Denatüre Üre Poliakrilamid Jel Elektroforez (Üre SAYFA)

Özet

Denatüre üre poliakrilamid jel elektroforezi ayrı tek iplikli DNA veya RNA 500 nükleotidlerin bir sınıra kadar kullanılır. Üre, ısı denatüre örnekleri ve yapılandırılmamış tek iplikçikler ile birlikte moleküler ağırlığına göre jel matriks içinde göç ederler.

Özet

Üre SAYFA veya üre poliakrilamid jel elektroforezi denatüre ikincil DNA veya RNA yapıları yıkılır ve molekül ağırlığı dayalı bir poliakrilamid jel matris ayrılması için kullanılan 6-8 M üre, istihdam etmektedir. 2 ila 500 üsleri arasında parçaları, bir tek nükleotid gibi küçük uzunluğu farklılıklar, bu yöntemi kullanarak ¹ ayrılabilir. Örnek göç seçilen akrilamid konsantrasyonuna bağlıdır. Poliakrilamid bir daha yüksek oranda düşük molekül ağırlıklı parçaları giderir. Kombinasyonu üre ve sıcaklıklar 45-55 ° C jel çalışması sırasında yapılandırılmamış DNA veya RNA molekülleri birbirinden ayrılması için izin verir.

Genel olarak bu yöntem, tek iplikli DNA veya RNA parçaları, enzimatik parçalanma reaksiyonlarını sentezlenmiş veya etiketli oligonükleotidler veya ürünlerin analiz veya arındırmak için gereklidir.

Bu video makalede denatüre üre poliakrilamid jeller hazırlamak ve çalıştırmak için nasıl göstermektedir. Orijinal protokol ^1,2 ek olarak, teknik ipuçları yer almaktadır.

Protokol

Bu deneysel prosedür için tam ve ayrıntılı bir metin protokol Moleküler Biyoloji Mevcut Protokoller kullanılabilir. Ayrıntılı adım adım talimatlar, jel sandviç montajı için ve jel cihazlar ^için 3 BioRad web sitesinde bulunabilir.

Gerekli ekipman:
Cam levhalar (iç ve dış)
10 cm hücresi: 10,1 x 7,3 cm (iç plaka), 10,1 x 8,2 cm (dış plaka), BioRad
20 cm hücre: 20 x 20 cm (iç plaka), 20 x 22,3 cm (dış plaka), BioRad
0.5-1.5 mm jel tarak ve ayırıcılar
Jel döküm standı
Kapak ve kablolar ile Jel cihazlar
Yüksek gerilim güç kaynağı
Isıtma blok veya su banyosu
Serolojik pipetler ve Pipet yardım
Pipet ve pipet uçları
Jel kurutma makinesi veya tarayıcı

Reaktifler ve Çözümleri:
Üre (ultra saf)
% 40 poliakrilamid çözüm (29:1)
10 x TBE çözeltisi (Tris-borat, EDTA tampon)
Deiyonize, distile su
TEMED
% 30 (w / v) amonyum persülfat çözümü
0,5 x TBE çözüm
Formamid
EDTA
Ksilen cyanol
Bromphenol mavi
Metanol
Etanol

Hacim	50 ml			60 ml			10 ml
Akrilamid konsantrasyonu	% 10	% 12.5	% 15	% 10	% 12.5	% 15	% 10	% 12.5	% 15
g ÜRE	24	24	24	28,8	28,8	28,8	4,8	4,8	4,8
ml% 40 Akrilik (29:1)	12,5	15,625	18,75	15	18,75	22,5	2,5	3,125	3,75
ul 30% APS	166	166	166	199,2	199,2	199,2	33	33	33
ul TEMED	20	20	20	24	24	24	4	4	4
10 x TBE	5	5	5	6	6	6	1	1	1
Hacim deiyonize, distile su ile doldurun

Tablo 1: tek telli oligonükleotidler çözmek için çeşitli akrilamid konsantrasyonları ve hacimleri için gerekli Reaktifler ve çözümler

