla tahlil kabul kriterleri, Epiderm her üretim yeri (% 1 Triton X-100) ek bir kriter kimyasal karşı üretici tarafından test kalite kontrol. Maruz kalma süresi% 50 (ET-50) Triton X-100 belirlenir doku canlılığı azaltmak için gerekli. Epiderm için, yıllık ortalama ET-50 değerleri 5.9 saat ile 7.5 saat arasında değişmektedir. Çok negatif kontrol dokuları için çok CV (bazal canlılığı değişkenliği), 1996 yılından beri, her yıl için% 7.5 altında ortalama vardır. Amacıyla, her üretim yeri ET50 1996 (; Alt kabul sınırı = 4.8h üst kabul limit = 8.7h yani ET-50 = 6.7 saat) yılında kurulan tarihsel ortalamanın Triton X-100 ET50 2 standart sapma değeri içinde olmalıdır üretici tarafından kullanım için piyasaya sürülecek.

  • EPI-200-SİT Testi Kabul Kriter 1: Negatif Kontrol:

    MTT testi negatif kontrol (NC) dokular (steril DPBS ile tedavi) mutlak OD, nakliye ve depolama sonra prosedürleri ve belirli kullanım koşulları altında test laboratuarında elde edilen doku canlılığının bir göstergesi. NC dokuların ortalama OD 570 ≥ 1.0 ve ≤ 2.5 ise tahlil kabul kriteri karşılamaktadır.

  • EPI-200-SİT Testi Kabul Kriter 2: Pozitif Kontrol

    % 5 SDS (H 2 O) çözeltisi, pozitif kontrol (PC) olarak kullanılan ve test kimyasalları ile eş zamanlı olarak test edilmiştir . PC, her tahlil test edilebilir, ancak birden fazla PC gün test başına gerekli olduğunu Eşzamanlı anlamına gelir. Pozitif kontrol Canlılık tarihsel veriler% 95 güven aralığı içinde olmalıdır. Testin negatif kontrol dokuların% 20% olarak ortalama PC dokuların canlılığını ifade kabul kriteri karşılamaktadır.

  • EPI-200-SİT Testi Kabul Kriter 3: Standart sapma (SD)

    Tahrişi 3 tek dokular üzerinde belirlenen ortalama canlılığı tahmin ve bu nedenle doku değişkenlik kabul edilebilir düşük olmalıdır çoğaltır. Aynı tedavi edilen 3 ayrı% doku canlılığında hesaplanan SD <% 18 çoğaltır eğer tahlil kabul kriteri karşılamaktadır.

Temsilcisi Sonuçlar

figure-protocol-1
figure-protocol-2
figure-protocol-3
Şekil 1 - 6 test makaleler, NC ve PC kontrol edilen sonuçlar Bölüm sonuçlarının hesaplanması için otomatik bir elektronik tablo. NC başvurulan% 50 'nin altında doku canlılığı azalttı Testi kimyasalların tahriş edici olarak sınıflandırılır. Testi, yeteri kadar bu testin sağlamlık artan sınıflandırma cut-off (50% canlılığı) sonuçlar sağlayacak şekilde optimize edilmiştir.
Malzemeler
figure-protocol-4

Tartışma

Bu video, Epiderm Deri irritasyon testi (Epiderm SIT), kimyasal maddeler, kozmetik ve ilaç hammaddeleri de dahil olmak üzere in vitro cilt tahrişi testi için geliştirilen ve geçerliliği göstermiştir. Bu yöntem yaparken, protokolün sapma değişik sonuçlara neden olabilir, aseptik koşullarda çalışma ve kesin olarak doğrulanmış bir protokolü takip etmek önemlidir. Testinin bazı değişiklikler yapılabilir, ancak, protokol değişiklikleri yazarlar ile doğrudan tartışılan olmalıdır.

Bu yöntemin tek sınırlama MTT son nokta ile test maddenin olası bir girişim. MTT son nokta ile doğrudan MTT azaltır renkli bir test maddesi veya bir (ve böylece hücresel mitokondri dehidrogenaz aktivitesi taklit) engel olabilir. Ancak, bu test madde (ya da) dokularda bulunur MTT testi (yani test madde maruz kaldıktan sonra 42 saat) test maddesi, yeterli miktarda anda sadece bir sorun. Bu olası olay, (gerçek) metabolik MTT azaltılması ve katkı renkli bir test materyali veya (yanlış) tarafından sağlanan tahlil Standart Operasyon Prosedürü ayrıntılı olarak açıklanan bir prosedür ile belirlenebilir test malzemesi doğrudan MTT azaltma durumunda Mattek Corp.

Açıklamalar

Yazarlar, bu makalede kullanılan reaktifleri ve araçları üreten MatTek şirketinin çalışanlarıdır.

Teşekkürler

Yazarlar Modifiye Epiderm SIT (5 Çok merkezli Uluslararası Doğrulama Çalışması katılımı için BfR (Almanya), BASF SE (Almanya), IIVS A.Ş. (ABD), Zet-LSL (Avusturya) ZEBET teşekkür etmek istiyorum .)

Kaynaklar

  1. Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. ngrid, Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests. ALTEX. 21, 107-114 (2004).
  2. Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test. ATLA. 33, 351-367 (2005).
  3. Kandárová, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication. ATLA. , Forthcoming (2009).
  4. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H. The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA. 35, 559-601 (2007).
  5. Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances. Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Schäfer, M. R., Schäfer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kandárová, H. 15th Congress on Alternatives to Animal Experimentation, 2008 September 19-21, Linz Austria, , (2008).
  6. United Nations. Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS). , Second revised edition, UN. New York and Geneva. (2007).
  7. ESAC. Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing. , ESAC. (2008).
  8. Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers. Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).
  9. Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice. Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

EpiDerm SITRekonstr kte nsan EpidermisiMTT Canl l k AnaliziKimyasal Maruziyet ProtokolDokunun n nk basyonuSteril DPBS ile Y kama5 SDS Pozitif KontrolOpsiyonel Sitokin AnaliziSpektrofotometrik OD l m

İlgili makaleler