Yöntem makalesi

Mikro desenli Yüzeyler, protein-protein etkileşimleri-vivo Algılama

DOI:

10.3791/1969

⸱

19 Mart 2010

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biophysics, Johannes Kepler Universitat Linz

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu video kullanımı ile mikro-desenli yüzeyler, protein-protein etkileşimleri sonraki analizi ile deneyler gösterir. Bu yaklaşım, canlı hücreler protein etkileşimleri tespit etmek imkanı sunar ve kantitatif bilgileri ayıklamak imkanı ile yüksek verimlilik özellikleri bir araya getiriyor.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Moleküllerin etkileşim ağı çözülüyor

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microcontact Baskı:

  1. Bir neşter kullanılarak PDMS damga micropattern alan Kes
  2. Etanol (% 100) ve distile su ile püskürtülerek micropattern içeren alan yıkayın.
  3. PDMS damga azot veya argon gazı ile kurulayın.
  4. Pipet 50 ul BSA Cy5 çalışma solüsyonu (0.67 mg / ml) tüm micropattern alanında çözüm ile kaplıdır, böylece PDMS damga üzerine. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  5. Fosfat ile kızarma micropattern alanında yıkayın Tamponlu Salin (PBS) ve distile su.
  6. PDMS azot veya argon gazı ile kurulayın.
  7. Ortasında bir epoksi kaplı lamel üzerine kendi ağırlığı altında PDMS damga yerleştirin ve petri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  8. Lamel arka PDMS damga pozisyon Etiket ve bir forseps ile slayt damga şerit.
  9. Çubuk lamel microcontact baskılı alan üzerinde Güvenli Seal Hibridizasyon odasına. Etiket alanın merkezinde lokalize etmek yardımcı olur.
  10. Pipet 60 ul streptavidin tepki odasına çözüm (50 mg / ml) ve örnek oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin.
  11. Örnek odasının içine tampon bir bağlantı noktası ekleyerek ve bir pompa ile ikinci bağlantı noktasına aynı anda çıkarmadan 1 ml PBS ile yıkayın.
  12. Pipet 60 ul biotinlenmiş antikor işi çözüm (10 mg / ml% 0.1 Tween 20 ile desteklenmiş PBS "PBST") reaksiyon odası ve oda sıcaklığında 60 dakika inkübe içine.
  13. Örnek, odanın içine tampon bir bağlantı noktası ekleyerek ve bir pompa ile ikinci limanda tekrar kaldırarak 1 ml PBST ve daha sonra 1 ml PBS ile yıkayın.
  14. Micropatterned yüzeyleri PBS içinde hücre ekimi için hazır olana kadar oda sıcaklığında karanlıkta saklayın.

Micropatterned yüzeye hücrelerin inkübasyonu:

  1. % 50, 3 cm doku kültürü plaka izdiham yapışık hücrelerin büyümesine.
  2. Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) solüsyonu ile ilgi yem ve av proteinleri ifade hücreleri ayırın ve 1,000 rpm'de 5 dakika santrifüj.
  3. Süpernatantı atın ve hücre pelletini göre büyüme ortamında çözülür.
  4. 1000 rpm'de 5 dakika santrifüjleyin.
  5. Süpernatantı atın ve uygun büyüme ortamında hücre pelletini çözülür.
  6. Exchange hücre süspansiyonu 60 ul micropatterned lamel reaksiyon odasından PBS.
  7. Distile su ile ıslatma ve steril bir ped, kuru çalışmasını örnek önlemek için petri içine koyarak nemlendirilmiş bir oda oluşturun.
  8. 37-gece boyunca hücreler inkübe ° C micropatterned yüzeyler% 5 CO 2 atmosfer.
  9. Hücrelerin mikroskop analiz etmeden önce, Ca 2 de dahil olmak üzere Hank tamponlu tuz çözeltisi orta alışverişinde + ve Mg 2 +.

Mikroskopi:

  1. Lamel uygun bir montaj yerleştirilir ve hücre morfolojisi, beyaz ışık altında kontrol edilir.
  2. BSA Cy5, desen kalitesi, 647 nm dalga boyunda eksitasyon tarafından kontrol edilir.
  3. Toplam İç Yansıma (TIR) ​​uyarma altında 488 veya 514 nm'de, floresan av proteininin (GFP veya YFP) Micropatterns kaydedilir.

Temsilcisi sonuçları:

Hedef proteinlere micropatterned bir yüzey üzerinde yetiştirilen hücreler arasındaki etkileşimi varsa, av yem yeniden dağıtılması takip edecektir. Micropattern av proteinin floresan etiketi ile görüntülendi olabilir. Önemlisi kontrast elde edilen doğrudan bir etkileşim gücü ölçümü (bkz. Şekil 1) sağlar. Bu nedenle iki proteinin etkileşimi basit bir değerlendirme mümkün olur daha ölçülen birincil veri işleme gerek kalmadan.

figure-protocol-1
Şekil 1 farklı etkileşim güçlü canlı hücre plazma membranı yem yeniden düzenlenmesi. CD59-antikor microbiochips TIR T24 hücrelerinin CD71-antikor (a) CD71-GFP ile transfekte görüntüleri, (b) CD4 ve CD4-antikor sitozolik YFP ve (c) GPI-GFP-DAF gösterilmiştir. Veriler için karakteristik olan güçlü (a), (b) veya Zayıf etkileşim (c). (A), (Weghuber ve ark. Baskıda), (b) (Schwarzenbacher ve ark, 2008) yeniden .