Jel sandviç montaj ve jel hazırlama

1. Jel üreticileri açıklamasına göre birleştirin ve jel-döküm haznesi ³ jel düzeltmek. 0.5-1.5 mm kalınlığında ayırıcılar kullanın.
2. Moleküler biyoloji alanındaki mevcut protokollere göre uygun poliakrilamid çözüm hazırlayın ya da Tablo 1'de listelenmiştir. Denatüre akrilamid jel 20 cm x 22 cm x 1,5 mm, 60 ml jel çözüm ve 10.1 x 8.2 cm x 1 mm jel 5 ml jel çözüm için yeterli olacaktır. Birkaç üslerinden aralığında beklenen ürünler / bantlar Büyük jeller kullanılır, daha sonra uzun bir jel tek nükleotid bir fark bantları çözecektir. Beklenen bantları 10'dan fazla nükleotidler farklılık varsa, küçük jeller parçaları çözmek için uygun olacaktır. Ayırma gereksinimlerinin uygun poliakrilamid yüzdesi seçin, daha yüksek bir poliakrilamid konsantrasyonları daha düşük molekül ağırlığı parçaları çözecektir. Ultra saf üre ve istenilen miktarda akrilamid karışımı kullanın. 0.5-1 x TBE nihai bir konsantrasyon ve hacim deiyonize, distile su ile doldurmak için TBE tampon jel karışımı ekleyin. Mikrodalga fırında 20 saniye boyunca çözüm Isı ve hafifçe karıştırın. Çözüm yandan ısınana kadar büyük jel hacimleri için bu adımı tekrarlayın.
3. Hemen bir serolojik pipet ve iki cam levha arasında otomatik bir pipet yardımı ile jel dökün. Hava kabarcıkları tanıtan kaçının. Tarak yerleştirin ve 30-60 dakika süreyle jel polimerize.

Elektroforez cihazı kurmak ve jel prerun

1. Talimatları ³ üretmektedir göre döküm haznesi ve jel aparat montaj jel ayırın.
2. Dolgu, cam plakalar, alt olacağını alt tampon odasına zekâ çalışan tampon (0.5-1 x TBE)tamponu ile 2-3 cm birleşti. Tampon çalışan jel top üst tampon odasına kadar doldurun.
3. Tarak dikkatlice çıkarın ve ipuçları yükleme Bir pipet ve jel kullanarak çalışan tamponu ile kuyu durulayın.
4. Yüksek gerilim güç kaynağı kabloları jel sistemi ve fiş kapağını takın. Örnekleri yükleyebilirsiniz önce jel ısı ve jel kalan üre kaldırmak için en az 30 dakika boyunca jel prerun var. Optimum sıcaklık 45-55 arasında olmalıdır ° C 60 daha yüksek ° C bantları, yayma veya cam plakalar çatlak olabilir olabilir. Kaçının Prerun (jel başına 15-25 W) için sabit watt seçin.

Örnek hazırlama

1. Bu arada numunesinin. Bu nedenle, uygun miktarda örnek 2 x jel yükleme karışımı ekleyin. Yükleme karışımı genellikle% 90 formamid,% 0.5 'lik EDTA,% 0.1 ksilen cyanol ve% 0.1 bromphenol mavi içerir.
2. Örnekleri jel yüklenecek önce, örnekler, örnekleri, birkaç dakika 70-90 ° C arasında ısıtarak ısı denatüre olmalıdır.

Jel yükleme ve çalıştırma

1. Prerun bittiğinde kapağı kaldırmak ve iyice kuyu içine süzülen üre gibi önce açıklanan cepleri durulayın.
2. Cebinden alttan örnekleri dikkatle uygulayın. Hava kabarcıkları tanıtan kaçının. Yükleniyor tampon çalışması sırasında eşit koşulları sağlamak için boş cepleri uygulanacak.
3. Kapak kurma ve 55 jel sıcaklığını korumak için sabit watt jel çalıştırmak ° C prerun benzer. Jel boya ön alt ucuna ulaşıncaya kadar marker boyaların göç uyun. Çalışma süresi kullanılan akrilamid yüzdesi, tampon ve jel kalınlığı iyonik gücü bağlıdır. Bir çalışma, 2-4 saat arasında sürebilir.
   Jel sıcaklığını kontrol edin. Bir jel termometre çalışması sırasında sağ sıcaklığını izlemek için yardımcı olabilir.

Jel Süreci

1. Jel, boya ön jel sonuna ulaştığında alt tampon odasının söndürüldü. Odasından çıkarın ve jel kelepçeler gevşetin. Ayırıcılar dışarı doğru çekin ve dikkatle cam plakalar yüzlülük. Gerekli jel parçası içeren üst kesip durumunda.
2. Jel, jel fiksasyon solüsyonu (TBE artı% 5-10 Metanol ve Etanol aynı konsantrasyon) dikkatlice ile bir çanak içine aktarın. 5-10 dakika çözüm jel bırakın ve tampon iki kez değiştirin.
3. Jel, bir vakum jel kurutma makinası ya da doğrudan tarama jel kullanarak daha fazla işlem için hazırdır.

Tartışma

1. Grubun keskinlik, çeşitli faktörlere bağlıdır. Yani ideal 1-5 ul arasında keskin bantları için yüklenen örnek hacmi, mümkün olduğunca küçük olmalıdır. Ancak, 15'e kadar ul hala kabul edilebilir bir çözüm sağlar yüklenebilir. Keskin bantları daha az örnek hacmi sonuçları.
2. Bant kalitesi de jel kalınlığına bağlıdır. 0,75 mm gibi Tiner jeller, 1.5 mm kalınlığında jeller daha iyi sonuçlar göstermektedir.
3. Bantların şekli de örnek jel cebine eşit uygulanabilir değilse jel yükleme sırasında etkilenmiş olabilir. Yükleme ...