$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Aşağıdaki protokol Cornwell ve ark. Çoğaltma Kümesi Yöntemi: Caenorhabditis elegans Ömrünü Kantitatif Olarak Ölçmek İçin Yüksek Verimli Bir Yaklaşım, J. Vis. Exp. (2018).
1. 5-Floro-2'-deoksiüridin (FUdR) ilavesiyle döl üretiminin önlenmesi
- Hayvanları 20 °C'de L4 aşamasına kadar büyütün. Tohumlamadan yaklaşık 40 saat sonra senkronize hayvanların L4'e gelişip gelişmediğini kontrol edin (adım 2.1.7).
NOT: C. elegans'ın gelişim süresi farklı sıcaklıklarda değişecektir ve oranları karakterize edilmemiş mutant hayvanların büyüme hızları ampirik olarak test edilmelidir.
- L4 hayvanları ile her 6 cm'lik plakaya 160 μL 50x FUdR ekleyin.
NOT: FUdR'yi L4 aşamasında eklemek çok önemlidir. Kolaylık sağlamak için, 1 g FUdR'yi 10 mL ultra saf H2O'ya çözerek 1.000x FUdR stoğu yapın. Stok FUdR'yi 0,2 μm filtre ve 10 cc şırınga ile filtreyle sterilize edin. Steril 1,5 mL'lik tüplere ~ 1 mL stok ekleyin. Dondurun ve -20 °C'de saklayın.
- Plakaları erkek C. elegans'ın varlığı açısından inceleyin. Tüm erkekleri çıkarın.
NOT: Yaşam süresi tipik olarak erkekler için değil hermafroditler için ölçülür. Çiftleşen hermafroditler, FUdR'nin varlığında bile çiftleşmemiş hayvanlardan daha kısa yaşarlar. Erkekler hermafroditlerden daha küçük ve daha incedir ve kendine özgü bir çengelli kuyruk ile kolayca tanımlanabilir.
- Kutuyu kilitli torbaya geri koyun. 20 °C inkübatöre geri dönün.
2. Puanlama uygulanabilirliği
- Platin tel veya kirpik ile hayvanın kafasına hafifçe dokunarak günlük olarak canlılık elde edin. Hareket edemeyen hayvanları ölü olarak puanlayın ve plakadan çıkarın (Şekil 1A). Her gözlem zaman noktası için her koşul için ölü olarak gözlemlenen sayıyı kaydedin.
NOT: Puanlama yanlılığı riskini azaltmak için, deneyci deneysel koşullara karşı kör kalmalı ve benzer şekilde puanlama sırasında önceki zaman noktalarından elde edilen sonuçlara atıfta bulunmamalıdır.
- Yırtılan, diğer belirgin gelişim kusurlarından ölen veya tabağın kenarında sürünen hayvanları sansürleyin: bu hayvanları çıkarın ve istatistiksel analizde dikkate alınmak üzere gözlemlenen her zaman noktasındaki sayıyı kaydedin. Ek olarak, erkekler bulunursa, onları çıkarın ve gözlemlenen sayıyı kaydedin.
- Hiçbir hayvan canlı kalmayana kadar her gün adım 2.1'den itibaren tekrarlayın.
NOT: E. coli'nin çimleri önemli ölçüde azalırsa veya plaka üzerinde mantar büyümeye başlarsa, kalan tüm hayvanları uygun RNAi ve FUdR ile yeni bir tabağa aktarın.
