Burada yetişkin zebrafish retroorbital enjeksiyon nasıl yapılacağını göstermektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yetişkin Zebra balığı retro-orbital Enjeksiyon
Bu makalede
Özet
Özet
Bütün hayvanlar İlaç tedavisi, kimyasal, farmakolojik ve genetik çalışmalar için herhangi bir model sistem önemli bir araçtır. İntravenöz (IV) enjeksiyonu genellikle en etkili ve non-invaziv bir ilgi ajan teslim şeklidir. Zebra balığı (
Protokol
Bölüm 1. Enjeksiyon malzemesinin hazırlanması
- Tg (globin: GFP) hücreleri:
- Heparin (1unit/ul) ponksiyon balıkların solungaç arkasında kaplı 10ul pipet kullanarak yetişkin donör balık yerleştirir.
- , Kırmızı kan hücreleri aspire ve hücre tampon dağıtmak (0.9X PBS +% 5 FBS +% 1 Kalem / Strep).
- Filtre hücresi 40uM örgü üzerinde süspansiyon ve hemasitometre kullanarak, daha önce LeBlanc ve ark açıklandığı gibi hücre konsantrasyonunu belirlemek.
- Spin ve nihai enjeksiyon hacmi 5ul daha fazla olduğu gibi istenilen konsantrasyonda hücre tamponda tekrar süspansiyon. Burada 1.5-2 milyon hücre / alıcı enjekte edilir.
- Dekstran, Teksas Red ® için, 10-12 mg / ml son bir enjeksiyon konsantrasyon için DPBS boya çözülür. Başına 4 balık uL enjekte planlayın.
Bölüm 2. Enjeksiyon
- (4.2ml (4mg/ml) tricaine/100ml balık su) tricaine balık anestezisi.
- Yıkama Hamilton şırınga% 70 etanol kullanılarak enjeksiyon öncesinde 3-4 kez. 0.9X DPBS 3-4 kez durulayın.
- Place balık dorsal tarafına ve nemli bir sünger üzerinde sağ karşı karşıya.
- Sağ eli ile ve Hamilton şırınga pistonu parmağı ile tutun. Sol elinizle hafifçe ile balığın vücudu stabilize.
- Balık gözü bir saat olsaydı, iğne 7:00 pozisyonunda ve balık (Şekil 1) 45 derecelik bir açıyla işaret olurdu böyle yukarı bakacak şekilde konik iğne yerleştirin.
- 07:00 pozisyonda yavaşça içine iğne 1-2 mm takın ve pistonu yavaşça bastırın.
- Balık, taze E3 su kurtarmak için izin verin.
- Enjeksiyonlar arasındaki farklı reaktifler, yukarıda açıklandığı gibi, iğne yıkayın.
- Flick hücre hücre topaklanma önlemek için hücrelerin her birkaç dakikada bir tekrar süspansiyon çözüm.
- Bulaşmasını önlemek için günlük su değişimleri, 1 hafta boyunca akış kapalı balık tutun. Biz bu dönem için (10 ml Stres kat + 5ml pemafix + 38 litre başına E3 su 5ml melafix) YBÜ suda balık tutmak.
Bölüm 3. Temsilcisi Sonuçlar
Doğru yapıldığında, bu bir şekilde etiketlenmiş olması durumunda enjekte malzeme görselleştirmek mümkündür. Örneğin, Tg (globin: GFP), kırmızı kan hücreleri, Şekil 2'de görüldüğü gibi, kısa bir süre enjeksiyon sonra alıcı casper balık damar içinde dolaşan bir floresan diseksiyon mikroskop altında görülmelidir. Aynı şekilde, bir 70kDa dekstran, Texas Red ® konjuge enjeksiyon retro-orbital enjeksiyonu takiben hemen şeffaf balık (Şekil 3), damarsal görüntülendi olabilir . Tg (β-aktin: GFP) Floresan böbrek hücreleri donör balık da retro-orbitally ışınlanmış casper alıcı balık içine enjekte edilir. Bu hücreler, sonunda, birkaç hafta sonra (Şekil 4b) böbrek yeniden doldurmanız sonra alıcı iliği (Şekil 4a) ev ve devam edecektir.
