$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bu protokol, Zhang ve ark., Tek Hücre Düzeyinde Hücreler Arası Lümen Morfogenezi ve İn Vivo Polarize Membran Biyogenezi için Bir Model Olarak C. elegans Bağırsak: Antikor Boyama ile Etiketleme, RNAi Fonksiyon Kaybı Analizi ve Görüntüleme, J. Vis. Exp. (2017).
C. elegans bağırsağının antikor boyaması
- Fiksasyon
- Temiz bir cam slayt alın ve solucanların yapışması için ince bir film oluşturmak için poli-L-lizin kullanın. Slaytın üzerine 30 μL% 0.1-0.2 poli-L-lizin yerleştirin ve bir "sandviç" yapmak için poli-L-lizin damlasının üzerine ikinci bir slayt yerleştirin. Ardından, her ikisinin de tüm yüzeylerini ıslatmak için slaytları birkaç kez hafifçe ovalayın ve 30 dakika kurumaya bırakın. Slaytların buzlu tarafını kurşun kalemle etiketleyin.
NOT: 200 μL'lik %0.2 poli-L-lizin alikotları, tozun dH2O içinde çözülmesiyle yapılmıştır; bu -20 °C'de saklanabilir. Solucanların daha iyi yapışması için yüksek moleküler ağırlıklı poli-L-lizin kullanın. Poli-L-lizin konsantrasyonu da kritiktir. Çok düşük konsantrasyonlar solucanların yapışmasına izin vermez, ancak çok yüksek konsantrasyonlar floresan arka plan sinyali üretebilir. Çok kalın bir film tamamen gevşeyebilir.
- Sıvı nitrojenle doldurulmuş bir kabın (örn. polistiren bir kap) dibine düz bir metal blok sıkıca yerleştirin.
NOT: Bunun yerine kuru buz kullanılabilir, ancak sıvı nitrojen, kabın dibinde metal bir bloğu daha sabit tutar ve iyi soğur.
- Solucanları ya M9 ile plakalarından yıkayarak toplayın ya da her slayta farklı aşama solucanları (yumurta, L1, L2, L3 veya L4 larva aşaması solucanları) seçin. Tipik olarak, her slayta ~ 100 larva ve embriyo veya ~ 20 yetişkin seçin. 10 μL yıkanmış solucanları slaydın ortasına yerleştirin veya yumurtaları/solucanları 10 μL M9 veya 10 μL 1x PBS'ye (fosfat tamponlu tuzlu su) toplayın.
- Topaklanmayı önlemek için çok sayıda solucanı yaymak için bir pipet kullanın.
Not: Yıkanmış solucanların karışık popülasyonları, kalabalıklaşma ve farklı aşama kalınlıkları nedeniyle iyi yapışmaz ve daha az etkili bir şekilde donarak kırılır (aşağıya bakınız), bu nedenle aşamaya özgü solucanların (veya senkronize popülasyonların) toplanması üstün sonuçlar verir. Larvalar yetişkinlerden daha iyi yapışır ve slayt başına daha fazla hayvan yerleştirilebilir.
- Solucanları slaytlara toplamadan önce, bunları OP50 bakterisi içermeyen bir Nematod Büyüme Ortamı (NGM) plakasına aktarın. Solucanlara yapışan fazla bakteri de yapışmayı engelleyebilir. Solucanların kurumamasına dikkat edin.
- 22 mm × 22 mm'lik bir lameli çapraz olarak, kenarları sürgünün en az bir tarafında asılı kalacak şekilde toplanan solucanların üzerine nazikçe yerleştirin (bırakın). Lamel üzerinde bir veya iki parmağınızla düz bir şekilde nazikçe ama sıkıca bastırın. Doku bütünlüğüne zarar verecek kırkımlardan kaçının.
- Sürgüyü hemen ve nazikçe sıvı nitrojen içindeki metal bloğa aktarın ve donması için yaklaşık 5 dakika bekletin. Ardından, çıkıntılı kenarı kullanarak lamel tek bir hızlı hareketle "hafifçe vurun".
NOT: Bu adım kararlı bir şekilde ve kütikülün "çatlamasını" sağlamak için slayt donmuşken yapılmalıdır. Dikkat: Sıvı nitrojen ile çalışırken lütfen KKD (Kişisel Koruma Ekipmanı) yönergelerine uyun.
- Dondurularak çatlatılmış slaytları metanol dolu bir cam Coplin kavanozuna -20 °C'de 5 dakika daldırın. Daha sonra -20 °C'de 5 dakika daha aseton dolgulu bir cam Coplin kavanozuna aktarın.
NOT: Metanol ve aseton kullanılmadan önce -20 °C'de en az 30 dakika saklanmalıdır. Fiksasyondan sonra slaytlar -20 °C'de saklanabilir.
DİKKAT: metanol ve aseton toksiktir.
- Slaytları kavanozdan çıkarın ve kullanmadan önce oda sıcaklığında (RT) kurumaya bırakın.