Bu protokol Teoh ve ark., Caenorhabditis elegans'ta Hücresel Yapıları ve Organel Morfolojisini İncelemek için Kantitatif Yaklaşımlar, J. Vis. Exp. (2019).
Görüntüleme için slaytların hazırlanması
- Mikrodalgaya dayanıklı bir şişede (100 mL ultra saf suda 3-4 g) %3-4 w / v agaroz stoğu hazırlayın.
NOT: Agar, aynı konsantrasyonda agaroz yerine kullanılabilir.
- Agarozu bir mikrodalga fırında dikkatlice eritin, fazla kaynatmamaya dikkat edin, tüm agaroz eriyene kadar (berrak çözelti). Katılaşmayı önlemek için çözeltiyi 70 °C'de tutun.
NOT: Agaroz stoğu birkaç kez kullanılabilir. Agaroz katılaşmışsa kullanmadan önce tekrar ısıtın.
- Bir Pasteur pipeti kullanarak, bir mikroskop lamına bir damla eritilmiş agaroz yerleştirin.
NOT: Agar damlasında hava kabarcıkları oluşmasını önleyin çünkü bunlar pedin bütünlüğünü bozar.
- Agaroz damlacığını hemen başka bir mikroskop lamı ile aşağı doğru bastırın, agarozu iki slayt arasında bir ped şeklinde hafifçe düzleştirin.
NOT: Kalan baloncuklar bu aşamada çıkarılmalıdır. Aksi takdirde, hayvanlar baloncuklara kolayca sıkışıp kalabilecekleri için yeni slaytlar yapılmalıdır. Sürgüye basarken agarın yana taşmasını önleyin.
- Agarozu 1 dakika kurumaya bırakın.
- Agarozun zarar görmesini önlemek için iki sürgüyü dikkatlice ayırın ve katılaşmış pedi slaytlardan birinin üzerinde bırakın.
NOT: Agaroz pedli slaytlar, kuruyabilecekleri için deneyden hemen önce her zaman taze olarak hazırlanmalıdır. Agaroz pedinin tutarlı bir kalınlığa sahip olduğundan emin olun. Görüntülemeyi engelleyebileceğinden, pedde hava kabarcığı veya çatlak olmamalıdır.
- Agaroz pedinin ortasına küçük bir damla (5-10 μL)% 0.05 tetramizol hidroklorür (anestezik) ekleyin.
- Isıyla sterilize edilmiş kazma kullanarak, çözelti kurumadan önce yaklaşık 10 – 15 hayvanı stok plakasından anestezik damlacığa hızlı bir şekilde aktarın. Çok fazla OP50 bakteri aktarmaktan kaçının çünkü bu, çözeltiyi bulanık hale getirir ve bu da görüntülemeyi engelleyebilir.
NOT: Toplama sırasında anestezik solüsyon kurursa, hayvanlara ikinci bir damla% 0.05 tetramizol hidroklorür pipetleyin. Hayvanlar anestezik solüsyonda yanal taraflarına yatma eğilimindedir.
- Agaroz pedin hemen üzerine yerleştirerek ve yavaşça aşağı bırakarak bir lamel uygulayın. Bu, kabarcık oluşumunu önleyecektir. Hayvanları ezebileceği için lamel üzerine baskı uygulamayın.
- Slaytları gerinim adıyla etiketleyin.