Enjeksiyon, çok sığ veya iğnenin açısını retro-orbital venöz sinüs boşluğuna atlar, enjekte edilen malzeme, göz çevresinde havuzu ya da dışarı akan görüntülenmiştir olabilir. Enjeksiyon çok derin ise Alternatif hala kurtarmak olsa, balık, doku hasarı veya aşırı kanama karşılaşabilirsiniz. Doğru yapıldığında, retroorbital enjeksiyondan sonra ölüm, toplam enjekte balık ve kan dolaşımına teslim başarı% 5'ten az toplam enjekte edilen balığın% 90 daha fazla olmalı.
Şekil 1: retroorbital enjeksiyon tekniği İllüstrasyon. Balığın sağ gözünün 07:00 konumunu doğru enjeksiyon noktaya tekabül eden bir analog saat olarak temsil edilmektedir.
Şekil 2: Tg (globin: GFP), retroorbital enjeksiyon üç gün sonra bir yetişkin casper balık kuyruk damar içinde dolaşan kırmızı kan hücreleri .
Şekil 3: Başarılı enjeksiyon Texas Red konjuge 70kDa dekstran ® olarak kullanılan boya şeffaf yetişkin balık, casper floresan damarsal üretir ve kolayca standart tüm hayvan floresan mikroskopi kullanılarak izlenebilir.
Şekil 4a: Üç gün donör balık Tg (β-aktin: GFP) tüm böbrek iliği hücrelerinin retroorbital enjeksiyonu takiben, hücreler ışınlanmış yetişkin casper alıcı balık böbrek iliği homing görüntülenebilmekte.
Rakam4b: Tg (β-aktin: GFP) tüm böbrek iliği hücrelerinin retroorbital enjeksiyonu takiben dört hafta donör balık, yeşil donör tüm böbrek iliği hücreleri ile alıcı böbrek repopulation ışınlanmış yetişkin casper alıcı balık görüntülenebilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Yetişkin zebrafish retroorbital enjeksiyon, kan dolaşımına enjekte edilen malzeme teslimi en yüksek verimi en düşük ölüm insidansı verir. Çünkü enjeksiyon yerinde doğa, delinme, enfeksiyon ve kan kaybı miktarı oluşumunu azaltarak, çabuk iyileşmek için görünür. Bu site bile defalarca, örneğin, günlük ilaç enjeksiyonları için kısa bir süre içinde enjekte edilebilir.
Büyük miktarda uyuşturucu sadece dalmış ve ilgi ilaç içeren suya batırılmış balık yetişkin balıklar geleneksel tedavi yöntemleri ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Teşekkürler
Bu çalışma, Howard Hughes Tıp Enstitüsü ve embriyonik hematopoez çalışmaları için bir hibe NIH tarafından desteklenmektedir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Domuz intestinal mukozasından elde edilen sodyum heparin tuzu | Sigma-Aldrich | 2106 | 300 USP ünite içeren, önceden tartılmış flakon |
| Tricaine-S | Western Chemical | MS-222 | |
| Dulbecco’Fosfat Tamponlu Salin | Invitrogen | 14190-144 | |
| Dekstran, Texas Red® | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | |
| E3 | 5mM NaCl 0,17 mM KCl 0,33 mM CaCl22 0,33 mM MgSO₄2 | ||
| Mikrolitre Şırınga | Hamilton Co | 80300 | 701N 10uL SYR (26s/2”/2) |
Kaynaklar
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal. 37, 26-32 (2008).
- Pinkerton, W., Webber, M. A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route. Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).
- White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish. J. Vis. Exp. , (2007).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