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İlişikteki video canlı hücrelerin plazma zarı (Brameshuber ve diğerleri, 2009;. Weghuber ve arkadaşları, basın Schwarzenbacher ve ark, 2008) protein-protein etkileşimleri tespit etmek için bir yöntem gösteriyor. Prensip olarak, herhangi bir TIRF tabanlı mikroskobu platformu okuma sistemi olarak kullanılacak. Yüksek hassasiyeti (örneğin tek moleküllerin tespiti için) istenen zaman, gelişmiş mikroskoplar gerekecektir. En iyi sonuçlar, hazırlanması sürecinde aşağıdaki kritik noktaları elde etmek için özel bir dikkat gerektirir:

  1. Karanlık koşullar altında saklayın Cy5 stok solüsyonu fluorofor beyazlatma önlemek ve microcontact yazdırmadan önce taze BSA Cy5 çalışma solüsyon hazırlanır.
  2. PDMS micropattern pipet ucu ile kazıyın ve örnek fluorofor beyazlatma önlemek için karanlık koşullar altında inkübe için dikkatli olun.
  3. Petri cam slayt yapışmasını önlemek için steril bir ped lamel koyun. Cam slayt PDMS damgası yapıştırılır sonra, hareket etmez.
  4. Reaksiyon odasındaki hava kabarcıkları kaçının ve fluorofor beyazlatma önlemek için karanlık koşullar altında örnek kuluçkaya yatmaktadır.
  5. Tuz kristallerinin oluşumunu önlemek için, fazla 2 dakika için örnek kurumasını bekleyin.
  6. Hücrelerin ayrılmasına olarak tripsin kullanmayın tutunmaya şimdiye kadar ifade membran proteinlerinin ekstrasellüler etki alanı olacaktır. Yüzeyindeki hücrelerin ek hemen sonra micropatterns oluşturmak için düşük devir hızı ile proteinler tripsin kaçınmak yararlı olacaktır.
  7. Mikroskop inkübe hücrelerinin sayısını kontrol ve hücrelerin% 30-50 daha fazla izdiham ulaşmak olmadığını emin olun. Aşırı hücrelerin antikor kaplı yüzey hücreleri hızlı eki nedeniyle hemen çıkarılmış olduğundan emin olun.
  8. Sadece yüksek kaliteli BSA-Cy5 desen slayt ileri analiz için kullanılabilir.
  9. , Floresan av protein Kararlı ifade tarama başına analiz edilebilir hücreleri daha fazla sayıda nedeniyle tercih edilir.
  10. Yeterli TIRF ayarlaması nedeniyle desen sitozolik arka plan görselleştirmek için vazgeçilmez bir unsurdur.

Mikro-desenleme tekniği, protein-protein etkileşimleri analiz için çeşitli olanaklar sunmaktadır. Öncelikle, aynı zamanda yerel, mekansal çözüme protein-protein etkileşimleri miktarının birlikte, yanlış pozitif veya negatif, yüksek bir sayı vermenin dezavantaj olmaksızın, zayıf ya da dolaylı etkileşimleri algılama mümkündür. İkincisi 2-hibrit ekran gibi biyokimyasal yaklaşımlarla elde etmek zor canlı hücrelerin plazma zarı, protein-protein etkileşimleri analiz etmek için araştırmacı sağlar. Üçüncü yaklaşım, sıcaklık, farklı proteinlerin veya diğer molekülleri ya da post-translasyonel modifikasyonlar varlığı gibi çevresel değişiklikler modüle yem-av etkileşimlerinin tespiti için izin verir. Bu nedenle tahlil canlı hücreleri bağlamında belirli bir etkileşim çiftinin tarama modülatörleri sağlar. Ayrıca, yakalama ligand veya monovalan ligandların kullanımı yüzey yoğunluğu azaltarak, dinlenme devlet analizi mümkün hale gelir. Son olarak, yeterli tarama platformlarda kullanılması halinde, analiz hücrelerinin sayısı, ilaç firmaları, ilaç tarama için yüksek kapasiteli talepleri (Ramm, 2005) maç için yeterince yüksek.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Görselleştirme Araştırma Lab ana alınan Olympus, Brown Üniversitesi tarafından sağlanan veya (Kim ve ark, 2003) çoğaltılamaz video görüntüleri içerir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz GPI-GFP, hCD71 GFP inşa ve Daniel Legler, Konstanz Üniversitesi, İsviçre, onu türlü yardım, Katharina Strub, İsviçre'nin Cenevre Üniversitesi Quentina Beatty, Linz, Avusturya Üniversitesi, teşekkür etmek istiyorum -DAF inşa. Avusturya Federal Bilim ve Araştırma Bakanlığı GEN-AU projesi; Bu çalışma, Avusturya Bilim Fonu'nun (proje Y250-B03 FWF) tarafından desteklenmiştir.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brameshuber, M., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schuetz, G. J. Reply to "Uncoupling diffusion and binding in FRAP experiments. Nat. Methods. 6, 183-184 (2009).
  2. Kim, P. W., Sun, Z. J., Blacklow, S. C., Wagner, G., Eck, M. J. A Zinc Clasp Structure Tethers Lck to T Cell Coreceptors CD4 and CD8. Science. 301, 1725-1728 (2003).
  3. Ramm, P. Image-based screening: a technology in transition. Curr. Opin. Biotechnol. 16, 41-48 (2005).
  4. Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Brameshuber, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells. Nat. Methods. 5, 1053-1060 (2008).
  5. Weghuber, J., Brameshuber, M., Sunzenauer, S., Lehner, M., Paar, C., Haselbruebler, T., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Paster, W., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning. Methods in Enzymology. , Forthcoming Forthcoming.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Floresans MikroskobuToplam Yans maOlta Av Etkile imleriFloresan Av Yeniden Da l mCD4 LCK Etkile imiY ksek Kapasiteli TaramaOtomatik Odak SabitlemeKontrast Hesaplama Program

İlgili makaleler