Yüksek Saflaştırılmış Alınması Toxoplasma gondii Süreksiz Sezyum Klorür Gradient ookistleri

Özet

Bu çalışma, enfekte kedi dışkılarından, moleküler biyolojik ve doku kültürü manipülasyonlarına uygun olan T. gondii ookistlerini kolayca saflaştıran modifiye bir CsCl yönteminin geliştirilmesini tanımlamaktadır

Özet

Toxoplasma gondiiinsanlarda yaygın olarak enfeksiyona neden olan zorunlu bir intrasellüler protozoon patojenidir. Gıda ve su kaynaklı salgınlarla ilişkili iyi karakterize edilmiş bir apikomplekstir. Kesin konak kedigiller olup, cinsel çoğalma burada gerçekleşir ve sonucunda yüksek oranda bulaşıcı ve çevresel olarak dirençli olan oosist gelişir. Enfeksiyon, kontamine etten alınan doku kistlerinin veya toprak ya da sudan alınan oosistlerin sindirilmesi yoluyla meydana gelir. Enfeksiyon genellikle sağlıklı bireylerde asemptomatiktir, ancak bağışıklık sistemi baskılanırsa tekrar aktive olabilen ve toksoplazmik ensefalite ve ölüme neden olabilen ömür boyu süren gizli bir enfeksiyonla sonuçlanır. Toksoplazma gondii kistleriyle kontamine olmuş et,T. gondiikistler Avrupa ve Amerika Birleşik Devletleri'nde enfeksiyonun birincil kaynağı olmuştur, ancak hayvan yönetimi ve yetiştiricilik uygulamalarında yapılan son değişiklikler ile gıda işleme ve hazırlama prosedürlerindeki iyileştirmeler kistlerin yaygınlığını önemli ölçüde azaltmıştırT. gondiietlerdeki kistler^{1, 2}. Yine de, insanlarda seroprevalans nispeten yüksek kalmaktadır ve bu durum, oosit ile kontamine toprak veya sudan maruziyetin olası olduğunu göstermektedir. Gerçekten de, dünya çapında su kaynaklı toksoplazmoz salgınları bildirilmiştir ve bu, çevresel oosit formuna maruz kalmanın önemli bir sağlık riski oluşturduğu teorisini desteklemektedir.^3-5. Bugüne kadar, çevredeki T. gondii oositlerinin yaygınlığını anlamaya yönelik araştırmalar, çevrede oositleri tespit etmeye yönelik araçların olmaması nedeniyle sınırlıdır.T. gondiisuda ve çevredeki ookistlerin tespiti ile ilgili çalışmalar, çevredeki ookistleri tespit etmeye yönelik araçların eksikliği nedeniyle sınırlıdır^{5, 6}. Bu, büyük miktarda yüksek saflıkta elde etmek için verimli saflaştırma protokollerinin olmamasından kaynaklanmaktadırT gondiiinfekte kedelerden araştırma amaçlı kullanılacak ookistler. Bu çalışma, kolayca T. gondii ookistlerini saflaştıran değiştirilmiş bir CsCl yöntemini tanımlarT. gondiiinfekte kedilerin dışkısından elde edilen ve moleküler biyolojik ile doku kültürü işlemlerine uygun oositler⁷.

