$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bu protokol, Tauc ve ark., Yaşlanma Sırasında Kök Hücre Davranışını İncelemek için FACS ile Yetişkin Drosophila Midguts'tan Bağırsak Kök Hücrelerini İzole Etme, J. Vis. Exp. (2014).
NOT: Bu protokol, ISC'leri FAC sıralama ile izole etmek için ilk kez kullanılıyorsa, başlangıçta FACS parametrelerini düzgün bir şekilde ayarlamak için aşağıdaki kontroller zorunludur: Sytox içermeyen vahşi tip (örneğin w1118) Drosophila midguts'tan ayrışmış hücreler. Yabani tipten ayrışmış hücreler (örneğin, w1118) Sytox ile Drosophila midguts (bkz. Adım 3.6). Sytox olmadan esg-Gal4, UAS-GFP sinek hattının orta bağırsaklarından ayrışmış hücreler.
1. Bağırsak diseksiyonu için solüsyon ve yemeklerin hazırlanması
- Her biri esg-Gal4, UAS-GFP sinek hattından 40 dişi sinek içeren 4-6 şişe hazırlayın.
- 10x PBS stok çözeltisinden 500 ml 1x PBS hazırlayın (1.8 mM NaH2PO4·H2O, 8.4 mM Na2HPO4·2H2O, 175 mM NaCl, pH'ı 7.4'e ayarlayın).
- 1x PBS'de% 3.5'lik bir agaroz çözeltisi hazırlayın (100 ml 1x PBS'de 3.5 g elektroforez dereceli agaroz). Bu solüsyonu tabanı kaplayacak şekilde petri kaplarına (çap 8,5 cm) dökerek diseksiyon plakaları hazırlayın. Agaroz tabakası diseksiyon işlemi sırasında forseps uçlarının zarar görmesini engeller. Jel katılaştıktan sonra diseksiyon plakalarını 4 °C'de saklayın.
- Diseksiyondan önce 300 ml 1x PBS +% 1 BSA taze hazırlayın ve şişeyi buzun üzerine veya 4 ° C'ye yerleştirin.
- Santrifüjü açın ve 4 °C'ye soğumaya bırakın.
- Kenarları düzleştirmek için 2 cam Pasteur pipetinin uçlarını alevlendirin.
- İki çift forseps ve bir tıraş bıçağını %70 etanol ile temizleyin.
- Buz üzerinde disseke edilmiş orta bağırsakları toplamak için dört ila altı adet 1.5 ml'lik mikrosantrifüj tüpü yerleştirin.
2. Gastrointestinal sistemin hazırlanması ve orta bağırsağın diseksiyonu
- Standart bir sinek yatağında CO2 ile bir flakondan (40 sinek) sinekleri uyuşturun, bir tıraş bıçağı kullanarak tüm sinekleri ayırın ve diseksiyon kabına aktarın. Agaroz jeli kaplamak için soğuk 1x PBS/%1 BSA solüsyonunu diseksiyon kabına dökün. Sinekler yüzecek.
- Sinek karnını bir çift forseps ile tutun, göğüs kafesi diğer forseps çifti ile tutun. Göğüs kafesi karından ayırın. Bağırsak görünür olacak ve ön bağırsak/mahsul büyük olasılıkla hala toraksa bağlı olacaktır.
- Bağırsakları tutun ve göğüs kafesinden dışarı çekin. Bağırsakları açmak için mahsulü alın ve bağırsağı karından hafifçe öne doğru çekin.
- Bir çift forseps ile karnın arka ucunu ve diğer forseps çifti ile ön açık kütikülün kenarını tutun. Çıkıntılı bağırsak dokusunu tahrip etmemeye dikkat edin. Kütikülü kırmak için arka ucu çekin ve tüm bağırsak karın boşluğundan çekilene kadar çok nazikçe arkaya doğru çekmeye devam edin. Vücut boşluğuna sığamayacak kadar büyükse, mahsulün önceden çıkarılması gerekebilir.
- Ön bağırsağı, Malpighian tübüllerini, arka bağırsağı ve yumurtalıkları çıplak orta bağırsaktan çıkararak çıkarın.
