Ayrıntılı bir protokol görüntüleme için DNA onarım komplekslerin gerçek zamanlı oluşumu açıklanmıştır Bacillus subtilis Hücreler.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Görüntüleme Uyuşmazlığı DNA Hasar Onarım ve Hücresel Yanıtları Bacillus subtilis
Bu makalede
Özet
Özet
Hem prokaryot ve ökaryotlarda DNA hasarı karmaşık bir dizi fizyolojik değişiklikler ile yanıt verir. Gen ekspresyonu, mevcut proteinlerin yeniden dağıtımı ve yeni protein kompleksleri montaj değişiklikler DNA lezyonları ve eşleşmeyen DNA baz çifti çeşitli teşvik edilebilir. Floresan mikroskopi DNA lezyonları ve karmaşık hücre içi mimari canlı bir hücre içinde DNA replikasyon durumunu izlemek için bu ve diğer tepkiler görselleştirilmesi ve ölçülmesi için güçlü bir deney aracı olarak kullanılmıştır. , Floresan muhabiri proteinleri ve DNA replikasyonu ve tamiri makine bileşenleri arasında Translasyonel füzyonlar ipuçlarını belirlemek için kullanılan hedef DNA onarım proteinleri cognate lezyonlar
Protokol
Mikroskopi için hücrelerin Büyüyen kültürlerin
1. Bir veya iki gün önce görüntüleme, B. hazırlamak subtilis görselleştirmek için istediğiniz translasyonel füzyon proteini içeren süzün. Adımları 1A ve 1B Deneme turlarında, büyüme durumu suşu en iyi görüntüyü sağlayan belirlemek için gerekli olacaktır. Çoğu durumda, hücreler, üstel büyüme aşamasında görüntülü olmalıdır.
- Bazı B. subtilis suşları (endojen lokustaki ilgi ve GFP geninin arasında translasyonel füzyon entegrasyonu nedeniyle yetersiz büyümeye, özellikle suşları), görüntüleme için iki gün önce ilk büyüme, yüksek kaliteli görüntül....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Deneme ve yanılma her suşu için yüksek kaliteli görüntüler için maruz kalma koşullarını bulmak için gereklidir; 100 2000 ms pozlama GFP (FITC) ve FM4-64 için uygun iken, 1 milisaniye beyaz ışık görüntüler için uygun olduğunu bulmak (TRITC ) görüntüleri. Pozlama süresi kullanılan görüntüleme cihazları bağlı olarak değişecektir. Biz, aynı slaytta birden fazla suşları mevcuttur ped ped sınır hücrelerinin kalite ve difüzyon gerginlik farklılaşma karmaşık hale getirebilir basit görüntüleme için 15 kuyu mikroskop lamı başına .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Teşekkürler
Yazarlar Dr teşekkür etmek istiyorum. Başlangıçta floresan mikroskopi LAS eğitim için Philina S. Lee ve Alan D. Grossman. Yazarlar ayrıca teşekkür Dr. Yardım ve ipuçları görüntüleme için Melanie Berkmen ve Hajime Kobayashi. Bu çalışma, Edebiyat, Fen-Edebiyat Fakültesi ve Michigan Üniversitesi, Moleküler, Hücresel ve Gelişimsel Biyoloji Bölümü start-up fonları tarafından desteklenen oldu.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
Özel çözüm tarifleri: 1
10x S7 50 tuzları
0,5 M MOPS
100 mM Amonyum Sülfat
50 mM potasyum fosfat mono
Sterilize Filtresi ve depolama önce sarın S7 folyo ile 50 medya
100x Metaller
0.2 M MgCl 2
70 mM CaCl 2
5 mM MnCl 2
0.1 mM ZnCl 2
100 mcg / mL Tiamin HCl
2 mM HCl
0.5 mM FeCl 3 *
dH 2 O son hacim
* FeCl 3 yağış önlemek için, son ilave edilmelidir.
Filtre Sterilizasyon sonrasında, folyo sarın 100x Metal çözüm.
S7 50 medya
1x S7 50 tuzları
1x Metal
1% Glikoz
0.1% Glutamat
40 mcg / ml Triptofan
40 mcg / ml Fenilalanin
H 2 O son hacim distile
10x Spizizens (gram / L)
151.4 mM Amonyum Sülfat (20g / L)
803,8 mM potasyum fosfat mono (140g / L)
440,9 mM potasyum fosfat dibazik (60g / L)
34,0 mM Sodyum Sitrat (10g / L)
16.6 mM MgSO 4 (2 g / L)
dH 2 O son hacim
Sterilize filtreleme
Kaynaklar
- Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).
- Berkmen, M. B., Grossman, A. D. Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle. Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