Protokol

1. T. gondii ookistleri ile çalışırken dikkat edilmesi gereken genel güvenlik önlemleri

1. T. gondii ookistleri ile çalışırken tüm güvenlik önlemlerine uymak önemlidir. Çoğu sağlıklı bireyde T. gondii enfeksiyonu bağışıklık sistemi tarafından kolayca kontrol altına alınır; ancak bu durum, yaşam boyu süren bir enfeksiyonla sonuçlanır. Bağışıklık sistemi baskılanmış kişiler toksoplazmoza karşı özellikle hassastır ve T. gondii ookistleriyle çalışmamalıdırlar. Enfeksiyon ciddi doğum kusurlarına yol açabileceği için hamile kadınlar da T. gondii ookistleriyle çalışmamalıdır⁸.
2. T. gondii ookistleri yalnızca belirlenmiş bir alanda ve eğitimli personel tarafından işlenmelidir. Belirlenen alana giren diğer kişileri uyarmak için T. gondii ookisti çalışmasının devam ettiğini belirten levhalar asılmalıdır.
3. T. gondii ookistlerini işlerken laboratuvar önlüğü, tek kullanımlık önlük, tek kullanımlık eldivenler ve uygun göz koruması veya yüz siperliği gibi uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) kullanın.
4. Sık eldiven değişimi önerilir. T. gondii ookisti kontamine olmuş eldivenlerle hiçbir laboratuvar ekipmanına dokunmayın.
5. T. gondii ookistleri ile çalışırken her zaman tek kullanımlık emici astarlarla kaplanmış, otoklavlanabilir metal tepsiler kullanın. Kullanılan tüm rafların, tüplerin vb. ya tek kullanımlık ya da otoklavlanabilir olduğundan emin olun.
6. Tüm T. gondii atıkları en az bir saat boyunca iki kez otoklavlanmalıdır.
7. Tüm tek kullanımlık olmayan ekipmanlar (raflar, tepsiler vb.) da en az bir saat boyunca iki kez otoklavlanmalıdır.
8. Sıvıları aspire etmek için kullanılan vakum hatları, vakum pompasının kontaminasyonunu önlemek için bir Vacushield™ filtreye bağlanmalıdır.
9. T. gondii ookistleriyle çalışma tamamlandıktan sonra etkilenen tüm laboratuvar tezgahları dezenfekte edilmelidir. Çalışma alanına taze hazırlanmış %10 hipoklorit bolca uygulanmalı ve kurumaya bırakılmalıdır. Ardından alan suyla iyice durulanmalıdır.

2. Tamponların ve çözeltilerin hazırlanması

1. 752,66 g sükrozu 600 ml ddH₂O içinde çözerek 1 L 2,2 M sükroz çözeltisi hazırlayın. Sükrozu çözmek için ısıtmalı bir manyetik karıştırıcı kullanarak hafifçe ısıtın ve karıştırın. Tamamen çözündüğünde, hacmi ddH₂O ile 1 L'ye tamamlayın. Ardından çözelti, en az 20 dakika boyunca otoklavlanarak sterilize edilmelidir.
2. 700 ml ddH₂O içine 6,05 g Tris-HCl ve 3,7 g EDTA ekleyerek 1L TE tamponu (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA), pH 7,2 hazırlayın; pH'ı 7,2'ye ayarlayın ve ardından hacmi ddH₂O ile 1 L'ye tamamlayın.
3. CsCl gradyanı için, 103,25 ml TE tamponuna 21,75 g CsCl ekleyerek 1,15 özgül ağırlığa sahip bir CsCl stok çözeltisi (1,15-CsCl) hazırlayın. Çözelti A için 30 ml TE'yi 20 ml 1,15-CsCl ile karıştırın. Çözelti B için 20 ml TE'yi 30 ml 1,15-CsCl ve 12,5 μl fenol kırmızısı çözeltisi ile karıştırın. Çözelti C için 10 ml TE'yi 40 ml 1,15-CsCl ile karıştırın (Tablo 1).
4. 40 g NaOH'ı 800 ml ddH₂O içinde çözerek 1L 1 N sodyum hidroksit (NaOH) çözeltisi hazırlayın. Çözündüğünde, hacmi ddH₂O ile 1 L'ye tamamlayın.
5. 20 ml H₂SO₄'ü 980 ml ddH₂O ile karıştırarak 1 L %2'lik (hacimce) H₂SO₄ çözeltisi hazırlayın.