- Bir cam Pasteur pipeti kullanarak, diseke edilmiş orta bağırsak grubunu soğuk 1x PBS /% 1 BSA çözeltisi içeren 1,5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüpü buz üzerinde tutun. Numuneler 2 saat içinde işlenmelidir.
- Tüm partinin diseksiyonu tamamlandıktan sonra, kalan kalıntıları yıkamak için diseksiyon kabını çift damıtılmış suyla durulayın. Bir sonraki orta bağırsak grubunu incelemeye başlayın (Adım 2.1–2.7'yi tekrarlayın). 2 saat içinde mümkün olduğu kadar çok partiyi inceleyin, ardından Adım 3.1'e geçin.
3. FAC Sıralaması için Hücreleri Toplamak İçin Bağırsak Dokusunun Sindirimi
- 1x PBS /% 1 BSA çözeltisini orta bağırsaklardan çıkarın ve her numuneye 500 μl% 0.5 Tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin.
- 20 saniye boyunca iyice vorteksleyin ve numuneleri oda sıcaklığında 25-30 dakika boyunca 20 rpm'de hafifçe sallayarak / döndürerek inkübe edin.
- Yaklaşık 30 dakika sonra tekrar girdap yapın ve sağlam orta bağırsak dokusunun tüpün dibine çökmesine izin verin. Alevli bir cam Pasteur pipeti ile süspansiyon halinde olan hücreleri dikkatlice çıkarın ve bunları 35 μm'lik bir naylon ağdan 1,5 ml'lik yeni bir mikrosantrifüj tüpüne süzün.
- Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 100 x g'da döndürün. Unutulmamalıdır ki, sindirime başlarken, bir hücre peleti ilk başta görünmeyebilir, ancak doku sindirimi ilerledikçe görünür hale gelecektir.
- Tripsin solüsyonunu, kalan sağlam orta bağırsak dokusunu içeren orijinal numune tüpüne dikkatlice geri aktarın. Peletten çok fazla hücre aktarmaktan kaçının.
- Hücre peletini 400 μl soğuk 1x PBS/%1 BSA'da nazikçe yeniden süspanse edin. Ayrışmış hücreleri içeren mikrosantrifüj tüplerini buz üzerinde tutun ve hücreleri ışıktan korumak için tüpleri alüminyum folyo ile örtün
.
- Kalan sağlam orta bağırsak dokusunu içeren Tripsin çözeltisini tekrar vorteksleyin ve numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika daha külbütöre yerleştirin.
- Orta bağırsak dokusunun tamamı sindirilene kadar 3.3 ila 3.4.3 arasındaki adımları tekrarlayın. Tüm mikrosantrifüj tüplerinden ayrışan hücreleri tek bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin. Bu, 3.4'teki gibi bir santrifüjleme aşaması gerektirebilir, çünkü tüm hücre süspansiyonlarının hacmi 1.5 ml'yi aşabilir. Hücre süspansiyonunu buz üzerinde tutun ve hücreleri ışıktan koruyun.
- Ayrışmış hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 100 x g'da döndürün. Mikrosantrifüj tüpünde yaklaşık 50-100 μl 1x PBS /% 1 BSA çözeltisi bırakarak süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu dikkatlice çıkarın. Ayrışmış hücreleri 800 μl 1x PBS /% 1 BSA içeren Sytox (1: 20.000) içinde nazikçe yeniden süspanse edin.
- Hücreleri bir hücre süzgeci geçmeli kapaktan (35 μm naylon ağ) süzerek hücre süspansiyonunu 5 ml'lik yuvarlak tabanlı bir Falcon tüpüne aktarın. Hücre örneklerini her zaman buz üzerinde tutun ve ışıktan koruyun. Hücreler artık sıralanmaya hazırdır.
- Hücrelerin sonraki RNA izolasyonu için sıralanacağı her bir mikrosantrifüj tüpüne 600 μl RNAlater solüsyonu pipetleyin. Diğer sonraki uygulamalar için hücreler farklı bir çözeltide, örneğin steril PBS'de toplanabilir.