Bu video Kang göre kolloidal Coomassie G-250 boyama protokol sevdirmek olacaktır Ve ark. Jeller ortalama 4 ng protein tespiti için. Boyama ve herhangi bir çaba olmadan 2 saat içinde tamamlanır. Biz rutin analitik amaçlar için jel bazlı proteomik Kang'ın protokolü kullanın.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Proteinler için Poliakrilamid Jeller Hızlı ve Hassas Kolloidal Coomassie G-250 Boyama
Bu makalede
Özet
Özet
Coomassie Brillant Blue (CBB), genellikle basit bir boyama prosedürü ve yüksek kantitatif sunan SDS-PAGE ile ayrılmış proteinlerin görselleştirme için kullanılan bir boya. Ayrıca, kitle spektrometrik protein kimlik ile tamamen uyumlu. Ancak bu avantajlara rağmen, CBB, gümüş ya da floresan renklendirmeler daha az duyarlı ve bu nedenle analitik jel tabanlı proteomik yaklaşımlar proteinlerin tespiti için kullanılan nadir olarak kabul edilir.
Orijinal Coomassie protokolü 1 CBB duyarlılığını artırmak için bazı geliştirmeler yapılmış. Kolloidal parçacıkları içine boya molekülleri dönüştürerek düşük-bol proteinlerin tespiti geliştirmek için iki önemli değişiklikler getirilmiştir: 1988 yılında, Neuhoff ve arkadaşları CBB G-250 tabanlı boyama çözüm 2,% 20 metanol ve uygulanan yüksek konsantrasyonlarda amonyum sülfat 2004 Candiano ve ark. Mavi Gümüş, fosforik asit, amonyum sülfat ve metanol 3 varlığı ile G-250 CBB kullanarak kuruldu . Bununla birlikte, tüm bu değişiklikler sadece yaklaşık 10 ng protein bir algılama sağlar. Kolloidal Coomassie boyama için yaygın fameless bir protokol Kang ve ark tarafından 2002 yılında yayımlandı. Kompleks maddeler ile ilgili Neuhoff kolloidal CBB boyama protokol değiştirilmiş. Bunun yerine amonyum sülfat, alüminyum sülfat ve metanol yerine daha az toksik etanol 4 kullandı . Roman alüminyum bazlı Kang'ın çalışmada boyama biraz hassasiyet varyasyon proteinleri bağlı olarak 1 ng / bant (fosforilaz b) gibi düşük algılar üstün hassasiyet gösterdi.
Burada, hızlı ve hassas analitik amaçlarla proteinlerin kolloidal Coomassie boyama Kang'ın protokolü uygulaması göstermektedir. Biz rutin çalışma grubunda yapılan iki boyutlu jeller kullanarak hızlı ve kolay bir protokol gösterecektir.
Protokol
Bölüm 1: fincan yükleme kullanarak, iki boyutlu (2-D) jel elektroforezi
- IPG şerit rehidrasyon ve izoelektrik odaklama (IEF)
- 125 ul rehidratasyon çözüm Immobiline DryStrip jeller, pH 6-11 rehidrate (7 cm) [7 M üre, 2 M tiyoüre,% 4 ahbap, 50 mM hydroxyethyldisulfide IPG Tampon pH 6-11 ve% 2] Immobiline DryStrip Reswelling Tepsi en azından 10 saat.
- IEF örnek tampon çöktürülmüş protein örnek çözülür [7 M üre, 2 M tiyoüre,% 2 ahbap, Tampon pH 6-11 IPG ASB-14, 50 mM hydroxyethyldisulfide ve% 2], 100 ul başına 60-100 mg protein karşılık gelen% 2 .
- Çözünürleştirme (oda sıcaklığında en az 30 dakika) sonra, numune kaplarını kullanarak fi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Yenilikçi ya da sadece başka bir Coomassie protokol?
Şu anda Coomassie Brillant Blue prosedürleri boyama için birden fazla protokol var. Çoğu Neuhoff ve meslektaşları 2 tarafından en yaygın olarak kullanılan protokoller küçük veya büyük değişiklikler sonucu. Ayrıca Kang'ın protokolü Neuhoff formülü dayanmaktadır. Ama gerçekten proteomik araştırma için alternatif Coomassie boyama yöntemi nedir? Biz diğer Coomassie protokolleri ve hatta gümüş ve floresan renklendirmeler ile karş.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Ifşa etmek için hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Dr. Nicola Wiethölter Biz 1-D jellerin hazırlanması ve boyama için teşekkür ederiz.
Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (ND ve SM GRK 1089/project 5) hibe tarafından finanse edilen ve ND için Stiftung Jürgen Manchot bir araştırma bursu ile desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ürün Adı | Şirket | Katalog No. | Yorumlar |
| : IEF ve SDS-PAGE | |||
| Immobiline DryStrip jeller | GE Healthcare | 17-6001-94 | Tarih sona 2 yıl sonra bile kullanılabilir. |
| Immobiline DryStrip Reswelling Tepsi | GE Healthcare | 80-6371-84 | Organik çözücüler ile temizlemeyin. 7-18 cm IPG-şeritler için tasarlanmıştır. |
| Immobiline DryStrip Kit | GE Healthcare | 18-1004-30 | Bir tepsi, elektrot sahibi, anot ve katot elektrotları, hizalama ve numune kabı bar ve numune kaplarını içerir. |
| EPS 3501 XL Güç Kaynağı | GE Healthcare | 18-1130-05 | Malzemeleri 3500 kadar gerilimi V |
| Multiphor II Elektroforez Ünitesi | GE Healthcare | 18-1018-06 | Hareketli elektrotlar tüm uzunluğu IPG şeritler halinde IEF etkinleştirmek (7-24 cm şeritler IPG) |
| PerfectBlue jel sistemi Twin S | Peqlab | 45-1010-C | 10x10 cm mini-jel formatında SDS-PAGE. Jel odasının bir soğutma sistemi içerir. |
| : Kolloidal Coomassie G-250 boyama için | |||
| kapakları ile yemekleri boyama | VWR | 216-3412 | Mini jeller için uyar. Çalkalamalı İstiflenebilir. |
| alüminyum sülfat-18-hidrat | Merck | 1.01102.5000 | Merck ile en iyi deneyimi yaptı. Sadece 5 kg'lık paket kullanılabilir. |
| ortofosforik asit | Prolabo | 20 624,295 | Cam şişelerde satılır. |
Kaynaklar
- Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips. Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