3. Sakkaroz flotasyonu

1. 50 ml'lik konik santrifüj tüpüne, %2 H₂SO₄ içeren 10 ml T. gondii oosist dışkı süspansiyonu ekleyin. Dışkı süspansiyonu ile daha önce tanımlandığı üzere⁸ sükroz flotasyon prosedüründen ön işlem görmüş örneklerin kastedildiği belirtilmelidir. Dışkı örnekleri enfekte kedilerden ilk alındığında, referans 8'de açıklandığı gibi sükroz flotasyon işleminden geçirilirler. Bu ek sükroz flotasyonu, CsCl saflaştırma sürecine taşınan dışkı kalıntılarını daha da minimize etmek ve mümkün olan en saf T. gondii oosistlerini elde etmek için gereklidir.
2. Dışkı süspansiyonuna 6 ml (3/5 hacim) 1 N NaOH ekleyerek %2 H₂SO₄ çözeltisini nötralize edin. Vorteksleyerek iyice karıştırın.
3. Dışkı süspansiyonuna, nihai konsantrasyonu 1.1 M olacak şekilde eşit hacimde (16 ml) 2.2 M sükroz ekleyin ve vorteksleyerek iyice karıştırın.
4. 10 ml'lik bir pipet kullanarak sükroz/dışkı süspansiyonunun üzerine dikkatlice 10 ml ddH₂O tabakası ekleyin. Süspansiyonu oda sıcaklığında, frenleme yapmadan 1.200 x g'de 20 dakika santrifüjleyin.
5. Üstteki su ve ara faz tabakalarını, pipeti çevirmeden hava-su ara yüzeyinden pipetleyerek dikkatlice toplayın ve yeni bir 50 ml'lik konik santrifüj tüpüne aktarın. Ara faz tabakası toplanırken sükroz taşınımını minimize etmek önemlidir.
6. Kalan sükroz/dışkı pelet çözeltisini tüpü vorteksleyerek karıştırın.
7. 3.4 ve 3.5 numaralı adımları tekrarlayın.
8. İki oosist ara faz çözeltisinin hacmini ddH₂O ile 50 ml'ye tamamlayın ve tüpleri oda sıcaklığında 2.000 x g'de 10 dakika santrifüjleyin.
9. Her tüpteki süpernatanı aspire edin, peletleri 5 ml TE tamponu ile yeniden süspanse edin ve oosist süspansiyonlarını birleştirin. Toplam birleştirilmiş hacim 10 ml olmalıdır.

4. CsCl gradyanı

1. 50 ml'lik bir polikarbonat Oak Ridge tüpünde, 18 gauge küt uçlu, otoklavlanabilir çelik iğneye sahip 50 ml'lik bir şırınga ve 2 yollu bir stopcock kullanarak her katmanı dikkatlice alt alta ekleyerek süreksiz bir CsCl gradyanı hazırlayın. Not: Gradyan katmanlarını kolayca ayırt edebilmek için Çözelti B'ye fenol kırmızısı eklenmiştir (Tablo 1).
2. Aşağıda listelenen sırayla şu çözeltileri tüpe yavaşça ekleyin. Akış hızının 0,5 ml/sn değerini geçmemesi gerektiği unutulmamalıdır.
   1. 10 ml TE/ookist süspansiyon örneği
   2. 8 ml Çözelti A
   3. 8 ml Çözelti B
   4. 8 ml Çözelti C
3. Oak Ridge tüpünü, fren olmadan, 4 °C'de 60 dk boyunca 12,000 x g'de santrifüjleyin. Sabit açılı rotor kullanımı kabul edilebilirdir, ancak yüksek hızlı salınımlı kova (swinging bucket) rotoru, tüp kenarlarında minimum fekal debris yayılmasıyla ookistlerin süspansiyon örneğinden daha iyi ayrılmasını sağlar. Yayılmanın derecesi fekal süspansiyonun bileşimine bağlıdır ve bu nedenle, fekal süspansiyon aşırı kirliyse iki kez CsCl gradyanı uygulamak gerekebilir.
4. Santrifüj işleminin ardından, çözelti A ve B arasındaki opak/beyaz ookist içeren bandı toplayın. Fekal debris kontaminasyonunu en aza indirmek için gradyanı bozmadan doğrudan ookist bandına gidin ve ookist interfazını 10 ml'lik bir pipet kullanarak toplayın. Ookist interfazını yeni bir 50 ml'lik konik santrifüj tüpüne aktarın. Ookist interfazını toplarken aspire edilen CsCl çözeltisi miktarını en aza indirmeye çalışın; çünkü bu miktar, yıkama basamağında ookistlerin çöktürülmesi sırasında sorun yaratabilir.
5. Ookistleri 30-40 ml ddH₂O ile yıkayın. Tüpü, fren olmadan, oda sıcaklığında 10 dk boyunca 2,000 x g'de santrifüjleyin. Ookist pelletini bozmadan süpernatanı dikkatlice aspire edin. Yıkama işlemini 2 kez daha tekrarlayın.
6. Son yıkamanın sonunda süpernatanı dikkatlice aspire edin ve pelletini 10 ml %2 sülfürik asit içinde yeniden süspande ederek kullanıma kadar 4 °C'de saklayın. Ookistler artık ileri manipülasyonlar için hazırdır. Ookist saflığı, örnekteki fekal debris yokluğuyla mikroskobik olarak kontrol edilebilir.