Yetişkin Drosophila Beyinlerinin Montajı: Konfokal Görüntüleme için Slaytlar Hazırlama Yöntemi

Bu protokol, Kelly ve ark., Yetişkin Drosophila melanogaster Beyinlerinde Mantar Gövdesi ve Fotoreseptör Nöronlarının Diseksiyonu ve İmmünofloresan Boyanması, J. Vis. Exp. (2017).

1. Yetişkin D. melanogaster Beyinlerinin Mikroskop Slaytlarına Montajı ve Görüntülenmesi

1. Bir "köprü" slaydı oluşturun. Pozitif yüklü bir slayt üzerine yaklaşık 1 cm aralıklarla iki "taban" lamel yerleştirin. Sürgünün pozitif yüklü tarafının yukarı baktığından emin olun. Lamelleri Şekil 1 A'da gösterildiği gibi tırnak cilası ile slayta yapıştırın. Montaj ortamının bu taban kapağı kızaklarının altında fitil olmamasını sağlamak için her bir taban kapağı kızağının üç dış kenarını tırnak cilası ile kapatmak genellikle yardımcı olur. Devam etmeden önce ojenin tamamen kurumasını bekleyin (10 - 15 dakika).
2. Slaytı stereomikroskobun altına yerleştirin ve diseke edilmiş beyinleri içeren montaj ortamı solüsyonunu iki lamel arasındaki boşluğa pipetleyin. Daha fazla kontrast sağlamak için, deveboynu ışıklarını tezgah üstü ile paralel olacak şekilde manevra yapmak faydalıdır.
3. Beyinleri slayttan pipetlememeye dikkat ederek bir pipet kullanarak slayttan fazla montaj ortamını çıkarın.
4. Ekstra montaj ortamını fitille uzaklaştırın. Bu, bir sonraki adımda beyinlerin daha hassas bir şekilde konumlandırılmasını sağlayacaktır.
5. Bir çift forseps ve stereomikroskop kullanarak, beyinleri anten lobları yukarı bakacak şekilde bir ızgara düzeninde slayt üzerine yerleştirin.
6. Beynin üzerine bir kapak fişi ("köprü") yerleştirin (Şekil 1A). Köprü kapak kızağının "taban" kapak kızaklarına temas ettikleri kenarlarını kapatmak için tırnak cilası kullanın.
7. Bir p200 pipeti kullanarak, köprünün altındaki orta boşluğu yeni montaj ortamıyla yavaşça doldurun (Şekil 1B). Merkez lamel açık kenarına her seferinde bir damla yerleştirin ve montaj ortamının orta köprü lamel altında fitil olmasına izin verin. Tüm boşluk montaj ortamıyla dolana kadar devam edin, ardından üst ve alt kısmı şeffaf tırnak cilası ile kapatın.
8. Tırnak cilası kuruduktan sonra, slaytları hemen görüntüleyin veya -20 °C'de ışık geçirmez, sıkı bir slayt kutusunda saklayın.
9. Bir hafta içinde, seçilen floresan ikincil antikorlara uygun uyarma lazerleri ve filtre küpleri ile lazer taramalı konfokal mikroskop kullanılarak beyinleri görüntüler. Mantar gövdesi nöronlarının Z-yığını görüntüleri tipik olarak 20X veya 40X objektifler kullanılarak elde edilir. Retinal fotoreseptör nöronlarının görüntülenmesi daha yüksek büyütme gerektirebilir.

Şekil 1: İmmünofloresan görüntülemeye hazırlanırken beyinlerin montajı. (A) Beyinler, beynin düzleşmesini önlemek için bir köprü kapağı ile SuperFrost Plus kızaklarına monte edilmiştir. İki "taban" kapak fişi, şeffaf tırnak cilası ile Superfrost Plus pozitif yüklü bir slayta yapıştırılır ve daha sonra parçalara ayrılmış beyinler aralarındaki slayta yerleştirilir. Beynin üzerine şeffaf bir "köprü" kapak fişi yerleştirilir ve taban kapak fişlerine yapıştırılır. (B) Tırnak cilası kuruduktan sonra, ikincil antikorun floresansını korumak için Vectashield köprünün altına yavaşça pipetlenir. Şeffaf tırnak cilası daha sonra "köprü" kapak kaymasının üstünü ve altını kapatmak için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.